Name: 新生小鼠原代耳蜗毛细胞的分离和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学习从新生小鼠分离和培养原代耳蜗毛细胞的方法，通过酶消化和免疫荧光染色技术确认细胞特性。该方案为听觉系统研究提供了可靠的实验基础，有助于深入理解毛细胞生物学功能。

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本工作由国家自然科学基金（NFSC 82101224，项目负责人：YG）资助。&#160;作者衷心感谢日本东京大学医学部耳鼻喉—头颈外科Teru Kamogashira博士（医学博士、哲学博士）在本研究中提供的关键性学术指导和概念性贡献。本研究的原始研究框架是在他的指导下建立的，他的深刻见解极大地影响了本工作的研究方向。我们对其持续的学术支持深表感谢。&#160;

所有动物实验均经西安交通大学动物使用与护理委员会批准（批准号：2021-847）。
1. 灭菌与材料准备
<ol>
	<li>使用高温高压蒸汽灭菌法对解剖工具进行灭菌，并在50 °C培养箱中过夜干燥。</li>
	<li>提前配制100 mL含10%胎牛血清（FBS）和10 mg/mL青霉素/链霉素的培养基（将10 mL FBS和10 µL青霉素储备液加入90 mL杜氏改良伊格尔培养基（EMEM）中），并于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 收集听觉上皮组织的颞骨解剖与摘除
<ol>
	<li>在冰上通过断头法处死总共10只新生小鼠（年龄介于P3至P5之间）。如有需要，可采用其他经伦理批准的方法。</li>
	<li>固定头部，沿矢状缝用显微手术剪刀切开头皮，并用手指将头皮向两侧分开并固定，如图1A所示。</li>
	<li>使用小型骨膜剥离器取出脑组织，并将颅底一分为二。用剪刀剪开颅骨并向前翻折以打开颅腔；用剪刀尖刮除脑组织，暴露颅底。</li>
	<li>观察颅底两侧的颞骨（图1C）。用剪刀沿颅底中线剪开，刮除皮肤，并去除多余骨组织（图1D、D'）。</li>
	<li>将分离出的颞骨保留并转移至含有新鲜Hank's平衡盐溶液（HBSS）的35 mm无菌培养皿中（图1E）。</li>
	<li>使用两把#5尖头镊子去除颞骨岩部的鼓室骨及周围组织（图1E）。 
	注意：在此阶段，小鼠颞骨内的骨迷路尚未完全钙化，可用镊子轻松解剖。</li>
	<li>一手持镊子固定颞骨的半规管部分，另一手将镊子下脚插入圆窗隐窝，以分离耳蜗的外侧骨壁与前庭阶。小心去除颞骨岩部组织，避免接触耳蜗柯蒂氏器（OC）上皮。随后，从基部至顶端小心分离并取出耳蜗的骨迷路（图1F）。</li>
	<li>使用#5尖头镊子小心地在显微镜下将柯蒂氏器感觉上皮从蜗轴上分离（图1G）。</li>
	<li>夹住螺旋韧带，用显微手术镊子小心将其与血管纹分离，并使用200 µL移液器将洁净的听觉上皮转移至含有HBSS的3 mm无菌培养皿中（图1H）。</li>
	<li>从每只动物收集20个样本，并迅速转移至含有HBSS的100 mm无菌培养皿中，用于下一步制备（图1）。</li>
</ol>
3. 酶解法解离以获取听觉毛细胞
<ol>
	<li>将听觉上皮组织转移至含有0.25%胰蛋白酶的10 mL新鲜DMEM中，于37 °C孵育12分钟。</li>
	<li>在手术显微镜下，使用200 µL移液枪头轻轻将毛细胞从基底膜及其他细胞中分离。</li>
	<li>加入另外10 mL培养基以终止消化反应。</li>
	<li>将培养基中的悬浮细胞通过70 µm滤网过滤，收集滤液至洁净的50 mL离心管中，并在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>用1,000 µL移液枪头轻柔吹打，将毛细胞重悬于至少5 mL培养基中，避免产生气泡。</li>
	<li>预先将盖玻片放置于六孔板底部。计数细胞后，以106个细胞/mL的密度接种于六孔板中进行培养。</li>
	<li>将贴壁细胞置于含10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的2 mL DMEM中，在37 °C、5% CO2条件下培养，每天更换培养基。 
	&#8203;注意：需要说明的是，采用本方案无法获得纯化的毛细胞。基于该原代细胞培养方法，我们建议使用培养第2天（d2）或第3天（d3）的细胞进行后续实验，此时培养物中毛细胞比例约为70%，且状态良好。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>从第1天到第6天（每天一孔）收集培养的细胞。吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞2次。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在室温（RT）下固定细胞15分钟。</li>
	<li>移除固定液，并用PBS冲洗细胞3次，每次3分钟。</li>
	<li>用含0.2% Triton X-100的PBS在室温下处理细胞10分钟以进行通透。</li>
	<li>将通透后的细胞与封闭液（含10%胎牛血清的PBS）在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>用抗肌球蛋白单克隆抗体（以PBS按1:200稀释）在4 °C下避光孵育细胞过夜。</li>
	<li>用无菌PBS洗涤细胞3次，然后加入二抗（Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG MYO7A，以PBS按1:500稀释）和荧光素标记的鬼笔环肽（Alexa Fluor 488，用于识别细胞结构），在室温下避光孵育2小时。</li>
	<li>用PBS冲洗细胞3次，以去除未结合的二抗。</li>
	<li>在载玻片上滴加1-2滴含DAPI的封片剂，盖上盖玻片，置于激光扫描共聚焦显微镜下拍摄细胞图像。</li>
</ol>
5. 统计学分析
<ol>
	<li>采用双因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验，以分析肌球蛋白-VIIa 和鬼笔环肽的灰度值随时间的变化。使用字母标记法标注统计学差异。</li>
	<li>进行额外的单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验，比较第1天至第6天细胞样本中鬼笔环肽阳性细胞比例以及同期肌球蛋白-VII阳性细胞比例。</li>
</ol>

Efficient In Vitro Cultivation of Mouse Cochlear Hair Cells

<ol><li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).</li>
<li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+hair+cells%3A+The+sound-sensing+machines%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li>
<li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li>
<li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li>
<li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-Induced+Hearing+Loss%3A+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385(2021).</li>
<li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665(2022).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170(2019).</li>
<li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li>
<li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342(2020).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).</li>
<li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+auditory+HEI-OC1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046(2017).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li>
<li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3%2C+VGLUT3%2C+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li>
<li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119(2022).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与HEI-OC1细胞系相比，毛细胞的原代培养能更准确地模拟体内细胞的生理状态。因此，通过从耳蜗器官中分离活细胞并立即进行培养所建立的听觉系统原代培养方法，似乎是开展听觉系统广泛研究的一项重要工具。某些技术环节对于成功培养至关重要。首先，尽量缩短耳蜗器官从颞骨中分离出来的时间，有助于提高毛细胞持续存活的几率。因此，研究人员必须尽可能缩短解剖操作与将组织浸入PBS之间的时间间隔。根据我们的实验观察，解剖10只小鼠并同时获取20个内耳组织，大约需要2-3小时即可完成。在酶消化解离过程中，建议将总时间控制在12分钟以内，并在孵育8分钟后将耳蜗组织转移至移液器中。经过约10次吹打后，在显微镜下观察组织状态，当几乎所有细胞均已从基底膜上脱离时，即停止酶解过程；否则，需将组织放回培养箱继续孵育4分钟。抗生素的选择也十分重要。我们推荐使用10 mg/mL青霉素/链霉素，以预防潜在的污染问题，因为某些氨基糖苷类抗生素具有耳毒性，可能导致毛细胞死亡。
尽管VII类肌球蛋白在动物组织中广泛表达，但肌球蛋白-VIIa仅在内耳前庭和耳蜗器官的毛细胞中表达。VIIa类肌球蛋白在维持静纤毛结构方面发挥重要作用，...

耳蜗毛细胞在声音检测和向听觉神经传递信号方面发挥着重要作用。毛细胞是一种机械感受细胞，在脊椎动物中作为主要的感觉受体，将声波振动转化为电信号。哺乳动物内耳的听觉上皮由一排内毛细胞和三排外毛细胞组成。在基底膜的不同区域，毛细胞可感知不同频率的声音（20 至 2,000 Hz）1。外毛细胞的功能是一种主动的机械放大过程，有助于精细调节哺乳动物内耳，从而赋予其对声音的高度敏感性。内毛细胞则负责声音的检测。经过分级去极化后，声学信息通过听觉神经纤维传递至大脑2。
听力损失可能由遗传缺陷、衰老、噪声创伤或耳毒性药物的过度使用引起，这在全球范围内构成重大的健康问题3,4。听力损失主要源于毛细胞不可逆的损伤5。关于噪声性听力损失，尽管研究人员在其病因的多个细节上已达成共识，但对其众多潜在机制的全面理解仍显不足。外毛细胞尤其容易受到声音过度暴露的损害6。机械敏感性耳蜗毛细胞参与了年龄相关性听力损失的过程；然而，导致毛细胞退变的分子与细胞机制仍不清楚。多种分子过程的变化可导致毛细胞老化、氧化应激、DNA损伤反应、自噬以及与毛细胞特化相关的基因表达和转录调控失常7。
由于内耳被包裹在颞骨内，深藏于人体最坚硬的骨骼之中，因此在实验上难以触及，这为研究毛细胞修复与再生机制带来了挑战。因此，建立 体外 用于研究毛细胞功能的培养方法已成为探究内耳再生与损伤机制的理想手段。耳蜗类器官培养的制备步骤已在早期研究中有所描述。8,9,10世界各地的研究人员已采用多种耳蜗显微解剖及表面制备技术。尽管仍存在持续挑战，但目前已成功建立多种原代毛细胞体外培养体系。耳蜗器官培养物包含多种细胞类型，如毛细胞、Deiters细胞、Hensen细胞、柱细胞以及听觉神经纤维。深入理解损伤后毛细胞在细胞和分子水平上的变化，将有助于开发更强大的研究工具。本研究旨在展示从新生小鼠分离耳蜗器官并利用酶法解离大量毛细胞以用于体外研究的具体步骤。通过免疫荧光染色对培养细胞的性质进行了鉴定。

<table><tbody><tr><td>100 mm BioLite 细胞培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>35 mm Nunc 细胞培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150318</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>310109005</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>BD Company</td><td>352350</td><td>用于过滤</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>出生后第 3–5 天的小鼠&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由西安交通大学提供</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>5#</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>Leica 解剖显微镜</td><td>德国</td><td>S9i</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>用于培养</td></tr><tr><td>兔多克隆 Myosin VIIa 抗体</td><td>Abcam company</td><td>ab92996</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Belevor</td><td>10 cm/04.0524.10</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>9036-19-5</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td>用于培养</td></tr></tbody></table>

新生小鼠耳蜗毛细胞的分离与原代培养

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

耳蜗毛细胞是听觉系统的感受器。这些细胞位于内耳骨迷路中的柯蒂氏器（Corti 器）内，柯蒂氏器是负责听觉的感官器官。耳蜗毛细胞在结构和功能上分为两种不同类型：外毛细胞和内毛细胞。任一类细胞受损均会导致听力损失。值得注意的是，内毛细胞无法再生，因此其损伤是永久性的。 体外 原代毛细胞的培养对于研究耳蜗毛细胞的保护或再生作用至关重要。本研究旨在探索一种分离和培养小鼠毛细胞的方法。 
在手动去除耳蜗侧壁后，于显微镜下仔细将听觉上皮从耳蜗蜗轴分离，用含0.25%胰蛋白酶-EDTA的溶液在37 °C孵育10分钟，随后使用200 µL移液器枪头轻柔地悬浮于培养基中。细胞悬液经细胞滤器过滤，滤液离心后，将细胞接种于24孔板中进行培养。毛细胞的鉴定依据包括其表达机械转导复合物——参与产生运动张力的肌球蛋白-VIIa的能力，以及利用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行特异性标记。培养4天后，细胞融合度达到&gt;90%。该方法有助于加深对体外培养毛细胞生物学特性的理解，验证耳蜗毛细胞培养的有效性，为后续听觉研究建立坚实的实验方法基础。

按照本方案，我们接种了分离的细胞。若细胞在培养基中不漂浮，并在24小时内贴壁并铺展，则认为原代耳蜗毛细胞接种成功。我们在细胞贴附并铺展成扁平聚集体后，计数毛细胞数量。培养1天后，活的毛细胞已牢固贴附于培养皿底部，未贴壁的细胞通过PBS冲洗去除。通常情况下，培养3天后细胞数量增加一倍（图2）。
免疫荧光（IF）检测显示，肌球蛋白-VIIa 和鬼笔环肽的表达持续至第6天（图3A）。我们观察到，肌球蛋白-VIIa 的灰度值和阳性细胞比例随时间逐渐下降，而鬼笔环肽的灰度值和阳性细胞比例在培养后与第1天相比保持不变（图3B-D）。我们采用器官培养作为阳性对照，以验证肌球蛋白-VIIa 阳性细胞确为毛细胞。补充图S1 展示了培养2天后听觉上皮中肌球蛋白-VIIa（绿色）、鬼笔环肽（绿色）和4′6-二脒基-2-苯基吲哚...

本文介绍了一种从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。首先，在显微镜下从新生小鼠（3-5日龄）耳蜗中分离出柯蒂氏器。随后，通过酶消化法将组织解离为单细胞悬液，并在培养数天后通过免疫荧光鉴定细胞。

耳蜗毛细胞是听觉系统的感受器。这些细胞位于柯蒂氏器中，柯蒂氏器是负责...的听觉感受器官。

内耳被包裹在颞骨中，位于人体最坚硬的骨骼深处。由于研究难度较大，原代毛细胞的培养对于耳蜗毛细胞的研究至关重要。本研究旨在探索一种分离和培养小鼠毛细胞的方法。我们展示了从新生小鼠耳蜗器官中分离组织并利用酶法解离出大量毛细胞以进行单细胞研究的步骤。通过免疫荧光染色确认了培养细胞的特性。通过分离耳蜗器官中的活细胞并立即进行培养所建立的听觉系统原代培养方法，成为听觉系统广泛研究中的有力工具。该方法可加深我们对体内培养毛细胞生物学特性的理解，并验证耳蜗毛细胞培养的效率，为后续听觉研究建立坚实的方法学基础。首先，固定安乐死后的新生小鼠头部。使用显微手术剪沿矢状缝切开头皮。然后用手指将头皮双侧分离并固定。使用剪刀切开颅骨，并将其向前翻转以暴露颅腔。用小型骨膜剥离器取出脑组织，再用剪刀尖轻轻刮除残留的脑组织，以暴露颅底。现在检查颅底的双侧颞骨。使用剪刀沿颅骨基底部正中线进行切开。然后刮除皮肤并去除所有不必要的骨组织。将颞骨保存并转移至盛有新鲜HBSS的35毫米无菌培养皿中。接着，使用一对5号尖头镊子去除颞骨岩部的耳石及周围组织。用一只手握住镊子以固定颞骨的半圆形部分。用另一只手将镊子的下端尖部插入圆窗隐窝，该隐窝位于耳蜗的侧骨与前庭阶之间。小心去除颞骨的岩部，避免接触柯蒂氏器上皮。然后从耳蜗的基部向顶部方向，仔细分离并取出耳蜗的骨迷路。使用五点镊子，小心地将耳蜗柯蒂氏器的感覺上皮從骨螺旋板處顯微分離。接著，使用顯微手術鑷子夾住螺旋韌帶，並輕柔地將其與血管紋分離。使用200微升移液器將純淨的聽覺上皮轉移至含有HBSS的三毫米無菌培養皿中。将分离的听觉上皮组织置于盛有 HBSS 的 100 毫米无菌培养皿中，用于后续制备步骤。首先，从新生小鼠的颞骨中分离听觉上皮组织，并将其转移至含有 0.25% 胰蛋白酶的 10 毫升新鲜 DMEM 培养基中。在 37°C 条件下孵育 12 分钟。使用200微升移液器吸头，在体视显微镜下轻轻将毛细胞从基底膜及其他细胞中分离。然后加入10毫升培养基以抑制细胞解离。将悬浮细胞通过70微米滤网过滤。将滤液收集到一个洁净的50毫升离心管中，在300 G条件下离心5分钟。使用1000微升移液枪头，通过轻柔吹打，将毛细胞重悬于5毫升培养基中。现在，提前将盖玻片放置于六孔板的底部。计数细胞，并以每毫升10的6次方个细胞的密度在6孔板中进行培养。将贴壁细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下，用2毫升DMEM培养基培养。培养1天后，毛细胞已牢固贴附于培养皿底部。到第三天，细胞数量已翻倍。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

新生小鼠原代耳蜗毛细胞的分离和培养

本实验方案描述了一种分离和培养小鼠耳蜗柯蒂器官（可选择性保留或去除螺旋缘和螺旋神经节神经元）的方法。我们还展示了通过电穿孔技术在柯蒂器官外植体中表达外源报告基因的方法。...

小鼠耳蜗柯蒂氏器的原代培养与质粒电穿孔转染

流式细胞术是一种强大的工具，可用于分离和研究特定的细胞群体。本方案描述了从新生转基因小鼠耳蜗组织中分离表达LacZ的细胞的步骤。在通过流式细胞术进行分离之前，将解离的耳蜗细胞使用荧光标记的β-半乳糖苷酶底物进行标记。...

使用流式细胞术从鼠内耳组织中分离表达LacZ的细胞

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。...

纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。...

成年小鼠耳蜗的全组织解剖与免疫荧光染色

本实验方案旨在演示新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色。该技术可作为 体外...

新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种 体外 听力研究中的筛查工具

本研究介绍了一种从野生型新生小鼠中分离神经元的技术。该方法需要从新生小鼠中仔细解剖出脊髓，随后通过机械和酶解消化的方式将神经元从脊髓组织中分离出来。...

新生小鼠脊髓神经元的分离与培养

表皮角质形成细胞构成功能性皮肤屏障，在抵御外界环境侵害的宿主防御中处于前沿位置。本文介绍了从小鼠新生及成年皮肤中分离表皮角质形成细胞并进行原代培养的方法，以及诱导角质形成细胞终末分化和紫外线B诱导的炎症反应的实验方案。...

从新生及成年小鼠皮肤中分离和培养原代小鼠角质形成细胞

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10...

成年小鼠耳蜗表面制备

本方案更新了以往的实验方法，纳入了相对简便的高质 Cochlear...

新生小鼠耳蜗全组织外植体作为 体外 模型

在此，我们介绍一种从小鼠血管纹中分离、纯化和培养原代边缘细胞以及建立 体外...

从新生小鼠血管纹中分离和培养原代边缘细胞

学习从新生小鼠分离和培养原代耳蜗毛细胞的方法，通过酶消化和免疫荧光染色技术确认细胞特性。该方案为听觉系统研究提供了可靠的实验基础，有助于深入理解毛细胞生物学功能。

新生小鼠耳蜗毛细胞的分离与原代培养

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