Name: 基于定量聚合酶链反应（qPCR）的幽 门螺杆菌 感染和抗生素耐药快速诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习使用定量聚合酶链反应（qPCR）结合吞线试验快速诊断幽门螺杆菌感染及其对克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性，实现个性化精准医疗。

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本工作得到了深圳市医疗卫生“三名”工程项目（资助号：SZSM201510050）、广东省基础与应用基础研究基金（资助号：2022A1515220023）、广东省人民医院高层次人才科研基金（编号：KJ012021097）以及国家自然科学基金（81871734、82072380、82272423）的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理准则进行（批准编号：KY-Q-2022-384-02）。纳入患者的年龄范围为18至60岁。排除正在使用抗生素、抗菌类中草药、质子泵抑制剂（PPI）或其他类似药物的患者。2 在测试前2周内使用过受体拮抗剂等药物的患者未被纳入本研究。曾接受过针对治疗的患者 H. pylori 在过去3个月内也排除在此项研究之外。患有严重心脏、肝脏、肾脏疾病、严重神经病变或精神疾病者也不允许参与本研究。本研究未纳入孕妇及哺乳期妇女。本研究中使用的所有耗材（试剂、化学品、设备和软件）详情见下文 材料表.
1. 胃液采样的弦线试验
<ol>
	<li>要求患者在样本采集前过夜禁食。</li>
	<li>第二天，打开绳索检测套件，取出胶囊，握住绳索末端的环状部分。</li>
	<li>将绳索粘贴在患者的面颊上，并让其将胶囊置于舌根靠近咽喉处，随少量水吞服。</li>
	<li>使胶囊在患者胃中溶解，从而使胶囊内的绳索暴露，以吸收胃黏液。</li>
	<li>在患者吞服胶囊1小时后，安排经过培训的助手小心地将绳索拉出。</li>
	<li>剪下浸有胃液的绳索下端（40 cm），放入TSE（Tris/生理盐水/EDTA）样本保存液中，随后于室温（RT）送至临床实验室，用于后续通过qPCR检测H. pylori及测定抗生素耐药谱型。</li>
</ol>
2. DNA 提取
<ol>
	<li>将装有标本的收集管放置在试管架上，并做好正确标记，涡旋震荡10秒。</li>
	<li>将32孔板（核酸提取或纯化试剂盒）倒置翻转数次，以重悬磁珠。短暂涡旋震荡10秒后，小心移去板上的铝箔封膜。</li>
	<li>从每个样本中转移200 µL胃液，并将H. pylori DNA作为阳性对照分别加入不同的孔中。</li>
	<li>将32孔板放入核酸提取仪相应的样品槽中，进行自动化的DNA提取。</li>
	<li>DNA提取完成并确认后，对阳性样本通过qPCR启动克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性检测。</li>
	<li>将剩余的胃液和提取的DNA样本置于−20 °C下长期保存，以备后续使用。</li>
	<li>所有步骤均应在生物安全柜中操作，以避免任何污染。</li>
</ol>
3. 用于检测幽门螺杆菌（H. pylori）及其对抗生素（克拉霉素和左氧氟沙星）耐药性的qPCR
<ol>
	<li>进行qPCR以检测H. pylori及其基因组中疑似抗生素耐药突变。
	<ol>
		<li>将qPCR反应混合液（H. pylori核酸检测试剂盒）置于冰上解冻，并通过轻弹和离心混匀，防止试剂损失。</li>
		<li>在32孔板上对每个样本，加入20 µL PCR反应混合液（基因分型预混液[包含Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液和氯化镁]，以及ureA上下游引物和ureA探针）和5 µL提取的DNA，充分混匀。</li>
		<li>将32孔qPCR板放入qPCR仪中运行。设置热循环程序：反应混合物首先在42 °C和95 °C各反应2分钟（均为1个循环）；随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒，以及58 °C退火和延伸45秒。</li>
		<li>将荧光信号采集设置为FAM（H. pylori），数据采集设置为扩增延伸阶段。反应结束后，保存数据以供后续结果分析。</li>
		<li>使用qPCR专用软件分析数据，仪器将自动设定基线阈值。</li>
		<li>若H. pylori检测结果为阳性，仪器将自动启动对该样本的耐药性检测。更换试剂盒为H. pylori（qPCR）试剂盒中的23S rRNA基因和gyrA基因突变检测试剂。 
		注：Helicobacter pylori（qPCR）23S rRNA基因和gyrA基因突变检测试剂盒包含PCR反应混合液（基因分型预混液[含Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液、氯化镁]、引物和探针）。所有阴性质控品均为无菌纯化水。H. pylori核酸检测试剂盒中的阳性对照为灭活的H. pylori标准微球（ATCC 43504）。该试剂盒（H. pylori 23S rRNA基因和gyrA基因突变检测试剂）中的强阳性和弱阳性质控品为含有目标基因及突变基因的灭活H. pylori菌株DNA。同样，根据实际情况，所有诊断标准（包括H. pylori感染或耐药性的判定）均设定为CT值≤35，并呈现典型的S型扩增曲线。弱阳性质控品浓度为1.0 × 103 拷贝/mL，强阳性质控品浓度为1.0 × 108 拷贝/mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

qPCR-Based Rapid, Noninvasive Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

<ol><li>Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%3A+Phenotypes%2C+genotypes+and+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes.</a> Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).</li>
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</ol>

H. pylori 的检测可通过侵入性和非侵入性方法进行13。常用的侵入性技术包括组织病理学检查、快速尿素酶试验、聚合酶链式反应（PCR）和细菌培养，这些方法均需要通过内镜检查并取活检组织。在非侵入性方法中，推荐使用血清学检测、尿素呼气试验以及酶联免疫吸附试验（ELISA）14。尽管非侵入性方法操作简便、经济且患者耐受性更好，但若需进行菌株鉴定和抗生素敏感性试验等进一步分析，则必须通过侵入性方法获取 H. pylori 并进行分离与培养。随着当前抗生素耐药性的不断上升，以往常用的抗生素正逐渐失效，无法有效治疗由耐药 H. pylori 分离株引起的感染。在此情况下，有必要获取 H. pylori 分离株以开展抗生素敏感性测试，从而选择最有可能成功清除耐药菌的抗生素。 
常规的基于培养的药敏试验（如琼脂稀释法和Epsilometer试验，即E试验）存在多种局限性：由于H. pylori为生长缓慢的细菌，这类方法耗时较长，且成本高、依赖操作技能，并需要侵入性取样。相比之下，可采用多种基于分子的技术，如荧光原位杂交（FISH）技术和实时定量PCR（qPCR），用于检测多个耐药相关突变位点，例如编码对克拉霉素耐药性的23S rRNA基因突变15,16。本研究选取了H. pylori 23S rRNA耐药基因的三个点突变位点（A2142G、A2143G、A2142C）以及喹诺酮类抗生素gyrA耐药基因的六个点突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G），用于设计引物和探针，以分别检测对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性。
源自ENTEO-TEST的绳索试验采用一粒附有高吸水性尼龙绳的胶囊，受试者吞服后用于收集胃部分泌物17目前，绳索试验已用于结核病的诊断18，以区分高毒力 肺炎克雷伯菌 （hvKp）来自传统 肺炎克雷伯菌19，用于鉴定革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌，并进行诊断 H. pylori 来自胃液20在本研究中，我们将弦线试验这一微创技术与qPCR相结合，用于鉴定 H. Pylori 临床环境中的感染，并通过靶向既往报道的耐药编码突变进行药敏试验 H. pylori 基因组。我们选择了 ureA 基因，因为它是独特的持家基因 H. pylori 且与其他生物无交叉反应的潜在风险。所有 H. pylori 分离物必须具有 ureA 基因以在人类胃中存活，且敲除实验表明 H. pylori 没有 ureA 该基因不具备在胃部定植的能力。
对于qPCR，质量控制标准极为重要。H. pylori的qPCR检测中，质量控制标准的要求如下：阴性对照（FAM检测通道无荧光信号升高，无典型的S型扩增曲线，CT值&#62; 35.00或无明显信号）；阳性对照（FAM检测通道的荧光信号增长曲线呈S型，CT值 ≤ 35.00），上述两项要求必须同时满足，否则视为检测无效，需重新进行实验。此外，针对H. pylori对克拉霉素和左氧氟沙星抗生素耐药性的qPCR检测，除用于区分阳性和阴性结果的CT值由35.00调整为30.00外，其余要求与上述相同。值得注意的是，本文未提供引物和探针的序列信息，因其涉及商业产权。
为了为每位患者选择更有效的抗生素，调查中国台湾地区H. pylori的局部流行情况及其对抗生素的耐药性谱型至关重要，这不仅因为全球范围内抗菌药物耐药性日益增加，也因为不同地理区域之间的耐药模式存在差异。本研究的主要局限性在于样本量较小，且未覆盖中国台湾的不同地理区域，因此无法全面展示H. pylori感染的流行情况及其完整的抗生素耐药谱型。但弦试验技术已较为成熟，通过与qPCR技术结合，我们实现了对H. pylori感染及其耐药性的同步诊断。这些结果表明，该方法有望在全球不同地区更大规模地推广应用。

H. pylori 是一种螺旋形、高度运动性的革兰氏阴性菌，主要生活在胃的幽门区域1。它&#160;是一种常见病原体，全球约有50%的人口感染2。大多数H. pylori感染者无临床症状，但感染数年后，部分人会发展为不同疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃溃疡和胃癌3。在基于不同人群的多项研究中，根除H. pylori在预防胃癌及癌前病变方面的有效性已得到证实4,5。因此，世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将H. pylori根除作为一项预防措施6。
对于大多数无症状消化不良患者而言，采用非侵入性方法检测 H. pylori 感染是治疗过程中的关键环节。尿素呼气试验（UBT）、H. pylori 粪便抗原检测（SAT）以及血清学检测是目前常用的非侵入性技术。其中，UBT 是现有方法中侵入性最小且准确性最高的检测手段。UBT 利用 H. pylori 中大量存在的脲酶，将同位素标记的尿素水解为氨和二氧化碳（¹³C 或 ¹⁴C）。相比之下，免疫层析法（ICA）7 具有采样简便、操作简单和非侵入性的优点。然而，该检测的准确性受多种因素影响，如粪便样本质量、储存温度以及样本采集与检测之间的时间间隔。另一种基于免疫反应的检测方法是血清 H. pylori 抗体检测，可检测患者血清中的特异性抗体。但该方法不适用于治疗后的疗效评估，因为抗体在细菌被清除后仍可长期存在8。另一主要局限在于，这些方法仅能诊断 H. pylori 感染，无法进行药物耐药性检测，因而不能指导基于敏感性的个体化治疗。
对于侵入性检测方法，需通过内镜采集胃黏膜活检组织，随后进行组织学检查、尿素酶快速试验和细菌培养。由于多种因素，这些检测方法的应用也极为有限。目前，这些技术仅限用于老年患者、癌前病变或恶性疾病高风险患者，以及对胃食管反流病或H. pylori感染的一线治疗失败的患者9。其次，由于H. pylori具有独特的生长特性，细菌培养的成功率仅为50%10。因此，分子检测方法为克服侵入性检测的高要求并指导基于敏感性的治疗提供了新的希望。在分子检测方法中，定量PCR近年来取得了巨大进展。与传统PCR不同，qPCR在退火阶段加入引物和探针，无需进行凝胶电泳，即可准确量化样本中的DNA/RNA。目前已有用于检测H. pylori感染及耐药性的qPCR试剂盒上市。然而，每种方法均有其局限性，因此患者的临床诊断与治疗应结合其症状、体征、病史、其他实验室检查结果以及对治疗的反应综合考虑。
目前，治疗H. pylori感染的主要方法是使用抗生素，但近年来，由于抗生素耐药性增加，这些感染的治疗变得越来越困难。因此，全球范围内已观察到H. pylori治疗效果显著下降，使得根除H. pylori成为一项重要的公共卫生问题11。
克拉霉素和左氧氟沙星是两种用于治疗由H.pylori引起的感染的广谱抗生素，&#160;但已有多个研究报道，在H.pylori分离株中对这两种药物普遍存在耐药性。A2143G、A2142G和A2142C是23S rRNA基因（长度为2.9 kb）中众多点突变中的三种，这些突变通过阻止大环内酯类药物的结合而导致克拉霉素耐药。与此同时，左氧氟沙星耐药基因的突变位点主要位于gyrA基因的六个突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）12。基于基因突变发现的这些耐药机制，已促使H. pylori检测方法逐渐从基于培养的研究转向分子检测。
总体而言，临床上迫切需要一种无创、有效且能够同时检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染及其耐药性的诊断方法。我们采用联合串线试验与定量PCR（qPCR）的方法，克服了取样困难的问题，实现了利用不同引物探针同时检测H. pylori感染和耐药性的目标。

<table><tbody><tr><td>23S rRNA 和 gyrA 基因点突变检测试剂盒（荧光探针 PCR 法）</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>检测幽门螺杆菌对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性</td></tr><tr><td>ABI 7500 荧光定量 PCR 仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SEDA 20163220767</td><td>荧光定量 PCR 扩增</td></tr><tr><td>ABI 7500 软件</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>BSC-1500IIA2-X</td><td>BIOBASE</td><td>SEDA 20143222263</td><td>生物安全柜</td></tr><tr><td>DNA 提取试剂盒</td><td>Daan Gene&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-Centrifuge</td><td>WEALTEC</td><td></td><td>离心去除管壁残留液体</td></tr><tr><td>幽门螺杆菌 DNA 检测试剂盒（荧光探针 PCR 法）&amp;nbsp;</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>检测幽门螺杆菌感染</td></tr><tr><td>Stream SP96 自动核酸提取仪</td><td>Daan Gene</td><td>SEDA 20140104</td><td>用于 DNA 提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吞线试验试剂盒</td><td>Hongmed Infagen</td><td></td><td>包含附有细线的胶囊、剪刀、棉签和样本保存管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超低温冰箱&amp;nbsp;(DW-YL450)&amp;nbsp;</td><td>MELING</td><td>SEDA 20172220091</td><td>-20 &amp;deg;C 用于试剂储存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex-5</td><td>Kylin-bell</td><td></td><td>用于试剂混匀&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

基于定量聚合酶链式反应（qpcr）的快速诊断 幽门螺杆菌 感染与抗生素耐药性

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-Based Rapid Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

幽门螺杆菌 是一种重要的人类病原体，可导致&#160;感染了全球约一半的人口，由于其抗生素耐药性日益增强，正成为严重的健康威胁。它是慢性活动性胃炎、消化性溃疡病和胃癌的致病因子，已被国际癌症研究机构（IARC）归类为I类致癌物。因此，快速而准确地诊断 H. pylori 及其抗生素耐药性的测定对于有效根除这种细菌病原体至关重要。目前， H. pylori 诊断方法主要包括尿素呼气试验（UBT）、抗原检测、血清抗体检测、胃镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。其中，前三种检测方法为非侵入性，操作简便。然而，这些技术无法获取细菌，因此不能进行药物敏感性检测。后三种属于侵入性检查，但成本较高，需要较高的操作技术，且可能对患者造成一定损伤。因此，亟需一种非侵入性、快速且可同时实现 H. pylori 检测与耐药性测试对于有效根除至关重要 H. pylori 在临床实践中。本方案旨在介绍一种结合弦试验与定量聚合酶链式反应（qPCR）快速检测 H. pylori 感染与抗生素耐药性。与细菌培养不同，该方法可实现便捷、快速、无创的诊断 H. pylori 感染状态和耐药性。具体而言，我们采用qPCR检测 rea 用于 H. pylori 感染及23S rRNA中的突变 gyrA 基因，分别编码对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性。与常规使用的培养技术相比，本方案提供了一种无创、低成本且节省时间的检测方法 H. pylori 感染并利用qPCR测定其抗生素耐药性。

通过qPCR检测胃液中的H. pylori感染及抗生素耐药性 
我们通过扩增ureA基因进行qPCR以检测H. pylori感染，并通过靶向23S rRNA基因和gyrA基因中的点突变来确定其抗生素耐药谱（表1）。qPCR实验中所有三组的质量控制CT值均处于推荐范围内，表明样本在实验时状态正常，检测结果可靠。本研究选取了五份检测结果不同的样本（S1-S5），用于评估实验方案的可靠性。S1代表未感染H. pylori的典型样本，而S2-S5样本则为感染了具有不同耐药结果的H. pylori的样本（图1）。我们设定系统不对未感染H. pylori的样本进行进一步耐药性检测，因此当系统检测显示S1样本H. pylori结果为阴性后，不再进入耐药性测试环节。对于H. pylori感染阳性的样本，S2的CT值均在检测范围内，表明该样本H. pylori阳性，且对克拉霉素和左氧氟沙星呈双重耐药，建议临床医生酌情选择其他治疗方案。S3样本的H. pylori感染检测和左氧氟沙星耐药检测CT值均在检测范围内，但克拉霉素耐药检测未检出CT值，提示该样本来自对左氧氟沙星耐药的患者。类似地，S4样本的H. pylori感染和克拉霉素耐药检测CT值在检测范围内，而左氧氟沙星耐药检测未检出CT值，表明该患者对克拉霉素耐药，建议使用左氧氟沙星进行治疗。最后，S5样本仅在H. pylori感染检测中检出CT值且处于检测范围内，表明该患者对两种抗生素均敏感，可任选其中一种药物进行治疗。与同样用于检测H. pylori感染及药物耐药性的细菌培养法相比，该方法在不损伤患者的情况下安全有效地检测H. pylori感染及耐药性，可用于指导医生制定合适的治疗方案。
<img alt="细菌生长曲线图：幽门螺杆菌、克拉霉素、左氧氟沙星耐药性检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65689/65689fig01.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图1"> 
图1：通过qPCR检测胃液中的H. pylori及其抗生素耐药性。 
（A）H. pylori感染的定量PCR扩增，（B）克拉霉素耐药性的检测，以及（C）左氧氟沙星耐药性的检测。“S”代表样本。“S1”为H. pylori感染检测阴性样本，并进一步进行了抗生素耐药性检测；“S2”为感染H. pylori且对克拉霉素和左氧氟沙星均耐药的样本；“S3”也为H. pylori阳性样本，但对克拉霉素敏感而对左氧氟沙星耐药；“S4”同样为H. pylori阳性样本，但对克拉霉素耐药而对左氧氟沙星敏感；“S5”为H. pylori阳性样本，但对克拉霉素和左氧氟沙星均敏感。弱质控品浓度为1.0 × 103 拷贝/mL，强质控品浓度为1.0 × 108 拷贝/mL。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65689/65689fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">样本</td>
			<td colspan="2">幽门螺杆菌</td>
			<td colspan="2">克拉霉素</td>
			<td colspan="2">左氧氟沙星</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+/-</td>
			<td>CT</td>
			<td>+/-</td>
			<td>CT</td>
			<td>+/-</td>
			<td>CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S2</td>
			<td>+</td>
			<td>22.61</td>
			<td>+</td>
			<td>22.77</td>
			<td>+</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3</td>
			<td>+</td>
			<td>28.32</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>+</td>
			<td>30.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S4</td>
			<td>+</td>
			<td>28.76</td>
			<td>+</td>
			<td>27.67</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S5</td>
			<td>+</td>
			<td>31.59</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
			<td>-</td>
			<td>U</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染及对克拉霉素和左氧氟沙星耐药性的qPCR结果汇总表。 本表展示了幽门螺杆菌（H. pylori）感染的定性检测结果、23S rRNA基因突变的检测结果（提示该分离株对克拉霉素耐药），以及gyrA基因突变的检测结果（提示该分离株对左氧氟沙星耐药）。+/−，表示定性结果；+，表示阳性结果；−，表示阴性结果。

本方案介绍了一种通过绳索试验无创快速诊断幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）胃部感染的方法，并利用定量聚合酶链式反应（qPCR）检测其对克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性。

基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的快速诊断 幽门螺杆菌 感染与抗生素耐药性

幽门螺杆菌是一种重要的人类病原体，感染了全球约一半的人口，由于……，正成为严重的健康威胁

由胃部细菌幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）引起的胃癌每年在中国导致三十万人死亡。本研究介绍了一种吞咽绳检测法，该方法可无创捕获幽门螺杆菌，并对其进行检测，从而为患者提供最精准的抗生素治疗方案。我们认为，中国每一位医生都将希望采用这一检测方法来指导治疗，实现个体化精准医疗。我们目前正专注于弦线检测技术的开发。我们认为，该技术有望彻底改变胃部疾病的诊断方式。弦线检测使研究人员能够从志愿者体内获取胃部样本，而无需进行胃内窥镜检查。最重要的是，我们希望未来能够利用绳线检测技术对早期胃癌进行筛查。将绳线检测与定量PCR（qPCR）相结合，可使我们在无需培养幽门螺杆菌（H.pylori）的情况下检测其感染及其对抗生素的耐药性。这一方法将诊断时间从三周大幅缩短至仅一天，并避免了依赖操作者技术水平的幽门螺杆菌内镜检测技术。首先，弦试验与定量PCR联用具有高度的敏感性和特异性，可提供更为准确的结果。其次，该单一检测还可提供抗生素耐药谱，使医生能够实施更有效的个体化治疗。第三，研究人员不再需要获取胃部样本，从而摆脱了对胃肠病学专家的依赖。这种非侵入性方法在研究胃部疾病时更快捷、更方便。目前的研究涵盖了中国各地的幽门螺杆菌感染及其抗生素耐药性。接下来，我们将基于已有的数据，通过重点关注抗生素耐药性较高的地区，进一步改进管理策略。此外，弦线检测为我们探索癌症预防的新标志物提供了绝佳机会。首先，指导患者在样本采集前过夜禁食。第二天，打开弦线检测套件。取胶囊，握住系在绳子末端的环。将绳子用胶带固定在患者的面颊上，然后指导患者将胶囊放在舌根靠近咽喉处，并用一小口水送服。待胶囊在患者胃中溶解一小时后，指示经过培训的助手小心地将绳子从患者口中拉出。接下来，将浸有胃液的一端放入TSE样本保存液中，并剪去绳子的下端。将贴好标签的标本采集管置于试管架上，涡旋振荡10秒。将32孔板倒置并反复翻转数次，以重悬磁珠。涡旋振荡10秒，然后小心移除板上的铝箔封膜。从每个样本中转移200微升胃液，并将幽门螺杆菌DNA作为阳性对照分别加入不同的孔中。将32孔板放入核酸提取仪相应的样本槽内，进行自动DNA提取。在完成DNA提取并确认后，将多余的胃液和提取的DNA样本置于-20摄氏度保存，直至使用。将qPCR反应混合液置于冰上解冻，并通过轻弹和离心混匀，以避免试剂损失。对于32孔板中的每个样本，将20微升PCR反应混合液与UREA正向引物和反向引物、UREA探针以及5微升提取的DNA混合。将 PCR 板放入 qPCR 仪器中，并设置热循环程序。将荧光信号采集通道设为 FAM，数据采集时间点设为扩增延伸阶段，然后启动运行。反应完成后，保存数据以供分析。使用专门的qPCR软件分析数据，仪器将自动选择基线阈值。如果幽门螺杆菌（H.pylori）的检测结果为阳性，则更换试剂盒，使用针对H.pylori试剂盒中23S rRNA基因和gyrA基因突变的检测试剂，对样本进行耐药性检测。本研究展示了通过qPCR检测胃液中的幽门螺杆菌及其抗生素耐药性。在幽门螺杆菌（H. pylori）阳性样本中，S2的CT值在检测范围内，表明对克拉霉素和左氧氟沙星具有双重耐药性。S3的CT值在幽门螺杆菌感染和左氧氟沙星耐药性的检测范围内，但不在克拉霉素耐药性的检测范围内，提示存在左氧氟沙星耐药性。类似地，S4的CT值在幽门螺杆菌感染和克拉霉素耐药性的检测范围内，但不在左氧氟沙星耐药性的检测范围内，提示存在克拉霉素耐药性。S5 仅在幽门螺杆菌感染时检测到 CT 值，表明其对两种抗生素均敏感，可使用任一种药物进行治疗。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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