Name: 哺乳动物细胞 原位 冷冻断层扫描的样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习哺乳动物细胞原位冷冻断层扫描的样品制备方法，使用牛纤维连接蛋白促进细胞贴附，并通过投入式冷冻技术保存细胞结构。该方案适用于HIV产生细胞的冷冻电镜成像研究。

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我们感谢Mansky实验室提供浸入式冷冻设备的使用权限。本工作的部分内容在明尼苏达大学表征设施中完成，该设施获得了美国国家科学基金会（NSF）通过材料研究科学与工程中心（MRSEC；资助号DMR-2011401）和国家神经科学课程倡议（NNCI；资助号ECCS-2025124）项目提供的部分支持。我们感谢来自病毒环境中的HIV行为研究中心（B-HIVE；资助号1U54AI170855-01）以及杜克大学HIV结构生物学中心（DCHSB；资助号U54AI170752）的经费支持。

1. 网格制备
注意：在实验设计中，每次冷冻投入实验最多计划使用 8-12 个载网，每个孔使用 4-5 个载网。超过此数量将导致冷冻投入时间过长，可能增加细胞应激、冰污染及操作者误差。
<ol>
	<li>辉光放电
	<ol>
		<li>将适量带有穿孔碳支持膜的载网放入辉光放电仪中，在0.39 mBar气压条件下以15 mA电流处理45秒。</li>
		<li>确保载网的碳膜面朝上。处理完成后，将载网转移至内衬滤纸的洁净容器中（图1A1）。 
		注意：只要材料对细胞无毒性（因此排除任何铜载网），也可使用其他类型的载网。定位载网适用于相关性研究。也可使用其他材质制成的载网。许多实验室已在SiO2支持载网上成功培养细胞8,9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>贴附处理
	<ol>
		<li>将载网、纤连蛋白、PBS、培养板和镊子转移至生物安全柜中。使用微量移液器在无菌表面（如6孔板盖）滴加两滴足量的贴附溶液（含20 µg/mL牛纤连蛋白），处理载网的两面。确保液滴足够大以完全覆盖整个载网（建议体积约为100 µL）。 
		注意：在使用选定的贴附溶液处理前，可选择在此处对载网进行光刻微图形化处理，以优化细胞在载网方格中心的附着。通过降低细胞在网格条上的附着能力，可增加可用于成像的细胞数量。这对于涉及冷冻聚焦离子束（cryoFIB）切削的实验尤为理想。</li>
		<li>使用5/15镊子操作载网。确保载网两面均充分接触溶液。 
		&#8203;注意：也可使用其他粘附性溶液（如纤维蛋白原、胶原蛋白、其他细胞外基质成分等）。此处选用纤连蛋白，因其在多种细胞系（U2OS、HeLa、Vero、Calu-3、Tzm-bl）中均表现出良好的附着效果。5/15镊子因其几何结构，便于在6孔板、35 mm培养皿和显微载片周围灵活操作，从而减少对载网的机械应力，保持碳膜完整性。请确保所有所需材料在操作开始前均已放入生物安全柜，以降低载网污染的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定载网
	<ol>
		<li>经牛纤连蛋白处理后，载网将变得具有粘性。使用5/15镊子轻轻将载网的非碳膜面接触空培养皿/板底部，并张开镊子。载网应能轻松附着于新表面（图1A2）。 
		注意：应尽量避免将载网置于培养皿/板的正中心或边缘区域。加入细胞后，细胞密度容易在培养板中心聚集，可能导致载网上细胞密度过高。此外，也可使用3D打印的载网支架替代直接将载网附着于培养皿/板表面的方法12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育
	<ol>
		<li>将载网在纤连蛋白贴附溶液（20 µg/mL）中孵育30分钟。为确保在此过程中载网不干燥，每隔15分钟用微量移液器直接在载网上滴加1–2滴贴附溶液（图1A3）。 
		注意：孵育时间可能因所用贴附溶液的不同而有所变化。对于牛纤连蛋白，推荐孵育时间为30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤
	<ol>
		<li>孵育结束后，用微量移液器吸除多余的贴附溶液。通过在载网上直接滴加PBS液滴的方式洗涤载网，重复2–3次（图1A4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灭菌
	<ol>
		<li>在生物安全柜中使用紫外光对载网进行1小时灭菌处理。应将载网尽可能靠近紫外光源，以实现最佳灭菌效果（图1A5）。为防止在此过程中载网干燥，每隔10分钟用微量移液器直接在载网上滴加1–2滴PBS。 
		&#8203;注意：步骤1.4–1.6可同时进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 播种网格
<ol>
	<li>计数细胞：
	<ol>
		<li>使用机械或酶解方法解离并计数细胞。在计数前确定用于接种的最佳细胞数量。对于接种于6孔板中的U2OS细胞，每孔接种数量可在6 × 104 至 1.6 × 105 个细胞之间（图1B1）。 
		注意：接种的细胞数量需根据细胞类型、所用孔板、培养皿或微孔载片的表面积、接种至投入冷冻之间的时间以及实验设计而调整。应测试不同细胞接种量，以确定在投入冷冻时每网格方格内有0.25–1个细胞的合适条件。需注意，高细胞密度会降低热传导速度，可能影响玻璃化冷冻效果。为克服此问题，一些实验室发现使用细胞筛网可有效防止细胞团块形成13。此外，本方案会导致细胞随机附着于碳膜上。若需实现靶向附着，可采用光刻微图案化技术（见步骤1.3）14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加细胞和培养基：使用微量移液器将细胞加入孔中，避免产生气泡（图1B2）。在6孔板中，建议每孔总体积为1.5–2.0 mL。 
	注意：建议在加入全部液体前，先小心润湿载网周围区域。这有助于防止载网脱落并在溶液中漂浮。轻轻左右晃动孔板，以促进细胞在孔内均匀分布。切勿以环形方式旋转摇动孔板，否则会导致细胞过度聚集于孔中心区域。</li>
	<li>孵育：根据实验设计和后续应用需求，在37 °C下孵育适当时间。本示例（转染HIV分子克隆）建议孵育16–24小时（图1B3）。 
	&#8203;注意：孵育时间越长，细胞分裂周期越多。因此，应相应调整接种时的起始细胞数量。</li>
</ol>
3. 转染
<ol>
	<li>转染混合物的制备：
	<ol>
		<li>为将质粒转染至所选细胞系，配制合适的阳离子脂质体试剂。</li>
		<li>在此转染示例中，&#160;每孔（6 孔板）使用 1 µg 总质粒 DNA 进行转染，HIViΔEnv 质粒与 psPAX2 质粒的比例为 1:3。每孔将 1 µg DNA 溶于 50 µL 无血清 DMEM 中。通过反复移液或轻轻摇晃培养板使混合物混匀。</li>
		<li>每个孔中，将3 µL转染试剂加入无血清DMEM培养基中稀释，再通过微量移液或轻柔涡旋充分混匀。将全部稀释后的转染试剂混合液加入稀释的DNA混合液（步骤3.1.2）中，室温（RT）孵育15分钟图1C1). 
		注意：在该混合物孵育期间，将孔中的培养基更换为1.5 mL新鲜DMEM。操作时注意勿使网格从孔底脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了加入转染混合物，用移液器将步骤 3.1.3 中的混合物 100 µL 逐滴加入每个孔中，将液滴集中在网格区域，以确保接触。图1C2）。转染后16-24小时更换培养基（图1C3).</li>
</ol>
4. 载网冷冻
注意：细胞在使用前需保持在 37 °C 环境中。此外，整个操作过程中务必记录载网的碳膜面朝向。
<ol>
	<li>细胞密度
	<ol>
		<li>在倒置光学显微镜下观察载网上的网格，并记录每个载网的细胞密度。 
		注意：每个网格方格中细胞数少于0.25个（即每4个网格方格中少于1个细胞）的载网被视为“空载网”；每个网格方格中细胞数为0.25–1个的载网被视为“正常”；每个网格方格中细胞数超过1个的载网被视为“满载网”。</li>
		<li>记录每个载网的细胞密度，以便在后续冷冻固定过程中调整 blotting 时间。向一个空的培养皿中加入2–3 mL PBS，并在37 °C下预热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备定位标记物（fiducials）
	<ol>
		<li>为后续低温断层成像应用制备金颗粒定位标记物，将50 µL的10 nm胶体金溶液移入洁净的1.5 mL离心管中。向管中加入2 µL浓度为1 mg/mL的BSA溶液，并通过微量移液器反复吹打使其充分混匀。</li>
		<li>在15,000–20,000 ×g条件下离心15分钟。用微量移液器小心吸除上清液，尽量不扰动沉淀。 
		注意：沉淀物会非常松散。</li>
		<li>向沉淀中加入50 µL PBS并重悬。再次在15,000–20,000 ×g条件下离心15分钟。</li>
		<li>使用10 µL枪头直接吸取4 µL沉淀，转移至另一洁净的1.5 mL离心管中（图1D1）。每个载网使用1 µL洗涤并浓缩后的金颗粒溶液。 
		注意：所用定位标记物的类型取决于后续应用。透射电子显微镜断层成像使用10 nm金颗粒；软X射线断层成像使用200 nm金颗粒；相关显微成像使用荧光乳胶颗粒。在涉及cryoFIB切削的实验中通常无需使用定位标记物，因为切削过程会破坏这些标记物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>blotting（吸液）
	<ol>
		<li>将环境舱设置为95%湿度和30°C（图1D1）。使用5/15镊子选取一个载网。</li>
		<li>用PBS清洗载网，并将其转移至冷冻夹持镊子中（图1D2）。确认固定后，移除5/15镊子，并滑动闭合冷冻夹持镊子的夹具。</li>
		<li>将载网插入冷冻仪中，确保夹具牢固（图1D3）。向载网背面加入1 µL金定位标记物溶液（图1D4）。向载网的碳膜面加入2–3 µL PBS。使用自动blotting程序对载网背面进行吸液，随后迅速浸入液态乙烷中冷冻（图1D5）。 
		注意：为获得最佳blotting效果，建议每个载网总体积保持在3–4 µL之间。载网在清洗后可能残留不同量的PBS，因此应根据载网上已存在的液体残留量调整PBS的添加体积。建议将金定位标记物加在载网背面；若加在正面，可能导致在加样点附近形成金颗粒聚集液滴，而从背面添加可使溶液分布更均匀。blotting时间取决于载网的细胞密度：空载网为2秒，正常载网为3秒，满载网为4秒。所使用的冷冻仪型号会影响blotting方式的选择：本方案使用Leica GP2冷冻仪，默认支持自动单面blotting；Thermo Fisher Vitrobot支持自动双面blotting，但该方式常会损伤附着在碳膜面的细胞。也可在Vitrobot中进行手动blotting，或使用手动重力式冷冻装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

<ol><li>Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+P+%22Encyclopedia+of+Virology%22">Encyclopedia of Virology</a>. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).</li>
<li>Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+structure+of+Arp2%2F3+complex+in+cells+reveals+new+insights+into+the+branch+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction.</a> Nature Communications. 11, 6437(2020).</li>
<li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).</li>
<li>Stewart, M., Vigers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated biological material.</a> Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of cells.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (1), 27-56 (2012).</li>
<li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CorRelator%3A+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709(2021).</li>
<li>Mendonça, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629(2021).</li>
<li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+automated+cryo-FIB+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A modular platform for automated cryo-FIB workflows.</a> eLife. 10, e70506(2021).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFITM3+blocks+influenza+virus+entry+by+sorting+lipids+and+stabilizing+hemifusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion.</a> Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).</li>
<li>Shah, P. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rotavirus+assembly+pathway+in+situ+using+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography.</a> Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).</li>
<li>Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633(2020).</li>
<li>Hoffmann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+reveals+the+subcellular+architecture+of+growing+axons+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids.</a> eLife. 10, e70269(2021).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文提供了一种简便、灵活且可重复的方案，用于在电子显微镜载网上接种细胞，以应用于原位冷冻电子断层扫描。in situ cryoelectron tomography 可根据下游应用或实验需求轻松调整。除了具备高度灵活性外，我们还描述了一种优化的工作流程，可减少细胞接种过程中常见的问题，特别是碳膜严重损伤、细胞密度低以及细胞薄层突起结构完整性差等问题。
尽管本方案提供了多种可选步骤，但仍有一些关键步骤必须遵循，以优化整体实验结果。网格细胞接种过程中最常见的问题之一是网格从孔板或微型载玻片上脱落并漂浮起来。因此，必须使用黏附溶液将网格的两面充分浸润，并在孵育期间防止其干燥。如果使用3D打印的网格支架，需注意：对这些支架频繁更换培养基可能导致网格漂浮，因为滞留在网格下方的气泡可能将其推出支架。
我们所选用的镊子还能通过提供一种几何形状上更有利的操作方式来改善载网质量，避免因过度弯曲载网而损坏碳膜。在将载网投入冷冻前，尽可能长时间地将细胞保持在37 °C，可减少细胞所受损伤，并提高载网上可用于成像的薄区细胞数量。最后，从金侧进行吸液可保护细胞免受强烈机械力的影响，从而避免脆弱的细胞结构受损。
尽管本方案未包含网格光刻微图案化技术，但已有研究表明，该技术可通过优化细胞在网格方格中心的附着，增加可成像细胞的数量14。最后，最近已采用3D打印的网格支架来减少对网格的直接操作，从而降低网格损伤12。
需要注意的是，本方案针对冷冻断层成像应用中对细胞的薄边缘和突起结构进行成像而进行了优化。我们建议根据本方案中的推荐条件，尝试多种不同参数组合，以获得最适合后续特定应用的最佳结果。总体而言，本方案提供了一种可靠且灵活的细胞接种至载网的方法，可根据具体需求进行调整。

原位细胞冷冻断层成像是一种强大的技术，可对细胞中具有生物学意义的结构进行研究，而无需化学固定。通过将细胞附着于电镜载网，并将载网浸入冷冻剂中快速冷冻，可使感兴趣的目标结构在其天然的细胞环境中被瞬间冻结，同时避免细胞内水分形成结晶冰1,2。化学固定和结晶冰的形成均可能破坏蛋白质和脂质等关键分子的结构，从而降低这些技术所获得图像的生物学准确性3,4。在断层成像过程中，利用电子显微镜以逐步变化的角度对载网进行成像，随后将这些图像用于构建目标区域的三维结构模型5。原位冷冻断层成像可与其他显微技术结合使用，实现整合性与关联性成像，例如冷冻荧光成像、软X射线断层成像以及cryoFIB/SEM（低温聚焦离子束/扫描电子显微镜）6,7,8,9,10,11。多种技术的联合应用能够获取比单一显微技术更为丰富的结构或过程信息。
尽管有所有这些好处 原位 细胞冷冻断层扫描中，样品制备可能因多种原因而具有挑战性。由于电子显微镜载网较为脆弱，对其施加外力操作容易造成损伤，尤其是其表面的薄碳层极为纤细，易发生撕裂，从而减少可用于成像的网格区域。电子显微镜载网本身尺寸微小，操作困难，且在用于细胞培养的孔板或多孔载玻片表面容易脱落。此外，由于孔板或微型载玻片的几何结构限制，在其中对载网进行操作也较为困难。若载网制备不当（例如任其漂浮），可能导致细胞密度偏低，减少潜在成像区域的数量，尤其当细胞本身不易附着于载网时更为明显。对于直接细胞冷冻断层扫描，细胞必须&#160;铺展过薄，可能因温度不当或对载网操作粗暴等多种原因而遭到破坏。
通过多种优化措施，本文介绍的技术旨在解决在制备用于冷冻断层扫描的透射电镜载网过程中最常见的问题。使用5/15度角的镊子可在孔板或微型载玻片中对载网进行操作。在接种细胞前，将纤连蛋白溶液涂覆于载网的两侧，有助于减少载网漂浮现象，从而确保载网具有足够的细胞密度，并降低因操作导致载网损伤的风险。在 plunge freezing（骤冷）前始终保持载网在37°C条件下孵育，可使细胞处于适宜环境中，防止细胞的薄边缘发生回缩。从载网背面进行吸液操作，也可避免机械力对细胞造成损伤。综上所述，这些措施显著提高了样品制备的成功率 原位 细胞冷冻断层扫描研究，提高了该成像技术的可及性。

<table><tbody><tr><td>10 nm 胶体金珠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741957</td><td></td></tr><tr><td>6 孔多孔培养皿，100/箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>Allegra V-15R 台式离心机，IVD 120 V 60 Hz</td><td>Beckman-Coulter</td><td>C63125</td><td></td></tr><tr><td>Au G300F1 带 R2/2 Quantifoil 碳支持膜</td><td>Quantifoil</td><td>TEM-G300F1-AU</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>BRAND&amp;nbsp;计数板 BLAUBRAND&amp;nbsp;改进型 Neubauer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805-1EA</td><td></td></tr><tr><td>DMi1 倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>22A00G119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基（不含谷氨酰胺）</td><td>Gibco</td><td>11-960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5/15 镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0103-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>EM GP2</td><td>Leica</td><td>587085</td><td>自动冷冻制样仪</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5209</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤连蛋白，细胞培养级</td><td>MilliporeSigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>GenJet 版本 II 体外 DNA 转染试剂</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>Neslab EX-211 加热循环器</td><td>Neslab</td><td>已停产</td><td>用于培养基预热的水浴设备</td></tr><tr><td>Original Portable Pipet-Aid 移液控制器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easyGlow 装置</td><td>Pelco</td><td>91000S</td><td>辉光放电装置</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>Pipetman P1000，100&amp;ndash;1000 &amp;micro;L，金属弹射头</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2，0.2&amp;ndash;2 &amp;micro;L，金属弹射头</td><td>Gilson</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20，2&amp;ndash;20 &amp;micro;L，金属弹射头</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 2 号滤纸，55 mm</td><td>Whatman</td><td>28455-041</td><td>吸水纸</td></tr></tbody></table>

样品制备 原位 哺乳动物细胞的冷冻断层扫描技术

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

原位细胞冷冻断层成像是一种强大的技术，可用于在天然的冷冻水合细胞环境中研究复杂结构，因此在细胞生物学和病毒学领域具有重要意义。将冷冻断层成像与其他显微技术联用的潜力，使其成为整合式与关联成像的理想选择。然而，原位细胞断层成像的样品制备并不简单，因为细胞难以牢固贴附并充分伸展于透射电镜载网上。此外，载网本身较为脆弱，若操作用力过猛可能发生断裂，导致可用于成像的区域丢失。在使用镊子操作载网时，组织培养皿的几何形状也可能带来挑战。本文介绍了克服这些（及其他）困难的实用技巧，以制备高质量的样品，用于贴壁哺乳动物细胞的原位细胞冷冻断层成像及关联成像。随着冷冻显微技术的不断进步，该技术在深化我们对复杂生物系统理解方面具有巨大前景。

在共转染 HIViGFPΔEnv 和 psPAX2 后，所有载网的碳膜层均仅有轻微撕裂。转染试剂孵育 24 小时后，采用相差显微镜和荧光显微镜对载网进行成像观察（图 2）。空白对照载网和共转染载网上的细胞均在多个网格方格中显示出存活细胞。
psPAX2 编码 HIV-1 的所有结构蛋白和酶蛋白，不含任何荧光标记。HIViGFPΔEnv 与 psPAX2 类似，但编码带有 GFP 标签的 HIV Gag 蛋白。两种质粒均为包膜蛋白缺失型（ΔEnvelope）。共转染可导致类似天然状态的荧光 HIV-1 颗粒的组装与出芽，使其成为在生物安全等级 1 条件下开展 HIV 细胞电镜联用荧光显微镜（CLEM）研究的理想系统。共转染的载网显示部分细胞呈现绿色荧光，表明共转染成功。阴性对照载网上的细胞均未显示荧光，进一步验证了使用 HIViGFPΔEnv 和 psPAX2 进行共转染的有效性。在使用光学显微镜观察载网后，将载网进行 plunge 冷冻，并转移至液氮中长期保存。
图3展示了使用相同实验方法制备但采用略有不同的质粒构建体的载网结果。含有U2OS细胞的载网通过共转染不同的HIV克隆（HIVmCherryΔEnv和NL4-3ΔEnvGFP，比例为1:6）实现。由于使用了较大量荧光标记的质粒，这些载网使得可观察到更多转染细胞，从而在利用冷冻关联显微镜（cryoCLEM）和冷冻电子断层扫描（cryoET）进行成像时具有优势。通过cryoCLEM，对每块载网均利用冷冻荧光显微镜生成完整的载网图谱，以记录所有共转染细胞的位置。在已知细胞位置的情况下，进行cryoET成像。采集了完整的低倍率载网图谱，并与冷冻荧光显微镜获得的荧光图谱叠加（图3A）。在细胞位点采集了冷冻断层图像，捕捉到病毒生命周期的精细细节，包括HIV在细胞内的组装和出芽过程（图3B）。
<img alt="载网制备、接种、转染和投入冷冻示意图；细胞培养工作流程步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：细胞在载网上接种的工作流程。 示意图为在冷冻电镜载网上接种细胞的整体流程。该过程分为四个主要步骤，包括（A）在孔板中准备用于接种的载网，（B）向每个孔中加入适量的细胞，（C）可选的细胞转染以用于荧光成像，以及（D）载网的投入冷冻，以实现样品的玻璃化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="共转染细胞与对照细胞分析；相差、GFP及复合荧光显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用 HIViGFPΔEnv 和 psPAX2 对 U2OS 细胞进行共转染。将 U2OS 细胞以 1:3 的比例共转染含 GFP 的 HIViGFPΔEnv 和 psPAX2。通过相差显微镜和荧光显微镜对网格区域进行成像。显示 GFP 表达的细胞表明共转染成功。比例尺：500 µm。比例尺（插图）：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像；(A) 细胞网格模式，放大插图；(B) 线粒体结构，纳米尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：潜在的下游基于冷冻的技术方法。（A）共转染U2OS细胞的冷冻光电关联显微镜（cryoCLEM）图像。绿色细胞代表产生HIV的细胞，用于评估共转染效率。红色点状结构代表mCherry标记的HIV-1 Gag蛋白。比例尺：250 µm。插图比例尺：25 µm。（B）U2OS细胞质膜上多个HIV颗粒出芽的冷冻电子断层成像（cryoET）图像。比例尺：50 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

该方法提供了一种简便且灵活的电镜（EM）载网制备方案，适用于 原位 细胞冷冻断层扫描与相关联的光学和电子显微镜技术（CLEM）。

原位细胞冷冻断层成像技术是一种用于在天然冷冻水合的细胞环境中研究复杂结构的强有力方法，使其非常适用于……

本研究的目标是建立一种既易于实现又可靠可重复的样品制备方法。通过实现这一目标，可以直接利用细胞原位冷冻电子断层成像技术来回答多种多样的生物学问题。然而，载网样品制备面临诸多挑战。细胞不易附着于载网上，操作过程可能导致碳膜层受损，从而造成可用于成像的载网区域丢失。此外，若不注意适当的样品制备条件，细胞细长突起的出现频率会降低。目前的实验方案通常需要使用特殊设备来解决接种过程中的主要瓶颈问题，例如采用微图案化技术以及3D打印的细胞附着与操作支架。本方案在保持这些专用工具可用于下游应用的灵活性的同时，提供了更便捷的解决方案。开始准备用于细胞冷冻断层扫描的电子显微镜载网时，将带有穿孔碳支持膜的载网放入辉光放电仪中，使载网的碳膜面朝上。随后在0.39毫巴的大气压下以15毫安的电流对载网进行45秒的辉光放电处理。完成后，将网格置于内衬滤纸的洁净容器中。接着，将网格连同纤连蛋白、磷酸盐缓冲液（PBS）、培养板和镊子一起转移至生物安全柜中。使用微量移液器，在无菌表面（如六孔板盖）上滴加两滴足量的牛纤连蛋白溶液。确保液滴足够大，能够完全覆盖整个载网。然后取 5/15 镊子，用纤连蛋白黏附溶液处理载网的两侧。经牛纤连蛋白处理后，载网将变得具有黏性。用镊子轻轻将网格的非碳表面接触六孔板中空孔的底部，然后松开镊子，使网格附着于新表面。接着，将网格在纤连蛋白黏附溶液中孵育30分钟。为防止网格干燥，每隔15分钟使用微量移液器在网格上方添加一至两滴黏附溶液。孵育结束后，用微量移液器吸除多余的黏附溶液。使用微量移液器将PBS液滴直接滴加到载网上，清洗2至3次。将载网置于生物安全柜内的紫外灯下照射一小时以进行灭菌。为达到最佳灭菌效果，应将载网放置在尽可能靠近紫外灯的位置。在灭菌过程中，每隔10分钟用微量移液器在网格表面滴加一至两滴PBS，以防止网格干燥。开始接种细胞前，使用机械或酶法解离细胞后进行细胞计数。用微量移液器将计算好的细胞数量加入六孔板的各孔中，六孔板内应已预先放置好用于电子显微镜的网格，并注意避免产生气泡。确保每孔细胞悬液维持在1.5至2.0毫升。转染HIV分子克隆时，将细胞在37摄氏度孵育16至24小时。向一个洁净的微量离心管中加入50微升无血清DMEM和1微克DNA。每个孔分别取三微升转染试剂，加入无血清DMEM培养基中，置于单独的洁净微量离心管内。使用微量移液器分别混匀各管。然后通过微量移液器将转染试剂混合物加入DNA混合物中，室温孵育15分钟。随后，将100微升转染试剂与DNA混合物逐滴加入每个孔中，直接滴加在网格上方。转染后16至24小时更换培养基。共转染24小时后，相差显微镜和荧光显微镜观察显示，所有网格的碳层均仅有轻微撕裂。在阴性对照载网和共转染载网上，多个网格区域均含有活细胞。在将含有细胞的透射电镜载网进行冷冻固定之前，需在倒置光学显微镜下检查载网，记录每张载网上的细胞密度，以调整冷冻固定过程中的滤纸吸附时间。在空培养皿中将两到三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）于37摄氏度预热。制备金标记物时，取50微升10纳米胶体金珠溶液，移入洁净的1.5毫升离心管中，加入2微升牛血清白蛋白，通过反复移液混匀。将离心管在15,000至20,000 g下离心15分钟。使用微量移液器小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。用50 µL PBS重悬沉淀，并按前述方法再次离心。用10微升枪头吸取4微升沉淀，并转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。将环境培养箱设置为95%湿度和30摄氏度。使用5/15镊子选取一个载网，并用PBS洗涤。将洗涤后的载网转移至冷冻夹中。固定好载网后，取下5/15镊子，并滑动固定冷冻夹上的夹子。在保持夹子固定的同时，将载网插入冷冻仪中。向载网的背面加入一微升金标。然后向载网的碳膜面加入二至三微升磷酸盐缓冲液（PBS）。利用自动 blotting 装置对载网背面进行 blotting 处理，随后将载网浸入液态乙烷中快速冷冻。转染的 U-2 OS 细胞的冷冻关联光镜与电镜图像揭示了可产生 HIV 的细胞的存在。冷冻电子断层扫描图像显示多个 HIV 颗粒从 U-2 OS 细胞的质膜上出芽。

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生物化学

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