在单分子尺度上研究肌肉转录动态 黑腹果蝇

在我们的团队中，我们研究了调控肌肉发育与修复的细胞和分子机制。事实上，mRNA分子的特殊分布已被证实可调节多种细胞过程。本研究中，我们采用果蝇作为模型，探究mRNA在飞行肌组织内的空间分布方式。

基因表达动态已被证实可调控多种肌肉生物学过程。高通量单细胞和单细胞核RNA测序技术的出现，使得对转录动态进行全面探索成为可能。经典组学技术的一个显著局限性在于无法提供果蝇肌纤维内mRNA分子的空间分布信息。

这一特征可通过单分子荧光原位杂交技术进行研究。目前的方法尚不足以确定黑腹果蝇肌肉合胞体内的 mRNA 转录动态及其空间分布。为克服这一局限性，我们优化了一种方法，可在高百分比分辨率和单分子尺度下检测并定量黑腹果蝇肌纤维中的单个 mRNA 分子。

目前该领域面临的一个挑战是实时观察活体动物中肌肉再生的动态过程。因此，我们正致力于开发一种活体成像方法，以在肌肉干细胞所处的天然微环境中观察其行为，例如在肌肉再生过程中，研究这些细胞的迁移模式与迁移范围，以及它们的分化过程，并以前所未有的分辨率实现这一目标。首先，用预冷的PBS缓冲液将处于L3阶段的黑腹果蝇幼虫清洗三次，每次五分钟。

使用两把尖头镊子夹住幼虫的前部，去除约三分之二的体组织。用一把镊子夹住幼虫的前三分之一部分，另一把镊子夹住口钩，然后将口钩向内拉，直至幼虫完全内翻。

去除腿节盘和脑组织，以获得一个干净的倒置幼虫体壳，其气管上附有一对翅盘。将翅盘转移至一个1毫升离心管中。用PBS稀释的4%多聚甲醛在室温下振荡固定翅盘45分钟。

固定后，用 70% 乙醇将样品洗涤三次，每次五分钟。去除麻醉果蝇的头部、腹部、腿部和翅膀，将分离的胸部组织置于冷 PBS 中。在 1% Triton 溶液中加入 4% 多聚甲醛，于振荡条件下预固定胸部组织 20 分钟。

随后在搅拌条件下，用PBT每次5分钟，洗涤样品三次。将胸部置于载玻片的双面胶带上，并使用锋利的切片刀将其沿中线切开，得到两个半胸体。在搅拌条件下，将半胸体用4%多聚甲醛固定45分钟。

在振荡条件下，使用 PBT 每次 20 分钟，清洗样品两次。将半胸部分置于冷 PBS 中，并用镊子小心地从半胸部分离间接飞行肌。在 70% 乙醇中于 4°C 下对肌肉进行透化处理，处理时间为 2 至 7 天。

透化后，使用缓冲液A将IFMs洗涤两次，每次20分钟。然后加入400微升杂交缓冲液，在37摄氏度的恒温混匀仪中预杂交肌肉30分钟。加入100微升新鲜配制的含有探针和一抗的杂交缓冲液。将样品在37摄氏度、300 RPM的恒温混匀仪中避光孵育16小时。

孵育后，用预热的缓冲液A洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。然后将样品置于含有二抗和DAPI的缓冲液A中，37摄氏度孵育1小时。在将样品转移至显微镜载玻片前，用缓冲液B洗涤三次，每次20分钟。

擦去残留的缓冲液B，然后在载玻片上加入30微升封片剂。将一块18 mm × 18 mm的盖玻片盖在载玻片上，并用指甲油封固盖玻片边缘。开启配备40倍和63倍油镜物镜的共聚焦显微镜后，将载玻片置于显微镜载物台上。

为了成像翅盘相关肌肉前体细胞和间接飞行肌（IFMs），设置DAPI的激发波长为405 nm，发射波长为450 nm。然后选择Alexa Fluor 488，其激发波长为496 nm，发射波长为519 nm，以及用于smFISH探针的Quasar 670，其激发波长为647 nm，发射波长为670 nm。使用DAPI信号和紫外灯定位样品。

将捕获的图像保存为 TIF 文件。为成年肌肉干细胞成像时，按照先前所示方法设置 DAPI 和 Alexa Fluor 88 的激发和发射波长。然后为 smFISH 探针设置 Alexa Fluor 555 和 Quasar 670 的波长。

定位样本并将捕获的图像保存为 TIF 格式。启动 ImageJ，然后转到“插件”菜单。选择“宏”，然后选择“编辑”以打开宏的源代码。

为了定量分析幼虫中的 Mef2 单分子荧光原位杂交（smFISH）信号点，将对数半径设置为 3，对数质量设置为 20。然后使用 2 的模糊值、30 的细胞核尺度参数、8 的细胞核阈值和 300 的细胞核大小来分割 Mef2 阳性细胞核。通过执行运行命令来启动宏程序。

该宏将自动加载指定文件夹中的所有图像，并依次进行量化。在肌纤维分析中，将对数半径设为2.5，对数质量设为60，模糊度设为2，细胞核尺度参数设为100，细胞核阈值设为0，细胞核大小设为300。通过执行运行命令来启动该宏。

该宏将自动加载指定文件夹中的所有图像，并依次对其进行定量分析。分析完成后，请检查文件 FISH_results 和文件 nuclei_results 中显示的结果。Mef2 和 zfh1 转录本在 AMP 细胞群中被均匀检测到，并分别与 Mef2 和 zfh1 蛋白共定位。

更高倍数的放大观察AMPs可区分转录位点的焦点与散布在细胞质中的成熟mRNA。类似地，在分化的成年IFMs及其相关干细胞中检测了Mef2和zfh1 mRNA的转录位点及分布情况。自主开发的ImageJ宏程序有效检测并分割了Mef2信号点和肌细胞核。

成年IFMs和AMPs中每个细胞核的Mef2 mRNA定量分析结果无显著差异。Mef2斑点分布的定量结果显示，92%的Mef2 mRNA存在于细胞质中，8%与肌细胞核相关。