Name: 研究果蝇单分子尺度的肌肉转录动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 了解果蝇肌肉转录动力学的单分子尺度研究方法，利用优化后的smFISH技术可视化mRNA空间分布。该技术为肌肉发育与再生研究提供高分辨率定量分析工具。

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感谢 Alain Vincent 对本文稿的审阅。感谢 Ruth Lehmann 提供 Zfh1 抗体。感谢 Stephanie Dutertre 和 Xavier Pinson 在 MRic 成像平台提供的共聚焦显微镜技术支持。EL 获得法国高等教育与科研部博士奖学金资助。NA 获得 AFM-Telethon 博士奖学金（23846）资助。TP 获得陈-扎克伯格倡议 DAF 基金会资助（项目编号：2019-198009）。HB 获得法国国家科学研究中心（CNRS）、Atip Avenir 项目以及 AFM-Telethon 弹跳资助（23108）的支持。

1. 翅盘和成体肌肉的解剖与制备
注意：使用RNase抑制剂溶液清洁解剖台和所有解剖器械（材料表）。整个实验过程中应佩戴实验室手套。
<ol>
	<li>翅盘
	<ol>
		<li>将L3期幼虫置于冰冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中（图1A）。</li>
		<li>用1× PBS清洗幼虫3次，每次5分钟，并将其保留在该溶液中5分钟。</li>
		<li>使用两对尖头镊子，用一对夹住幼虫前端，另一对拉住并弃去其余身体组织（约2/3）。</li>
		<li>用一对镊子夹住幼虫前1/3部分，另一对夹住口钩，将口钩向内拉，使幼虫完全内翻。 
		注：每个实验建议解剖约30只幼虫，以确保分析所需的足够样本量。</li>
		<li>观察到翅盘与沿幼虫体侧分布的两条主要气管分支紧密相连。</li>
		<li>去除所有其他幼虫组织（腿盘和脑），获得一个干净的内翻幼虫残体，其气管上附有一对翅盘（图1B）。</li>
		<li>将样品放入1 mL离心管中，加入用1× PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）在室温下振荡固定45分钟。 
		注：样品振荡可通过振荡搅拌器实现（材料表）。</li>
		<li>用70%乙醇（EtOH，用无RNA酶水配制）洗涤样品3次，每次5分钟，然后将样品保存在相同洗涤液中，于4 °C下保存至少2天，最多1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>间接飞行肌
	<ol>
		<li>将成年果蝇置于CO2麻醉垫上进行麻醉，去除头部、腹部、腿部和翅膀。</li>
		<li>将解剖后的胸部组织置于冰冷的1× PBS中，并继续操作直至所有样品均完成解剖（图1D）。</li>
		<li>在室温下振荡条件下，用含1% Triton的4% PFA对胸部组织进行预固定20分钟。</li>
		<li>用1× PBT洗涤液（含1% Triton的1× PBS）洗涤样品3次，每次5分钟。</li>
		<li>将胸部组织置于载玻片上的双面胶带上（材料表），使用锋利的切片刀将其纵向切开，得到两个半胸体（图1E、F）。</li>
		<li>在室温下振荡条件下，用含1% Triton的4% PFA固定样品45分钟。</li>
		<li>在室温下振荡条件下，用1× PBT洗涤液（含1% Triton的1× PBS）洗涤2次，每次20分钟。</li>
		<li>将半胸体置于冰冷的1× PBS中，用镊子轻轻将间接飞行肌（IFMs）从半胸体中分离出来（图1G）。 
		&#8203;注：为实现此操作，需尽可能彻底地去除表皮。</li>
		<li>为使样品通透，将分离的IFMs置于70% EtOH溶液中，在4 °C下保存至少2天，最多1周。 
		&#8203;注：每个实验建议从约10个胸部组织中分离IFMs，以确保分析所需的足够样本量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 杂交、免疫染色和封片
注意：翅盘和间接飞行肌样本均采用相同的杂交程序。在开始杂交前，必须将翅盘从幼虫体壳中分离，并置于200 µL缓冲液A中。
<ol>
	<li>用 400 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）重悬探针，配制成终浓度为 12.5 µM 的储备溶液。</li>
	<li>将样品转移至含有缓冲液 A（材料表）的 0.5 mL 离心管中。 
	注意：通过减小容器体积，可更易于观察样品，并在洗涤过程中避免样品丢失。</li>
	<li>用缓冲液 A 洗涤样品，每次 20 分钟，共洗涤 2 次。</li>
	<li>吸除缓冲液 A，加入 400 µL 杂交缓冲液（材料表），在 37 °C 的恒温混匀仪（材料表）中预杂交 30 分钟。</li>
	<li>在杂交缓冲液中将探针稀释至终浓度：翅盘样品为 125 nM，成体肌肉样品为 200 nM，并加入一抗。 
	注意：一抗的稀释比例取决于所使用的一抗种类（材料表）。添加抗体为可选步骤。用户可选择不进行蛋白染色，而采用类似的单分子荧光原位杂交（smFISH）方案，该方案不包含抗体添加步骤。</li>
	<li>吸除杂交缓冲液，替换为 100 µL 含有探针和一抗的杂交缓冲液。</li>
	<li>将样品置于恒温混匀仪中，在 37 °C、300 rpm 振荡条件下避光孵育至少 16 小时。</li>
	<li>将一份缓冲液 A 预热至 37 °C。</li>
	<li>在恒温混匀仪中，以 37 °C、300 rpm 振荡条件洗涤样品，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>在最后一次洗涤时，将二抗（1/200 稀释）和 DAPI（1/10,000 稀释）加入缓冲液 A 中，将样品在此溶液中于 37 °C 孵育至少 1 小时。</li>
	<li>用缓冲液 B（材料表）洗涤样品，每次 20 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>小心将样品转移至显微镜载玻片上，擦去残留的缓冲液 B，加入 30 µL 封片介质，盖上 18 × 18 mm 盖玻片，并用指甲油密封样本。</li>
	<li>样品可在 4 °C 保存最多 1 周。 
	&#8203;注意：但建议尽快进行成像，以避免探针信号降解。</li>
</ol>
3. 成像
<ol>
	<li>使用配备40倍和63倍油镜物镜的共聚焦显微镜，以xyz采集模式获取图像（材料表）。通过HyD探测器的光子计数模式检测smFISH信号。</li>
	<li>利用DAPI信号和紫外灯定位样品。</li>
	<li>为成像翅盘相关肌前体细胞和间接飞行肌（图2 和 图3），设置以下激光线和发射滤光片参数：选择DAPI （激发（ex.）405 nm，发射（em.）450 nm）、Alexa Fluor 488（ex. 496 nm，em. 519 nm）以及用于smFISH探针的Quasar 670 （ex. 647 nm，em. 670 nm）。</li>
	<li>为成像成年肌肉干细胞（MuSCs）（图2D），设置以下激光线和发射滤光片参数：选择DAPI （ex. 405 nm，em. 450 nm）、Alexa Fluor 488 （ex. 496 nm，em. 519 nm）、Alexa Fluor 555（ex. 555 nm，em. 565 nm）以及用于smFISH探针的Quasar 670（ex. 647 nm，em. 670 nm）。 
	注意：成像时可根据与二抗和探针偶联的染料调整波长。</li>
	<li>将共聚焦图像保存为.TIFF文件。</li>
</ol>
4. 成像后分析
<ol>
	<li>启动 ImageJ，然后导航至 Plugins 菜单。从中选择 Macros | Edit 以打开宏的源代码。 
	注意：这将允许根据需要调整参数，如有必要，还可修改宏源代码中每个通道的文件夹目录。</li>
	<li>按照本方案对幼虫中的 Mef2 smFISH 斑点进行定量时，请使用以下设置：Log_radius = 3.0 和 Log_quality = 20.0。使用 blur = 2；nucleus_scale_parameter = 30；nucleus_threshold = -8.0；nucleus_size = 300 对 Mef2 阳性细胞核进行分割。</li>
	<li>在肌纤维中，请使用以下参数：Log_radius = 2.5；Log_quality = 60.0；blur = 2；nucleus_scale_parameter = 100；nucleus_threshold = 0.0；nucleus_size = 300。</li>
	<li>要启动宏，只需执行运行命令，然后等待宏自动从指定文件夹加载所有图像，并按顺序进行定量。 
	注意：此过程所需时间可能从几秒到数小时不等，具体取决于待分析数据的规模。</li>
	<li>查看生成的两个新 .csv 文件中的结果：file_FISH_results 和 file_nuclei_results。第一个文件显示转录斑点的数量及其平均强度和最大强度。&#160;第二个文件提供细胞核总数以及每个细胞核内斑点的数量。</li>
</ol>

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

<ol><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Chal, J., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+muscle%3A+skeletal+myogenesis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro.</a> Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).</li>
<li>Taylor, M. V., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2+and+the+skeletal+muscle+differentiation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mef2 and the skeletal muscle differentiation program.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).</li>
<li>Siles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+imposes+a+temporary+stage-dependent+inhibition+of+muscle+gene+expression+and+differentiation+via+CtBP-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).</li>
<li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li>
<li>Boukhatmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+integrative+model+to+study+the+features+of+musclestem+cells+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration.</a> Cells. 10 (8), 2112(2021).</li>
<li>Bothe, I., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila myogenesis.</a> Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).</li>
<li>Catalani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+is+evolutionary+conserved+in+satellite+stem+cell+activation+and+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration.</a> Cell Death Discovery. 8 (1), 459(2022).</li>
<li>Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+protects+skeletal+muscle+from+damage+and+is+required+for+its+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration.</a> Nature Communications. 10 (1), 1364(2019).</li>
<li>Boukhatmi, H., Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+adult+satellite-like+cells+in+Drosophila+is+maintained+through+a+switch+in+RNA-isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms.</a> Elife. 7, e35954(2018).</li>
<li>Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+muscle+satellite+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila.</a> Elife. 6, e30107(2017).</li>
<li>Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+stem+cell+population+that+generates+Drosophila+flight+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles.</a> Elife. 3, e03126(2014).</li>
<li>Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+and+model+systems+for+their+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells and model systems for their investigation.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).</li>
<li>Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+niche-driven+insulin-Notch-Myc+cascade+reactivates+dormant+adult+muscle+precursors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila.</a> Elife. 4, e08497(2015).</li>
<li>Schonbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+mediates+an+evolutionarily+conserved+switch+to+fibrillar+muscle+fate+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects.</a> Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).</li>
<li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).</li>
<li>Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+transcription+factor+Mef2+has+multiple+roles+in+adult+Drosophila+musculature+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation.</a> Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).</li>
<li>Soler, C., Taylor, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Him+gene+inhibits+the+development+of+Drosophila+flight+muscles+during+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis.</a> Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+distribution+in+skeletal+muscle+is+associated+with+mRNA+size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size.</a> Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388(2021).</li>
<li>Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+transport+is+essential+to+distribute+RNA+and+nascent+protein+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 12 (1), 6079(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+Cell+Atlas%3A+A+single-nucleus+transcriptomic+atlas+of+the+adult+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly.</a> Science. 375 (6584), eabk2432(2022).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoLibJ%3A+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BayFish%3A+Bayesian+inference+of+transcription+dynamics+from+population+snapshots+of+single-molecule+RNA+FISH+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells.</a> Genome Biology. 18 (1), 164(2017).</li>
<li>Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+imaging.+Spatially+resolved%2C+highly+multiplexed+RNA+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.</a> Science. 348 (6233), aaa6090(2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

近年来，smFISH技术的应用日益广泛，已扩展至多种细胞类型和模式生物。然而，在Drosophila中，关于成体肌肉基因表达的大部分知识仍来源于整体分子检测方法，这些方法无法提供mRNA分子精确定位的空间定量信息。为弥补这一空白，我们优化了一种在肌肉前体细胞及成体Drosophila肌肉中进行smFISH的方法。该方法改编自先前发表的实验方案23，并针对Drosophila肌肉组织进行了优化。
获得高质量的smFISH图像的主要障碍是成年肌肉的厚度，这会阻碍探针的充分渗透。因此，必须将成年肌肉从动物的其他组织中分离出来，并在轻微振荡条件下进行杂交过程。这一特定步骤可有效确保组织的通透性。
另一个关键因素是，信噪比可能导致计算流程无法检测到某些mRNA位点。我们发现，通过寻找探针的最佳浓度可以提高信噪比。最佳稀释度可能因每组探针的组成而异，包括偶联染料和寡核苷酸的组成。我们建议尝试不同的稀释度；在本实验中，对于成年组织，200 nM的终浓度获得了最佳的信噪比。
利用smFISH方法，可以对转录位点（TS）焦点处新合成的RNA分子数量进行定量。当一个基因处于活跃转录状态时，多个新生RNA会同时在转录位点（TS）上生成。因此，TS的荧光强度将超过成熟的细胞质RNA，结合其位于细胞核内的特征，这一性质可用于区分TS与单个细胞质RNA信号。在肌肉生物学研究中，检测和定量转录位点对于确定同一合胞体中各个肌核内特定基因转录的同步性尤为重要。然而，本计算流程并未设计用于区分细胞质mRNA与TS信号。作为替代方案，我们建议将该smFISH方法与其他已建立的smFISH分析工具（如BayFISH或FISH-quant29,30）相结合。这些工具已被证实能够以极高的精度实现RNA聚集体的自动分割及荧光强度计算。
最后，尽管smFISH能够以高空间分辨率检测mRNA分子，但它仅限于同时分析少量mRNA。而merFISH（多重误差稳健荧光原位杂交）等多尺度方法则可实现对大量不同mRNA的同时分析31。该方法通过结合寡核苷酸探针与纠错编码技术，能够在单细胞中检测数百种RNA分子。

成年骨骼肌由分化的多核肌纤维构成，其收缩特性可产生运动。肌肉的生长、维持和再生依赖于在胚胎发育过程中被确定的肌源性前体细胞和肌肉干细胞（MuSCs）1。肌源性程序受到一组核心肌源性转录因子（TFs）（如 Pax3/7、MYOD、Mef2 和 ZEB）的精细调控2,3,4。解析调控肌肉生物学的分子机制，对于阐明与肌生物学相关的基本科学问题以及治疗肌肉退行性疾病可能的治疗应用均具有重要意义。
Drosophila 作为研究肌发生遗传学的模式生物有着悠久的历史5。 近年来，它也逐渐成为研究肌肉再生的新模型6,7,8。果蝇与哺乳动物之间的肌肉结构和核心肌生成程序高度保守。例如，转录因子 Mef2 和 Zfh1/ZEB 在调控肌肉发育和再生方面具有保守的功能3,9,10,11。成年 Drosophila 肌肉（如间接飞行肌，IFMs）由一类特定的肌肉干细胞（MuSCs）——即成肌前体细胞（AMPs）——发育而来12。这些 AMPs 在胚胎发育期间被确定，并与翅盘和腿盘等上皮结构相关联。在整个胚胎期和幼虫期，AMPs 保持未分化状态，直到变态期才启动分化并融合形成 IFMs13,14。转录因子 Spalt major（spalt, salm）在飞行肌发育过程中表达，对于决定其结构特性至关重要15。Mef2 是另一个重要的肌源性转录因子，对成年肌肉的形成必不可少16,17。它在 AMPs 中表达，并在成年 IFMs 中持续存在10,18。尽管大多数 AMPs 会分化为功能性肌肉，但有一部分逃避了分化，形成了成年 MuSCs11。与脊椎动物类似，转录因子 Zfh1/ZEB 对于防止成年 MuSCs 过早分化以及维持其干性至关重要9,10。
基因表达动态已被证实可调控多种肌肉生物学过程19,20高通量单细胞和单细胞核RNA测序技术的出现，使得对这些转录动态的全面探索成为可能21,22一个显著的局限性在于这些方法无法提供多核肌纤维中 mRNA 分子的空间分布信息。这些特征可通过单分子荧光技术进行研究 原位 杂交（smFISH）可显示两种类型的mRNA信号：1. 分散在细胞质中的单个mRNA分子，代表成熟RNA；2. 最多两个明亮的核内焦点，对应新生转录本，指示转录活跃的等位基因23因此，smFISH 是单个 mRNA 分子定量、研究其空间分布以及获取基因转录动态快照的首选方法。
单分子荧光原位杂交（smFISH）方法依赖于一组特异性设计为与目标转录本互补的短荧光寡核苷酸探针。在退火后，可产生高强度的点状信号源，从而利用共聚焦显微镜在单分子水平上检测mRNA。24该方法正被 increasingly 应用于多种细胞类型，包括哺乳动物肌肉组织19,20。然而，在 果蝇 与其他动物模型类似，关于成体肌肉基因表达的大部分知识均来源于整体分子检测，这类方法缺乏mRNA分子空间定位的定量信息。本文中，我们优化了一种在肌肉前体细胞和成体组织中进行单分子荧光原位杂交（smFISH）的方法 果蝇 肌肉23,25本方案包含一个完全自动化的分析流程，用于细胞核分割以及mRNA计数与定位。

<table><tbody><tr><td>共聚焦显微镜 SP8</td><td>Leica</td><td>SP8 DMI 6000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带&amp;nbsp;</td><td>Tesa&amp;nbsp;</td><td>57910-00000</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 16%</td><td>Euromedex</td><td>EM-15710</td><td></td></tr><tr><td>Mef2 抗体</td><td>DHSB</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris 探针</td><td>LGC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 杂交缓冲液</td><td>LGC</td><td>SMF-HB1-10</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 A</td><td>LGC</td><td>SMF-WA1-60</td><td></td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 B</td><td>LGC</td><td>SMF-WB1-20</td><td></td></tr><tr><td>Swann-Morton 刀片</td><td>Fisher scientific</td><td>0210</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euromedex</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCD8::GFP 品系</td><td>Bloomington</td><td>RRID:BDSC_5137</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>方形表面皿，1 5/8 英寸&amp;nbsp;</td><td>Carolina</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>Zfh1 抗体</td><td>由 Ruth Leahman 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zfh1-Gal4</td><td>Bloomington</td><td>BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625</td><td></td></tr></tbody></table>

在单分子尺度上研究肌肉转录动态 黑腹果蝇

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

骨骼肌是由大量成束的肌纤维组成的多核合胞体，可产生力量并实现身体运动。 果蝇 是研究肌肉生物学的经典模型。两者的结合 果蝇 遗传学与先进的组学方法推动了调控肌肉形态发生和再生的关键保守分子的发现。然而，这些分子的转录动态及其信使RNA在合胞体内的空间分布无法通过传统方法进行评估。本文中，我们优化了一种现有的单分子RNA荧光原位杂交技术 原位 采用单分子荧光原位杂交（smFISH）方法，以实现对成年飞行肌及其肌肉干细胞中单个mRNA分子的检测与定量。作为概念验证，我们分析了两种进化上保守的转录因子Mef2和Zfh1/Zeb的mRNA表达与分布情况。结果表明，该方法能够有效检测并定量肌肉前体细胞、成年肌肉及肌肉干细胞中这两种转录本的单个mRNA分子。

在本实验方案中，我们使用了 commercially produced probes 靶向 Mef2 和 zfh1 mRNA。我们利用生产商的 FISH 探针设计工具设计了这些探针（材料表）。Mef2 探针组靶向所有 Mef2 RNA 异构体共有的外显子（从外显子 3 到外显子 10）。zfh1 探针组靶向 zfh1-RB 和 zfh1-RE 两种异构体共有的第三个外显子10。两种探针均偶联了 Quasar 670 荧光染料。
我们自行开发了一个与ImageJ软件兼容的宏，用于自动分析原始的.tif数据。该宏通过Cellpose26结合Fiji插件BIOP实现细胞核的三维分割，并利用Trackmate插件中实现的高斯拉普拉斯算法对转录位点进行定量分析27。MorpholibJ插件28用于后续处理（补充文件1）。
作为第一步，我们在翅成虫盘上进行了smFISH实验，其中 Mef2 和 zfh1 已知在AMPs中表达。这些数据表明，使用Mef2或Zfh1抗体共染色的AMPs群体中均可一致检测到这两种转录本。图2A，B）。通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可揭示并区分活跃的转录位点（TS）与成熟mRNA，因为活跃转录位点通常体积更大，荧光信号更强，不同于单个细胞质转录本或成熟的核内转录本. 一致地，对AMPs的高倍放大可区分TS焦点与散布在细胞质中的成熟mRNA图 2A，B），验证了该smFISH方案的灵敏度。然而需要指出的是，我们在两种情况下均观察到每个细胞核中有一个活跃的TS zfh1 和 Mef2 (图2A，B). 这些数据进一步验证了探针设计的准确性，因为 Mef2 和 zfh1 抗菌肽（AMPs）中的转录模式与其相应蛋白质的检测共定位图2).
在第二步中，我们检测了分化后的成年间接飞行肌（IFMs）及其相关干细胞中Mef2和zfh1 mRNA的转录位点及分布情况（图2C，D）。这些数据清晰地显示了Mef2的转录位点位于合胞体肌细胞核内，且Mef2 mRNA在细胞质中广泛分布（图2C，C'）。Zfh1特异性地标记了肌肉干细胞（MuSCs）群体10,11。利用本smFISH实验方案，我们成功检测到由Zfh1-Gal4 &gt; GFP表达标记的MuSCs中的zfh1转录信号。高倍镜图像进一步展示了zfh1的转录位点以及细胞质中单个mRNA分子的检测结果（图2D'）。
最后，我们使用自行开发的 ImageJ 宏对Mef2的转录动态和空间分布进行定量分析。该计算流程能够高效地识别和分割Mef2信号点与肌细胞核（图3A-C）。然而，由于信噪比较低，在某些情况下部分信号点可能无法被检测到（图3A',B'）。我们利用该自动化方法探究Mef2 mRNA 的丰度在肌肉前体细胞（AMPs）与分化的成体间接飞行肌（IFMs）之间是否存在差异。分析结果表明，成体 IFMs 与 AMPs 中每个细胞核内的Mef2 mRNA 数量无显著差异（图3D）。
为了深入了解成年个体间接飞行肌（IFM）肌肉中 Mef2 转录本的空间分布，我们量化了细胞质与细胞核内 Mef2 mRNA 斑点所占的比例（图 3E、F）。利用我们的程序，我们分别统计了 Mef2 mRNA 斑点的总数以及与细胞核染色信号重叠的 Mef2 mRNA 斑点数量（Mef2）。从总的 mRNA 数量中减去与细胞核相关的 mRNA 数量，即可得到细胞质中 mRNA 斑点的数量。研究结果表明，约 92% 的 Mef2 mRNA 存在于细胞质中，而其余 8% 与肌细胞核相关联，如 图 3E、F 所示。
<img alt="果蝇解剖示意图，显示用于显微镜分析的幼虫和成虫胸部制备方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1解剖及制备翅成虫盘和间接飞行肌样本用于单分子荧光原位杂交的实验步骤 (AL3 期幼虫。B幼虫前端解剖并翻转。箭头指示翅盘。C) 离体的翅盘。 (D解剖的成年胸部组织。E成年胸部分裂前固定于双面胶带上（虚线表示切分位置）。F成年半胸区。G分离的间接飞行肌。H) 单分子荧光原位杂交（smFISH）实验流程. 缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；EtOH = 乙醇。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇组织中 Mef2、Zfh1 标记物的荧光显微观察；蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：代表性图像 Mef2 和 zfh1 翅成虫盘和成体间接飞行肌中的单分子荧光原位杂交 (A,B) Mef2 和 zfh1 mRNAs（紫色）在AMPs中均匀分布，并与（A，A') Mef2 和 (B，B') Zfh1 蛋白（绿色），分别。 (A'',B'') AMPs 的高倍放大图像。 (C) Mef2 成年个体飞行肌中可检测到mRNA和Mef2蛋白。C') 方框区域的更高倍数放大图 C. (D) Zfh1-Gal4 &gt;UAS-mCD8GFP 表达（绿色）标记成年 MuSCs。 zfh1 在成年 MuSCs 中检测到 RNA。D') 方框区域的高倍放大图 D. Zfh1 转录起始位点和单个mRNA分别用箭头和箭头头表示。DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 50 µm (A, B, A', B'), 10 µm (A",B",C,D), 5 µm (C'，D'缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；AMPs = 成年肌肉前体细胞；MuSCs = 肌肉干细胞；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFP = 绿色荧光蛋白 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Mef2 转录位点检测；显微图像、细胞核分割、数据分析直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：定量分析 Mef2 通过单分子荧光原位杂交检测转录及细胞质mRNA积累。 (A分布 Mef2 转录本（紫色）和野生型成年间接飞行肌中的 Mef2 蛋白（绿色）。(A') 方框区域的高倍放大图 A转录起始位点和单个mRNA分别用箭头和箭头头表示。B，C自动 Mef2 斑点检测与核分割。细胞质与细胞核 Mef2 mRNA 分别用绿色和品红色表示。B',C') 方框区域的更高倍数放大图 B 和 C. 星号表示宏工具未计数的斑点。D) 示例 Mef2 相对于总细胞核数量的 AMPs 和成年 IFMs 中的斑点定量。（p = 0,0785，Student's） t-检验，翅盘（n = 4），IFMs（n = 11））。E定量分析示例 Mef2 成虫间接飞行肌中的斑点分布。（*** p&lt; 0.0007，Student's t-检验，n = 5)。F) 百分比 Mef2 细胞核内外检测到的 mRNA 斑点（n = 5）。比例尺 = 10 µm (A，A'缩写：IFMs = 间接飞行肌；smFISH = 单分子RNA荧光原位杂交 原位 杂交；AMPs = 成体肌肉前体细胞 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：用于后期处理的宏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/Le%20Roux%20et%20al-Macro.txt" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

Drosophila 是研究调控肌生成关键分子的成熟模型。然而，现有方法尚不足以确定合胞体内部 mRNA 的转录动态及其空间分布。为克服这一局限，我们优化了一种RNA荧光原位杂交方法，可在单分子水平上实现对mRNA的检测与定量。

骨骼肌是由大量成束的肌纤维组成的大型合胞体，可产生力量并实现身体运动。果蝇是研究……的经典模型

在我们的团队中，我们研究了调控肌肉发育与修复的细胞和分子机制。事实上，mRNA分子的特殊分布已被证实可调节多种细胞过程。本研究中，我们采用果蝇作为模型，探究mRNA在飞行肌组织内的空间分布方式。基因表达动态已被证实可调控多种肌肉生物学过程。高通量单细胞和单细胞核RNA测序技术的出现，使得对转录动态进行全面探索成为可能。经典组学技术的一个显著局限性在于无法提供果蝇肌纤维内mRNA分子的空间分布信息。这一特征可通过单分子荧光原位杂交技术进行研究。目前的方法尚不足以确定黑腹果蝇肌肉合胞体内的 mRNA 转录动态及其空间分布。为克服这一局限性，我们优化了一种方法，可在高百分比分辨率和单分子尺度下检测并定量黑腹果蝇肌纤维中的单个 mRNA 分子。目前该领域面临的一个挑战是实时观察活体动物中肌肉再生的动态过程。因此，我们正致力于开发一种活体成像方法，以在肌肉干细胞所处的天然微环境中观察其行为，例如在肌肉再生过程中，研究这些细胞的迁移模式与迁移范围，以及它们的分化过程，并以前所未有的分辨率实现这一目标。首先，用预冷的PBS缓冲液将处于L3阶段的黑腹果蝇幼虫清洗三次，每次五分钟。使用两把尖头镊子夹住幼虫的前部，去除约三分之二的体组织。用一把镊子夹住幼虫的前三分之一部分，另一把镊子夹住口钩，然后将口钩向内拉，直至幼虫完全内翻。去除腿节盘和脑组织，以获得一个干净的倒置幼虫体壳，其气管上附有一对翅盘。将翅盘转移至一个1毫升离心管中。用PBS稀释的4%多聚甲醛在室温下振荡固定翅盘45分钟。固定后，用 70% 乙醇将样品洗涤三次，每次五分钟。去除麻醉果蝇的头部、腹部、腿部和翅膀，将分离的胸部组织置于冷 PBS 中。在 1% Triton 溶液中加入 4% 多聚甲醛，于振荡条件下预固定胸部组织 20 分钟。随后在搅拌条件下，用PBT每次5分钟，洗涤样品三次。将胸部置于载玻片的双面胶带上，并使用锋利的切片刀将其沿中线切开，得到两个半胸体。在搅拌条件下，将半胸体用4%多聚甲醛固定45分钟。在振荡条件下，使用 PBT 每次 20 分钟，清洗样品两次。将半胸部分置于冷 PBS 中，并用镊子小心地从半胸部分离间接飞行肌。在 70% 乙醇中于 4°C 下对肌肉进行透化处理，处理时间为 2 至 7 天。透化后，使用缓冲液A将IFMs洗涤两次，每次20分钟。然后加入400微升杂交缓冲液，在37摄氏度的恒温混匀仪中预杂交肌肉30分钟。加入100微升新鲜配制的含有探针和一抗的杂交缓冲液。将样品在37摄氏度、300 RPM的恒温混匀仪中避光孵育16小时。孵育后，用预热的缓冲液A洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。然后将样品置于含有二抗和DAPI的缓冲液A中，37摄氏度孵育1小时。在将样品转移至显微镜载玻片前，用缓冲液B洗涤三次，每次20分钟。擦去残留的缓冲液B，然后在载玻片上加入30微升封片剂。将一块18 mm × 18 mm的盖玻片盖在载玻片上，并用指甲油封固盖玻片边缘。开启配备40倍和63倍油镜物镜的共聚焦显微镜后，将载玻片置于显微镜载物台上。为了成像翅盘相关肌肉前体细胞和间接飞行肌（IFMs），设置DAPI的激发波长为405 nm，发射波长为450 nm。然后选择Alexa Fluor 488，其激发波长为496 nm，发射波长为519 nm，以及用于smFISH探针的Quasar 670，其激发波长为647 nm，发射波长为670 nm。使用DAPI信号和紫外灯定位样品。将捕获的图像保存为 TIF 文件。为成年肌肉干细胞成像时，按照先前所示方法设置 DAPI 和 Alexa Fluor 88 的激发和发射波长。然后为 smFISH 探针设置 Alexa Fluor 555 和 Quasar 670 的波长。定位样本并将捕获的图像保存为 TIF 格式。启动 ImageJ，然后转到“插件”菜单。选择“宏”，然后选择“编辑”以打开宏的源代码。为了定量分析幼虫中的 Mef2 单分子荧光原位杂交（smFISH）信号点，将对数半径设置为 3，对数质量设置为 20。然后使用 2 的模糊值、30 的细胞核尺度参数、8 的细胞核阈值和 300 的细胞核大小来分割 Mef2 阳性细胞核。通过执行运行命令来启动宏程序。该宏将自动加载指定文件夹中的所有图像，并依次进行量化。在肌纤维分析中，将对数半径设为2.5，对数质量设为60，模糊度设为2，细胞核尺度参数设为100，细胞核阈值设为0，细胞核大小设为300。通过执行运行命令来启动该宏。该宏将自动加载指定文件夹中的所有图像，并依次对其进行定量分析。分析完成后，请检查文件 FISH_results 和文件 nuclei_results 中显示的结果。Mef2 和 zfh1 转录本在 AMP 细胞群中被均匀检测到，并分别与 Mef2 和 zfh1 蛋白共定位。更高倍数的放大观察AMPs可区分转录位点的焦点与散布在细胞质中的成熟mRNA。类似地，在分化的成年IFMs及其相关干细胞中检测了Mef2和zfh1 mRNA的转录位点及分布情况。自主开发的ImageJ宏程序有效检测并分割了Mef2信号点和肌细胞核。成年IFMs和AMPs中每个细胞核的Mef2 mRNA定量分析结果无显著差异。Mef2斑点分布的定量结果显示，92%的Mef2 mRNA存在于细胞质中，8%与肌细胞核相关。

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