Name: 用于单核多组学检测的高质量脑和骨髓核制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习优化小鼠脑和骨髓组织的细胞核分离方案，用于单核多组学检测。该方法将脑核纯度从36%提升至近100%，为单细胞转录组学研究提供高质量测序数据。

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Ana Jeemin Choi 获得了巴斯德研究所—巴黎大学（PPU）国际博士项目提供的津贴资助。

High-Quality Sample Preparation for Multiome 10X Genomics Analysis

<ol><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).</li>
<li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+techniques%3A+From+conception+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+chromatin+accessibility+and+gene+expression+in+thousands+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.</a> Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).</li>
<li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).</li>
<li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).</li>
<li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection%3A+A+key+role+for+IL-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).</li>
<li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP%CE%B2-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).</li>
<li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer%27s+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li>
<li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).</li>
<li>10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Meyerhoff,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+monocyte+and+macrophage+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).</li>
<li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), e498(2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).</li>
<li>Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Gérard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

制备高质量的细胞或细胞核悬液对于单细胞或单细胞核RNA测序以及单细胞多组学分析的成功至关重要29,30,31。本文中，我们描述了从两种组织类型——脑组织和骨髓——制备样本及分离细胞核用于多组学检测的实验方案。
本文所述的脑组织实验方案可从新鲜冷冻的脑组织中分离出高质量的细胞核。该方案包括以下步骤：冷冻组织破碎、细胞核分离、细胞核纯化以及制备样品的质量控制。脑组织由多种不同类型的细胞组成，因此组织解离和细胞核分离过程应保持初始组织中各类细胞群体的原有比例。本实验优化了裂解缓冲液的成分和孵育时间，以实现对构成组织的所有细胞群体进行彻底且温和的裂解。
骨髓HSPC实验方案略有不同，因为在实验开始时需要增加一个步骤，即从异质性细胞悬液中分离出目标细胞群体。在采集新鲜组织后，裂解红细胞，并对样本中目标细胞亚群进行富集。随后裂解目标细胞，分离细胞核，并对所制备材料的质量进行检测。
10X Genomics 提供了多种经过验证的适用于不同组织的细胞核分离方案32,33。该公司还商业化推出了一款细胞核分离试剂盒，可对已验证的组织类型提供简便的细胞核分离流程34。然而，这些方案仍需进一步优化，以适应特定样本的特性。例如，某些样本需要在低细胞投入量条件下操作。对于此类样本，最具挑战性的步骤是离心过程——必须足够严格以确保样本清洁，同时又需足够温和以避免细胞/细胞核的损失。本文所述方案对 10X Genomics 已验证方案——单细胞多组学 ATAC + GEX 测序的细胞核分离（CG000365 - Rev C）27 进行了优化，实现了上述两项要求之间的良好平衡。如从分选的 HSPC 制备细胞核的示例所示，我们在不降低样本质量的前提下显著提高了细胞核的回收率。
另一个挑战是裂解纯化细胞以分离细胞核的步骤。过于剧烈的裂解条件或过长的孵育时间可能会损伤细胞核，从而影响测序数据的质量。图5展示了骨髓样本在不同裂解缓冲液孵育时间后的代表性细胞核成像，说明了细胞裂解条件不同时细胞核状态的差异。以HSPCs为例，我们确定3分钟的裂解时间为最佳条件，此时形态健康、完整的细胞核比例最高，而受损细胞核的比例最低。对于每种新类型的样本，均应优化裂解孵育时间。
<img alt="显微镜下的寄生虫生活周期阶段；显微图像比较；比例尺为 5 μm；生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过显微镜进行细胞核质量控制。图中显示从小鼠骨髓分离的代表性明场图像，其中（A）为完整细胞核，（B）为受损细胞核。比例尺 5 µm。图像使用倒置显微镜，配备 40x ELWD NA 0.60 物镜和 1.5x 数字变焦拍摄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究中详述的两种方案均依赖于使用高通量FACS仪器对目标细胞或细胞核进行分选。这一步骤在单细胞/单细胞核制备方案中至关重要，尤其是在需要从异质性细胞悬液中分离稀有细胞亚群时。与本文所示造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分选示例类似，可能需要采用高维流式细胞术 panel，以实现对目标细胞群体的“设门”分析。该分选过程极为快速且准确，可获得纯度超过95%的分选细胞亚群。然而，该方法会使细胞悬液承受高达70 psi的压力，因此在分选脆弱细胞（例如树突状细胞、中性粒细胞）时可能受限，因为高压可能导致细胞膜破裂。在此类情况下，应选择其他细胞纯化方案，包括磁珠分选、新一代仪器（例如CellenOne、Cellenion；MACSQuant Tyto、Miltenyi）35，36，或基于液滴的系统（例如ODIN、Sensific）37。然而，这些技术的分选速度较慢，分选过程往往持续数小时而非数分钟，因此在需要处理大量细胞以制备活细胞用于Multiome及其他单细胞应用时，其应用受到显著限制。
对于从组织中分离的细胞核进行纯化，流式细胞分选（FACS）是首选方法，因其具有高通量以及可获得高纯度的分离产物。细胞核对压力不敏感，因此经过滤处理的组织样品可轻松通过细胞分选仪进行纯化。如果实验室未配备FACS仪器，也可采用其他替代方法，虽然效率略低，但效果足够良好。例如超速离心法，或使用小型设备如MARS（Applied Cell），该设备利用颗粒大小差异并通过声波实现分离；CURIOX层流清洗仪，利用细胞/细胞核悬液的疏水特性进行分离；或LEVITAS bio，该技术基于细胞的物理特性（磁悬浮）将细胞与碎片分离。
本文所述方案旨在获得高数量和高纯度的细胞核，以满足后续Multiome实验的要求。由于FACS分选和多次离心步骤会导致初始材料大量损失，因此本文所描述的脑组织细胞核制备方案要求起始材料必须足够丰富，以确保在FACS分选后至少能收集到50万个细胞核。如果无法满足该条件，则应采用其他替代方案。当处理稀有细胞群体或小块组织样本时，初始材料的数量可能成为限制因素。为解决这一问题，可通过以下方式提高细胞核回收率：（a）减少裂解液体积，（b）减少洗涤液体积，（c）仅进行一次洗涤并延长离心时间，以尝试提高回收率，具体操作可参考10X Genomics公司针对低细胞输入量细胞核分离的方案。对于低样本量的多组学分析，可考虑使用基于孔板的技术，如scNMT、SNARE-seq和Paired-seq38，这些方法对起始样本量的需求显著更低。
综上所述，我们描述了两种用于制备脑组织和骨髓造血干细胞及祖细胞（HSPCs）细胞核以进行后续Multiome分析的可靠方案。这些方案适用于任何需要从上述两种组织中获得高质量单细胞核悬液的科研项目，而不论其具体的科学问题如何。本课题组已将脑组织细胞核分离方案应用于靶向基因失活后脑发育的研究，以及神经系统疾病背景下免疫反应的研究。我们还利用骨髓细胞核分离方案来解析不同造血亚群在免疫系统建立过程中的作用。

多年来，单细胞技术一直是分析生物过程的金标准。最初，这些技术仅限于通过显微镜、流式细胞术及类似检测手段进行单细胞表型分析。单细胞分析领域的一项重大突破来自于单细胞分子谱型技术的发展，特别是单细胞RNA测序（scRNA-Seq），该技术使得研究人员能够表征单个细胞的整个转录组。scRNA-Seq功能强大，可提供特定条件和时间点下单个细胞转录状态的信息。然而，它无法揭示驱动转录的基因调控机制，也无法反映随时间发生的分子修饰变化。为了克服这一局限，研究人员已投入大量努力，致力于开发单细胞多组学检测技术，以实现对同一细胞中多种因素和过程的联合分析1,2,3,4。首次在单细胞内成功实现两种模态联合检测，是通过CITE-Seq方法将多重表面蛋白表达模式与单个细胞的全转录组信息关联起来实现的5。更近期的发展则将基因表达与染色质可及性（利用测序技术检测转座酶可及染色质，ATAC-Seq）相结合，从而在同一细胞中同时捕获转录组和表观基因组信息（例如sci-CAR）6。首个实现将转录组学与同一细胞的表型或表观遗传变化相关联的商业化解决方案来自10X Genomics。
单细胞分子谱型分析实验包含以下步骤：（1）组织解离或制备单细胞悬液；（2）细胞纯化和/或细胞核分离；（3）分区与条形码标记；（4）文库构建与质量控制；（5）高通量测序；（6）数据分析。尽管步骤（3）至（6）会因所采用的技术不同而有显著差异，但初始步骤在各类方法中通常具有共性。所制备的细胞/细胞核悬液的质量将决定实验的整体结果。根据组织类型的不同，获得高质量的单细胞/细胞核悬液可能具有挑战性。某些组织（如心脏、肌肉、脑、肺、肠道等）具有特殊性，需要针对每种样本类型优化组织破碎和细胞核分离方法，以确保为分子分析提供高质量的细胞核7,8,9,10。组织破碎和解离的方法可以是机械法、酶解法（例如胶原酶和DNase的混合物），或两者结合，可手动操作，也可借助仪器完成（例如Qiagen DSC-400、gentleMACS）。
单细胞技术已成为生物医学研究的首选工具。在神经生物学领域，脑内细胞类型的多样性及其功能的复杂性需要高分辨率和高通量的分析方法，以实现对稀有细胞群体的可视化并评估其异质性11,12,13,14。将单个细胞的身份与其基因调控机制相联系，有助于深入理解脑的发育过程和生理功能。另一个典型例子是针对感染性疾病、自身免疫病或癌症背景下免疫应答的研究，这些研究高度依赖于单细胞分析。免疫细胞亚群具有高度异质性，其活性及与其他细胞类型的相互作用也极为复杂，因此必须在单细胞分辨率下解析免疫应答背后的机制。免疫细胞起源于骨髓，其中造血前体细胞由逐步分化的细胞组成，这些细胞在分步发育过程中不断获得或丢失细胞表面标志物，最终离开骨髓迁移至外周组织。单细胞分析能够对细胞发育阶段进行精细表征，传统上可通过多参数流式细胞术实现单细胞表型分析。然而，单细胞转录组特征已被证明能更精确地鉴定前体细胞亚型，因为这些细胞在空间上呈簇状分布且存在重叠，若采用粗略的细胞表面标志物策略则容易导致误判15。越来越多的研究揭示了造血干细胞和前体细胞（HSPCs）在接触各种外界因子后可能获得的表观遗传修饰，这些修饰对免疫系统的长期应答能力产生显著影响16,17,18,19。新兴的多组学技术使得以单细胞分辨率研究这些过程成为可能。
已有多种针对脑组织11,20,21,22和骨髓样本23,24的细胞及细胞核分离方案被报道。为最大限度减少因实验变异带来的偏差，有必要对单细胞核制备方案进行优化和验证，以适用于联合单细胞转录组和表观基因组测序，从而确保单细胞多组学检测的可重复性。
本文介绍了两种用于制备细胞核的可靠方案，分别适用于（1）新鲜冷冻的脑组织和（2）新鲜骨髓造血干细胞与祖细胞（HSPC），以用于后续的单细胞多组学（Multiome）分析（图1）。
<img alt="小鼠脑组织和骨髓细胞核分离流程图；展示实验方案的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：从新鲜冷冻的脑组织和骨髓组织中分离细胞核的实验方案示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>18 G × 1 &amp;frac12; (1.2 mm × 38 mm) Agani 针头</td><td>Terumo</td><td>AN*1838S1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底 FACS 管，带 35 &amp;micro;m 细胞筛帽</td><td>falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD pharmagen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD117 (c-Kit)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td>克隆：2B8</td></tr><tr><td>APC/Cyanine 7 抗小鼠 CD16/32 (Fc&amp;gamma;R)</td><td>BioLegend</td><td>101328</td><td>克隆：93</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件 v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp; 10% 储存液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 相机 Prime 95B 25 mm</td><td>Photometrix</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 mm × 24 mm 0.13–0.17 mm</td><td>Brand</td><td>BR470819</td><td></td></tr><tr><td>5% 皂苷</td><td>Invitrogen</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片&amp;nbsp;</td><td>Swann-Morton&amp;nbsp;</td><td>0508</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1×) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10×)</td><td>Gibco</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Ti2-E 倒置落射荧光显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30123603</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>83801.290</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 CD34</td><td>Invitrogen</td><td>11-0341-85</td><td>克隆：RAM34</td></tr><tr><td>解剖镊子</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>11533387</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器 2 mL</td><td>Bellco glass</td><td>1984-10002</td><td>研杵 &amp;ldquo;A&amp;rdquo; 大间隙：.0030–.0050&amp;Prime; 和研杵 &amp;ldquo;B&amp;rdquo; 小间隙：.0005–.0025&amp;Prime;</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>1 M 氯化镁溶液</td><td>Sigma aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>封片剂 Fluoromount-G&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代物</td><td>Sigma aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>20× 细胞核缓冲液&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>细胞核分离试剂盒 EZ prep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NUC-101</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads 补偿微珠</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>太平洋蓝抗小鼠谱系混合抗体&lt;br/&gt;（包括抗小鼠 CD3、Ly-6G/Ly-6C、CD11b、CD45R/B220、TER-119）</td><td>BioLegend</td><td>133310</td><td>克隆（顺序与上述抗体一致）：17A2、RB6-8C5、M1/70、RA3-6B2、Ter-119</td></tr><tr><td>PCR 管条 0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>122507</td><td>克隆：E13-161.7</td></tr><tr><td>培养皿 100 mm × 20 mm OPTILUX</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>0.01% 多聚赖氨酸，无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>8 孔带编号打印载玻片，孔径 6 mm</td><td>Epredia</td><td>ER-301B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质 LoBind 管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>重组 RNase 抑制剂 5000 U</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>5 M 氯化钠溶液</td><td>Sigma aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，PES，0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油&amp;nbsp;</td><td>任意品牌</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 盐酸溶液 pH 7.4</td><td>Sigma aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad&amp;nbsp;</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

单细胞分析已成为解析生物过程复杂性的首选方法，这类生物过程需要以单细胞分辨率评估个体细胞对处理或感染的反应变异性。
在过去10年中，已开发出多种单细胞分子谱分析技术，其中一些专门的技术已实现商业化。10X Genomics基于微滴的单细胞分析技术是一种广泛应用的技术，可提供即用型试剂，用于转录组及多组学单细胞谱分析。该技术包含单细胞和单细胞核RNA测序（分别简称scRNA-Seq和snRNA-Seq）、scATAC-Seq、单细胞免疫谱分析（BCR/TCR测序）以及多组学（multiome）的工作流程。其中，多组学技术可整合来自同一个细胞的转录组（scRNA-Seq）和表观遗传信息（scATAC-Seq）。
通过上述任一方法从组织中分离并分析的单细胞或单细胞核悬液的质量（活性、完整性、纯度）对于获得高质量数据至关重要。因此，样品制备方案应根据每种生物组织的特性进行优化，以确保获得高质量的细胞和细胞核悬液。
本文介绍了两种用于制备脑组织和骨髓样本以进行下游10X Genomics多组学（multiome）分析流程的实验方案。这些方案按步骤逐步进行，涵盖了组织解离、细胞分选、细胞核分离以及所制备的细胞核悬液的质量控制，后者将作为细胞分选与条形码标记、文库构建和测序的起始材料。这些标准化的实验方案可生成高质量的细胞核文库，并获得稳定且可靠的数据。

上述两种方案详细描述了从两种不同类型的组织中分离细胞核的步骤。图1以示意图形式展示了这两种方案的差异与相似之处。
小鼠脑组织细胞核的纯化 
本文所述方案中，我们提出一种温和的方法，用于从脑组织样本中制备细胞核。该方法首先在裂解缓冲液中对脑组织进行机械性解离，随后通过洗涤和滤网过滤步骤，去除悬液中残留的组织碎片。接着利用流式细胞分选（FACS）去除碎片、未裂解的细胞及小颗粒，以确保仅有纯化的细胞核被用于后续的Multiome实验流程。图2展示了分选前后细胞核的特征图谱。在过滤后、细胞核分选前，样本中含有大量碎片，其中超过99%的“单细胞”呈细胞核染料（7-AAD）阳性，表明细胞裂解效果理想（图2A）。细胞核根据7-AAD阳性门控进行分选，并采集部分分选产物以验证所制备细胞核的纯度。图2B展示了脑细胞核分选后的图谱。通过细胞核分选，细胞核纯度从初始的36%（图2A）提高至近100%（图2B）。
<img alt="使用7-AAD进行流式细胞术分析，显示用于细胞活力评估的SSC-A与7-AAD点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图2"> 
图2：细胞核分选及分选后纯度检测的设门策略。 细胞核经7-AAD染色后由细胞分选仪获取。(A) 首先根据细胞核的大小和颗粒度（分别为FSC-A和SSC-A）进行设门，随后根据FSC-A/FSC-H特性及7-AAD染色情况筛选单个粒子。( B) 细胞分选后，取收集管中部分细胞核采用与A相同的设门策略进行纯度检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
小鼠骨髓造血干细胞前体（HSPCs）的纯化 
从骨髓中分离后，根据图3A所示的设门策略，通过FACS分选最多2 × 105个HSPCs。分选效率和样品纯度通过分析进行评估（图3B）。
<img alt="流式细胞术流程图，使用SSC-A和FSC-A鉴定白细胞和髓系前体细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：骨髓HSPC分选的设门策略。（A）用于分选活的LKS+造血干细胞和CD34+髓系前体细胞以进行细胞核分离的代表性FACS设门策略。（B）用于验证分选后细胞群纯度的代表性FACS图。图中显示的是各细胞亚群相对于其亲本群体的比例。*两个已分选的细胞群。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
“低细胞量细胞核分离”方案可用于从最多105个细胞的样本中分离细胞核。该方案包含较少的离心步骤，从而最大限度地减少细胞/细胞核的损失。我们根据细胞输入量按比例调整了裂解缓冲液和洗涤缓冲液的体积，并延长了离心时间以实现细胞核的最大回收率。我们进行了预实验，通过计数评估回收细胞核的数量，并通过流式细胞术和显微成像评估其质量。图4显示了细胞裂解后的HSPC样本。如图5A所示，该方案获得了高质量的细胞核，且无任何可能影响后续多组学实验流程的碎片。
<img alt="流式细胞术分析示意图、细胞分选过程、7-AAD染色、组织样本鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：分离的骨髓HSPC细胞核的纯度检测分选。细胞核经7-AAD染色后由细胞分选仪采集。首先根据细胞核的大小和颗粒度（分别为FSC-A和SSC-A）设门，以评估样本纯度。图中所示为相对于亲代群体的细胞核比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>管编号</td>
			<td>管名称</td>
			<td>染色目标</td>
			<td>染色目标用量</td>
			<td>抗体/染料 (µL)</td>
			<td>收集缓冲液 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>未染色</td>
			<td>细胞</td>
			<td>500,000</td>
			<td>不适用</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色剂</td>
			<td>细胞</td>
			<td>500,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Lineage Cocktail</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：流式细胞仪补偿设置所需的单染对照。 表中列出了所需的单染对照、应染色的细胞或微球数量以及抗体用量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>主混合液</td>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度稀释倍数</td>
			<td>抗体/染料 (µL)</td>
			<td>缓冲液类型</td>
			<td>缓冲液 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">混合液1</td>
			<td>APC/Cyanine 7 标记抗小鼠 CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">DPBS</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">混合液2</td>
			<td>Pacific Blue 标记抗小鼠 Lineage 混合抗体</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">FACS 缓冲液</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 标记抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC 标记抗小鼠 CD117 (c-Kit)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC 标记抗小鼠 CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>总染色体积</td>
			<td>600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：骨髓HSPC染色混合液的组成。 显示的是对一个含有4000万个细胞的样本进行染色所需的试剂体积。若需染色更多样本，将所示体积乘以所需样本数量，并额外增加半个样本体积，以确保配制的主混合液体积充足。
补充图1：骨髓细胞分离方案。（A）切开腹膜。白色虚线表示应沿其切割的切口线。（B）剥去后肢皮肤后，将剪刀沿髋关节处的脊柱方向贴合，完整剪下后肢，注意不要剪断股骨。（C）在去除肌肉前，从身体分离下来的后肢外观。（D）去除肌肉后的后肢外观。（E）在膝关节处分离股骨，随后在髋关节处分离，操作时注意不要切开股骨。白色弯曲箭头表示所需操作动作。白色虚线箭头指示需用剪刀轻轻夹取并分离的区域。（F）用剪刀牢固夹住软骨和远端骨骺，向后翻转，以打开股骨远端（即先前在膝关节处与胫骨相连的部分），暴露骨髓。（G）在暴露的骨骺端应可见四个突起，由黑色箭头指示。（H）将开口端朝下插入置于含150 µL FACS缓冲液的1.5 mL管内的0.5 mL预置管中，股骨的外观。（I）在12,000 xg条件下短暂离心后，骨髓细胞沉淀以及变为白色的股骨外观。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。

单细胞分析已成为解析需要评估异质性的复杂生物过程的首选方法。

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于单核多组学检测的高质量脑和骨髓核制备

肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。...

从新鲜冷冻脑肿瘤组织中分离细胞核用于单核RNA测序和ATAC测序

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x...

优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序

脑组织的细胞异质性对染色质中表观遗传标记的研究构成了显著限制，因为大多数检测方法缺乏单细胞分辨率。神经元通常与胶质细胞及其他非神经元细胞混杂在一起。本文提供了一种从人脑中提取和收集神经元细胞核的实验方案。...

从人死后脑组织中分离神经元细胞核

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

本文介绍了一种用于研究造血细胞归巢至骨髓微环境的实验方案。...

造血细胞向骨髓的归巢

我们描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从死后人脑颞上回第三层的同质细胞群体——锥体神经元中分离并提取RNA的方法。随后，我们对mRNA进行线性扩增（基于T7系统），并将样本杂交至Affymetrix人类X3P微阵列。...

从人死后脑组织的单细胞群体中获取高质量RNA

基于亲和力的标记细胞核分离 果蝇 用于基因表达分析的组织样本

破骨细胞是体内主要的骨吸收细胞。能够大量分离破骨细胞，已显著推动了对破骨细胞生物学特性的理解。在本方案中，我们描述了一种分离、培养及定量破骨细胞活性的方法 体外.

小鼠骨髓来源的破骨细胞分化

学习优化小鼠脑和骨髓组织的细胞核分离方案，用于单核多组学检测。该方法将脑核纯度从36%提升至近100%，为单细胞转录组学研究提供高质量测序数据。

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

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