Name: 人诱导多能干细胞分化为间充质基质细胞的两种代表性方法比较 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解人诱导多能干细胞分化为间充质基质细胞的单层培养法和拟胚体培养法两种代表性方法，比较其成骨、成脂和成软骨分化能力差异，为遗传疾病模型构建和干细胞治疗研究提供实验参考。

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我们非常感谢毛实验室和胡实验室所有过去和现在的成员，感谢他们对本项目提出的富有启发性的讨论和重要贡献。感谢中国国家儿童健康临床研究中心给予的大力支持。本研究由国家自然科学基金（项目编号 U20A20351，负责人：Jianhua Mao；项目编号 82200784，负责人：Lidan Hu）和中国浙江省自然科学基金（项目编号 LQ22C070004，负责人：Lidan Hu）提供经费支持。

1. hiPSCs 的培养与维持
<ol>
	<li>hiPSC 的解冻
	<ol>
		<li>从液氮中取出细胞，在 37 °C 水浴中快速解冻。将正在解冻的细胞转移至已加入 3 mL iPSC 维持培养基的 15 mL 离心管中（材料表）。轻轻混匀培养基。</li>
		<li>在 300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用含 10 µM Y-27632 的 1 mL iPSC 维持培养基轻柔重悬细胞（用移液器吹打 2–3 次）。</li>
		<li>将细胞悬液转移至预先包被了生长因子减少型（GFR）-细胞外基质胶（1:100）并已加入 2 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中（约 4 x 104 个细胞/cm2）。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 5–6 天（至 80%–90% 汇合度），每天更换 iPSC 维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSC 的传代
	<ol>
		<li>从 6 孔板中移除 iPSC 维持培养基。用 DPBS 洗涤 hiPSC 一次。</li>
		<li>加入 700–800 µL 的 0.48 mM EDTA 溶液，在室温（RT）孵育 1 分钟，然后移除消化液。继续在 37 °C 孵育 3–5 分钟。</li>
		<li>当细胞消化成片状时（切勿将细胞消化为单细胞状态），加入 1 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基以终止消化。小心地用移液器吹打细胞 2–3 次。</li>
		<li>将细胞悬液转移至预先包被了生长因子减少型（GFR）-细胞外基质胶（1:100）并已加入 2 mL 含 10 µM Y-27632 的 iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中。 
		注：传代比例范围为 1:6 至 1:20（约 4 x 104 个细胞/cm2），平均细胞聚集体大小约为 50–200 µm。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养至 80%–90% 汇合度（5–6&#160;天），每天更换 iPSC 维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过拟胚体形成实现hiPSCs向MSCs的分化
注意：该方法源自以往文献21,22,23,24。图1展示了该方法的总体流程。表1总结了该方法的特点。
<ol>
	<li>培养基的制备
	<ol>
		<li>通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutaMAX、10%（v/v）FBS、10 ng/mL FGF2和5 ng/mL TGFβ，制备MSC分化培养基。</li>
		<li>通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutMAX、10%（v/v）FBS和1 ng/mL FGF2，制备MSC维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSCs 的制备
	<ol>
		<li>将hiPSC细胞系（解冻后至少传代2-3次）接种于经生长因子减少型（GFR）-细胞外基质凝胶（1:100稀释）包被的6孔组织培养板中，使用iPSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 直至细胞融合度达到80%–90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第0天：EB形成
	<ol>
		<li>从6孔板中移除iPSC维持培养基，用DPBS清洗hiPSC细胞一次。</li>
		<li>加入700–800 µL的0.48 mM EDTA溶液，在室温下孵育1分钟，然后去除消化液。继续在37 °C下孵育3–5分钟。</li>
		<li>当细胞被消化成细胞片层时（不要将细胞消化成单细胞），加入2 mL iPSC维持培养基（含10 µM Rock抑制剂和1:100 GFR-细胞外基质凝胶）以终止消化。</li>
		<li>将细胞转移至6孔低吸附培养板中。按2孔普通组织培养板对应1孔低吸附培养板的比例接种细胞。于37 °C、5% CO₂条件下，在摇床（60 rpm/min）中培养细胞。2 培养24小时以形成球形胚体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天至第7天：EB分化
	<ol>
		<li>用巴斯德吸管将EBs转移至离心管中（避免破坏EBs），在室温下静置5-10分钟，使其自然沉降，随后吸除上清液。</li>
		<li>将拟胚体转移至含2 mL间充质干细胞分化培养基的6孔低吸附板中。将拟胚体置于摇床中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 培养7天，期间换液一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第8天至第17天：EB接种
	<ol>
		<li>用巴斯德吸管将拟胚体转移至离心管中（避免破坏拟胚体），静置5–10分钟使拟胚体自然沉降，随后吸除上清液。</li>
		<li>将拟胚体转移至含2 mL间充质干细胞维持培养基的GFR-细胞外基质凝胶包被的6孔板中。细胞贴壁后定期更换培养基，培养至90%融合度（约10天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第18天至第27天：MSCs的成熟与扩增
	<ol>
		<li>将EB来源的培养物用解离溶液在37 °C处理5–10分钟（消化时间因细胞类型不同而有所差异）。</li>
		<li>当部分细胞消化成单细胞时，加入2 mL间充质干细胞维持培养基终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS洗涤残留未消化的细胞一次，再次进行消化。重复数次，直至所有细胞均消化成单细胞。将细胞悬液在250 x g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞接种于明胶包被的培养皿中（约 2 x 105 细胞/厘米²2培养至90%融合度，期间定期更换间充质干细胞维持培养基。此时将该代细胞记为第0代（P0）。</li>
		<li>为了获得纯化的MSC&#160;并保持成熟状态，每约6天以1:3的传代比例连续传代两次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过单层培养法将hiPSCs分化为MSCs
注意：该方法源自先前的文献25,26,27,28。图1展示了该方法的总体流程。表1总结了该方法的特点。
<ol>
	<li>培养基的制备
	<ol>
		<li>通过在α-MEM中添加1%（v/v）GlutMAX、10%（v/v）FBS和1 ng/mL FGF2，制备MSC维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSCs 的制备
	<ol>
		<li>将hiPSC细胞系（解冻后至少传代2-3次）接种于经生长因子减少型（GFR）-细胞外基质凝胶（1:100稀释）包被的6孔组织培养板中，使用iPSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 直至细胞融合度达到50%–60%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第0天至第13天：通过直接单层培养法进行分化
	<ol>
		<li>从6孔板中移除iPSC维持培养基。</li>
		<li>直接加入2 mL MSC维持培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养14天2, 每天更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第14天至第35天：通过反复传代实现间充质干细胞成熟
	<ol>
		<li>在37 °C下用解离溶液处理单层培养物5-10分钟（消化时间因细胞类型不同而有所差异）。</li>
		<li>当细胞消化为单细胞时，加入2 mL间充质干细胞维持培养基以终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS洗涤残留未消化的细胞一次，再次进行消化。重复数次，直至所有细胞均消化为单细胞。将细胞悬液在250 x g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞接种于明胶包被的培养皿中（约 2 x 105 细胞/厘米²2培养至90%融合度，期间定期更换间充质干细胞维持培养基。此时将该代细胞记为第0代（P0）。</li>
		<li>为了获得纯化的MSC&#160;并使其成熟，在约18天内以1:3的传代比例连续传代6次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分析hiPSC诱导的MSCs的表面抗原
注意：与骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的表面抗原类似，由人诱导多能干细胞（hiPSCs）诱导而来的间充质干细胞表达CD105、CD73和CD90，但不表达CD45和CD3429。此外，hiPSCs可作为阴性对照细胞。通过流式细胞术对hiPSC诱导的间充质干细胞及hiPSCs进行的表面抗原分析结果见图2。
<ol>
	<li>用解离液在37 °C下处理驱动hiPSC的MSCs，持续2-3分钟。用0.48 mM EDTA解离试剂处理hiPSCs，在室温下孵育1分钟，然后去除解离试剂。继续在37 °C下孵育3-5分钟。</li>
	<li>当细胞消化为单细胞时，加入培养基（间充质干细胞用MSC维持培养基，诱导多能干细胞用iPSC维持培养基）以终止消化。</li>
	<li>将细胞悬液在350 x g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
	<li>用预冷的DPBS洗涤细胞一次，350 x g离心 g 5 分钟后，移除上清液。</li>
	<li>计数并将细胞在冰冷的10% FBS-DPBS（v/v）溶液中重悬，浓度为10 × 10⁶6 细胞/mL，并将100 µL细胞悬液（1 × 10⁶ 细胞/管）分装至各管6 细胞/管）加入1.5 mL离心管中。</li>
	<li>向100 µL细胞悬液中加入5 µL人Fc受体阻断液，在室温下孵育5–10分钟，以进行非特异性阻断。</li>
	<li>350 x g 离心 g 5 分钟后移除上清液。用预冷的 2% FBS-DPBS（v/v）溶液洗涤细胞两次。</li>
	<li>用预冷的100 µL含2% FBS的DPBS（v/v）溶液重悬细胞。</li>
	<li>加入 5 µL（1 次检测）抗 CD34-FITC 和 5 µL（1 次检测）抗 CD45-APC 至 100 µL 细胞中 
	悬浮。向另一个含有100 µL细胞悬液的管中加入5 µL（1次检测）抗-CD73-APC、5 µL（1次检测）抗-CD90-FITC和5 µL（1次检测）抗-CD105-PE。向第三个含有100 µL细胞悬液的管中加入5 µL人IgG1同型对照FITC、人IgG1同型对照PE和人IgG1同型对照APC。冰上避光孵育15–20分钟。同时，准备单染微球。</li>
	<li>用预冷的2% FBS-DPBS（v/v）溶液洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入300 µL预冷的2% FBS-DPBS（v/v）溶液重悬细胞，经200目筛网过滤。</li>
	<li>使用流式细胞术分析样品。先分析经同型对照抗体染色的细胞悬液并设门，然后分析经目标抗体染色的细胞悬液。</li>
</ol>
5. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的成骨分化
注意：驱动 hiPSC 的 MSCs 具有成骨分化潜能（图 3A、B）。以下为成骨分化的实验方案。
<ol>
	<li>通过在α-MEM中添加10% FBS、100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和100 µM抗坏血酸，制备成骨诱导培养基。</li>
	<li>将1 × 105个MSC接种至明胶包被的48孔板中，培养至细胞融合度达到60%–70%。</li>
	<li>吸除培养基，加入0.3 mL成骨诱导培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养14天，每3天更换一次培养基。</li>
	<li>吸除培养基，用DPBS洗涤一次。</li>
	<li>加入0.3 mL 4%多聚甲醛，室温孵育30分钟。</li>
	<li>去除多聚甲醛，用0.3 mL DPBS在室温下洗涤细胞10分钟，重复3次。</li>
	<li>吸除DPBS，加入0.2 mL茜素红染色液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>去除染色液，用0.3 mL DPBS在室温下洗涤细胞10分钟，重复3次。</li>
	<li>在光学显微镜下观察钙沉积的染色情况。</li>
</ol>
6. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的脂肪向分化
注意：驱动 hiPSC 的 MSCs 具有成脂分化潜能（图 3C，D）。以下为成脂分化方案。
<ol>
	<li>通过在α-MEM中添加10% FBS、1 µM地塞米松、1 µM IBMX、10 µg/mL胰岛素和100 µM吲哚美辛，制备成脂诱导培养基。通过在α-MEM中添加10% FBS和10 µg/mL胰岛素，制备成脂维持培养基。</li>
	<li>将1 × 105个MSC接种至明胶包被的48孔板中，培养至细胞密度达到90%。</li>
	<li>吸除培养基，加入0.3 mL成脂诱导培养基。在37 °C、5% CO2条件下，继续用成脂诱导培养基培养细胞4天。</li>
	<li>吸除培养基，加入0.3 mL成脂维持培养基。在37 °C、5% CO2条件下，继续用成脂维持培养基培养细胞3天。</li>
	<li>重复步骤6.3和6.4共2-3次，直至完成脂肪细胞的分化与成熟。</li>
	<li>吸除培养基，用DPBS洗涤一次。</li>
	<li>加入0.3 mL 4%多聚甲醛，在室温下孵育10分钟。吸除多聚甲醛，用DPBS冲洗两次。</li>
	<li>按照生产商说明书使用油红O染色剂，并在光学显微镜下观察脂滴。</li>
</ol>
7. 由 hiPSC 诱导的 MSCs 的软骨形成分化
注意：由 hiPSC 分化而来的 MSCs 具有软骨分化潜能（图 3E、F）。以下为软骨分化方案。
<ol>
	<li>通过在α-MEM中添加10% FBS、100 nM地塞米松、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、10 µM抗坏血酸、1 mM丙酮酸钠、50 µg/mL脯氨酸、0.02 nM转化生长因子β3（TGFβ3）和0.5 µg/mL骨形态发生蛋白6（BMP-6），配制软骨母细胞诱导培养基。</li>
	<li>收集2.5 × 105个由hiPSC诱导的MSCs，以150 × g离心5分钟，弃去上清液。用1 mL α-MEM重悬细胞，再以150 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于0.5 mL软骨诱导培养基中，再以150 × g离心5分钟。</li>
	<li>直接拧开管盖，在37 °C、5% CO2条件下培养21天，每3天更换一次软骨诱导培养基。在软骨分化期间，每天轻轻弹动离心管以重悬软骨细胞团&#160;（避免破坏软骨细胞团）。</li>
	<li>弃去上清液，用0.5 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>加入0.3 mL 4%多聚甲醛，固定24小时。</li>
	<li>将软骨细胞团进行石蜡包埋，切片（3 µm），然后用甲苯胺蓝（1%）染色30分钟。</li>
	<li>在光学显微镜下观察软骨细胞的细胞外基质。</li>
</ol>

Characterizing Surface Antigens and Proliferation Ability in hiPSC-Driving MSCs

<ol><li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+senescence%3A+Hallmarks%2C+mechanisms%2C+and+combating+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stromal+cells%3A+One+name%2C+multiple+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent stromal cells: One name, multiple identities.</a> Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+osteogenic+stem+cells%3A+in+vitro+cultivation+and+transplantation+in+diffusion+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Kinetics%22%5BJournal%5D)">Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers.</a> Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).</li>
<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
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<li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).</li>
<li>Dupuis, V., Oltra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+produce+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+Mesenchymal+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).</li>
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<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).</li>
<li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方案中，研究了两种具有代表性的将hiPSCs分化为MSCs的方法20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。两种方法均能够从hiPSCs中获得MSCs。通过细胞形态（图1）、表面抗原（图2）以及分化能力（<strong class="...

间充质基质细胞（MSCs）是一类来源于中胚层的成体多能干细胞1。MSCs 几乎存在于所有结缔组织中2。自20世纪70年代首次发现，并于1987年由 Friedenstein 等人首次从骨髓中成功分离以来3,4,5，多种人体体细胞组织（包括胎儿和成体组织）已被用于分离 MSCs，如骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织以及支持造血的基质组织1,2,6,7。MSCs 具有强大的增殖能力，并可分化为多种体细胞谱系，还能够迁移至受损或炎症组织2,8,9。这些特性使 MSCs 成为再生医学的潜在候选细胞10。然而，来源于体组织的 MSCs（st-MSCs）受限于供体来源有限、细胞增殖能力不足、质量差异以及可能由供体传播病原体带来的生物安全担忧11,12。
人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是通过转录因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）对成体细胞进行重编程而获得的，其功能与胚胎干细胞相似13,14。它们具有自我更新能力，并能分化为任何类型的体细胞，包括间充质干细胞（MSCs）。与组织来源的间充质干细胞（st-MSCs）相比，iPSC来源的间充质干细胞（iPSC-MSCs）具有供应无限、成本较低、纯度更高、质量控制更方便、易于规模化生产和基因改造等优势15,16,17。
由于iPSC-MSCs具有这些优势，已有多种将iPSC诱导分化为MSC的方法被报道。这些分化方法主要围绕两种培养体系展开：（1）拟胚体（embryoid bodies, EBs）形成法；（2）单层培养法。11,18,19,20本文表征了两种方法各自的代表性方案。此外，基于时间、成本、增殖能力、间充质干细胞生物标志物的表达以及分化能力，对这两种代表性方案进行了比较。 体外 也获取了相关数据。

<table><tbody><tr><td>茜素红染色试剂盒</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>C0148S</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD105（PE）</td><td>Biolegend</td><td>323206</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD34（FITC）</td><td>Biolegend</td><td>343503</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45（APC）</td><td>Biolegend</td><td>304011</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD73（APC）</td><td>Biolegend</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD90（FITC）</td><td>Biolegend</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Solarbio</td><td>A8100</td><td></td></tr><tr><td>BMP-6</td><td>Novoprotein</td><td>C012</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳恒温摇床</td><td>Crystal</td><td>CO-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>补偿微珠</td><td>BioLegend</td><td>424601</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technology</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>ST1254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;培养基</td><td>Servicebio</td><td>G4610</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HAKATA</td><td>HS-FBS-500</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemcell</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG1 同型对照 APC</td><td>BioLegend</td><td>403505</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG1 同型对照 FITC</td><td>BioLegend</td><td>403507</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG1 同型对照 PE</td><td>BioLegend</td><td>403503</td><td></td></tr><tr><td>人 TGF-&amp;beta;1</td><td>Stemcell</td><td>78067</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>ST1398</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Solarbio</td><td>SI9020</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>P3376</td><td></td></tr><tr><td>iPSC 维持培养基</td><td>STEMCELL Technology</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ITS 培养基添加剂</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>C0341-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（生长因子减少型）</td><td>BD Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>油红 O 染色试剂盒</td><td>Beyotime&amp;nbsp;Biotechnology</td><td>C0158S</td><td></td></tr><tr><td>脯氨酸</td><td>Solarbio</td><td>P0011</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;3</td><td>Novoprotein</td><td>CJ44</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G2543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附 6 孔板</td><td>Costar</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-66</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemcell</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30265</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Solarbio</td><td>G8100</td><td></td></tr></tbody></table>

人诱导性多能干细胞向间充质基质细胞分化的两种代表性方法的比较

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

间充质基质细胞（MSCs）是一类成体多能干细胞，已广泛应用于再生医学领域。由于来源于体组织的MSCs受限于供体来源有限、质量差异以及生物安全性等问题，过去十年中，利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成MSCs的研究显著增加。此前及近期将hiPSCs分化为MSCs的研究主要围绕两种培养方法展开：（1）拟胚体（EBs）形成法；（2）单层培养法。本实验方案详细描述了这两种从hiPSCs获得MSCs的代表性方法。每种方法均具有各自的优势与局限性，包括所需时间、成本、细胞增殖能力、MSC标志物的表达水平及其分化潜能。 体外本方案表明，两种方法均可从人诱导多能干细胞（hiPSCs）获得成熟且具有功能的间充质干细胞（MSCs）。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的特点，而拟胚体法（EB法）则具有耗时较短的优势。

按照方案（图1A），通过拟胚体形成和单层培养方法将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质干细胞（MSCs）。在分化过程中，细胞呈现出不同的典型形态（图1B、C）。
如图1B所示，hiPSC集落未分化时呈现典型的紧密形态，边界清晰，由紧密排列的细胞组成。hiPSC经解离后在摇床上培养24小时，形成均匀的球形胚状体（EB）。在MSC分化培养基中培养的第1至第7天，EB的光滑边缘逐渐变得粗糙，体积增大。第8至第17天，将EB转移至GFR-细胞外基质凝胶包被的6孔板后，EB逐渐贴壁，周围有大量贴壁的单层细胞向外铺展。至第18天，细胞融合度达到90%时，对细胞进行消化并接种至明胶包被的培养板。第19天，细胞贴壁后呈多边形。随后，当细胞融合度达90%时连续传代两次。所获得的MSC逐渐成熟，呈现典型的梭形形态，集落呈漩涡状生长。
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本方案描述并比较了两种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质基质细胞（MSCs）的代表性方法。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的优点；拟胚体（EBs）法的特点是耗时较短。

间充质基质细胞（MSCs）是一类成体多能干细胞，已广泛应用于再生医学。由于来源于体组织的MSCs具有……

本研究的范围是遗传性疾病的机制及治疗策略研究。我们的研究基于类球体、诱导多能干细胞（iPSCs）、类器官和小鼠等多种层次的疾病模型。其中，诱导多能干细胞（iPSCs）相较于其他模型具有显著优势。来自患者的诱导多能干细胞（iPSCs）以及 subsequently 衍生的细胞和类器官与患者具有相同的基因组，这为多种疾病提供了患者细胞库和疾病模型。此外，尽管从患者建立iPSCs的技术已相当成熟，但在将iPSCs定向分化为特定细胞和类器官方面仍存在诸多挑战。随着对发育机制的深入理解，该领域在未来将取得进一步发展。首先，将hiPSCs在涂有生长因子减少型细胞外基质凝胶的六孔组织培养板中，使用iPSC维持培养基进行培养。当细胞融合度达到80%至90%时，从孔板中移除培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。随后加入700至800微升浓度为0.48毫摩尔的EDTA，于室温孵育1分钟。移除消化液，将培养板在37摄氏度下孵育三至五分钟。当细胞消化成片状时，加入2毫升iPSC维持培养基以终止消化。将细胞悬液转移至六孔低吸附培养板中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳及60 RPM条件下孵育，以形成球形拟胚体（EB）。24小时后，使用巴斯德吸管将EB转移至离心管中，静置5至10分钟使其沉降，然后移除上清液。向管中加入间充质干细胞分化培养基，并将EB转移至含2毫升间充质干细胞分化培养基的六孔低吸附培养板中。将EBs置于摇床中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养七天。第八天，按照之前所示方法将EBs转移至离心管中。待EBs沉淀后，移除管中的上清液。向离心管中加入间充质干细胞维持培养基，并将拟胚体转移至已包被生长因子减少型细胞外基质凝胶的六孔板中，每孔加入2 mL间充质干细胞维持培养基。待细胞贴壁后，更换培养基，直至培养物达到90%融合度。随后，在37°C条件下，用消化液处理拟胚体来源的培养物。当部分细胞消化为单细胞时，加入两毫升间充质干细胞维持培养基以终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS冲洗一次孔中未消化的剩余细胞，并按照之前所示方法再次进行消化。然后，将细胞悬液在250 ×g下离心五分钟。吸去上清液，将细胞接种于明胶包被的培养皿中。使用间充质干细胞维持培养基培养细胞至90%融合度，并定期更换培养基。按照先前所述方法培养人诱导多能干细胞系。当细胞融合度达到50%至60%时，从培养板中移除iPSC维持培养基。加入2毫升MSC维持培养基，在37°C及5%二氧化碳条件下培养14天，每天更换培养基。为促进MSC的成熟，将单层培养物在37°C下用消化液处理。当部分细胞被消化成单细胞时，向孔中加入两毫升间充质干细胞维持培养基以终止消化，并将细胞悬液转移至离心管中。用DPBS洗涤残留的未消化细胞一次，并按照先前所示方法进行消化。然后按照先前所示方法离心细胞悬液，并将细胞接种于明胶包被的培养

comparison-two-representative-methods-for-differentiation-human

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