Name: 人外周血单核细胞的冷冻保存与生物能量评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 学习人外周血单核细胞的标准化冷冻保存方法，确保解冻后生物能量参数保持稳定。该技术支持多中心样本采集与集中分析，为免疫功能和线粒体研究提供可靠的细胞保存方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢吉森-马尔堡大学医院临床团队提供的血液采集工作。本研究由吉森大学资助。

本手稿中所述的血液采集、分离与分析的所有方案均已通过德国吉森大学机构审查委员会的审核与批准。已获得患者同意将其样本用于本研究。分离与细胞培养的所有步骤均在生物安全柜内进行。
1. 静脉穿刺
<ol>
	<li>准备所有采血所需的设备，包括消毒喷雾剂、无菌棉签、带80 mm试管和多通接头的采血套管、止血带/血压袖带、9 mL含锂肝素的Monovette采血管。 
	注：EDTA作为抗凝剂同样有效。</li>
	<li>从最合适的上臂静脉采血，通常为肘正中静脉或头静脉。</li>
	<li>使用止血带/血压袖带施加轻度压力，约为80 mm/Hg。</li>
	<li>用含酒精的消毒喷雾剂对手套和穿刺部位进行消毒，并让消毒后的穿刺部位自然风干。</li>
	<li>由于压力袖带的作用，静脉会更加突出。以15°–20°的角度将针头（套管外径21G / 0.8 mm，长度19 mm）刺入静脉，尽量避免造成创伤并减少探查。</li>
	<li>使用合适的采血系统采集血液，共采集4管，每管9 mL血液（单个实验人员处理超过7–8管血液将难以充分分离）。</li>
	<li>采血完成后，将采血管置于避光环境中静置5分钟，以确保抗凝剂均匀作用。</li>
</ol>
2. 外周血单个核细胞分离
<ol>
	<li>按照下述方法配制所有所需溶液。</li>
	<li>将杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；浓度1x）和淋巴细胞分离液（1.077 g/mL）恢复至室温（20–25 °C).</li>
	<li>室温下准备胎牛血清（FBS），并将装有FBS的无菌50 mL锥形管置于冰上备用。每份血液样本需要2 mL FBS。</li>
	<li>将冻存容器置于 4 °C 并将冻存管预冷至 4 °C.</li>
	<li>将细胞培养基预热至 37 °C，培养基包含 RPMI 1640、50 mL 胎牛血清以及青霉素 50 U/mL、链霉素 50 U/mL。该溶液可保存于 3 °C 长达2个月。</li>
	<li>在无菌的50 mL离心管中加入8 mL DPBS。在无菌的50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液（该培养基对光敏感，应在开始分离前加入）。</li>
	<li>将8 mL血液加入8 mL DPBS中，用3 mL塑料巴斯德吸管轻轻混匀。</li>
	<li>使用3 mL塑料巴斯德吸管，将血液/DPBS混合液轻轻叠加在淋巴细胞分离液上方。将第一层液体加至分离液时，倾斜离心管 20°-30°，这将减少血液-PBS混合物向中层的渗透。</li>
	<li>将血液-PBS混合液沿管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液上层。操作时应保持稳定的速度，以确保液体流速恒定。</li>
	<li>下一步，将离心管缓慢竖直，小心地将剩余血液沿管壁缓缓加至血液层上方。</li>
	<li>1000 x g 离心 10 分钟 g 在室温下，使用带有摆动桶转子且刹车关闭的离心机进行离心。离心后，血液/外周血单个核细胞（PBMC）混合物分为四层：最上层为血浆和血小板，第二层为PBMC层，其下为淋巴细胞分离液层，最底层为红细胞和粒细胞。各层结构如图所示。 图1.</li>
	<li>去除三分之二rd 用塑料巴斯德吸管吸取血浆层。</li>
	<li>使用1 mL移液器，收集淋巴细胞分离液层中的PBMCs，注意避免吸入任何分离液。</li>
	<li>将吸头置于PBMC层上方1 mm处。切勿刺穿PBMC层，否则培养基会流过细胞。通过移液器的吸力将PBMC吸至此位置，以便在该点多次收集细胞。 
	注意：为了最大程度地增加收集的PBMC数量，在操作结束时应检查表面残留的细胞，并尽量收集这些区域的细胞。为稳定操作过程，可将离心管置于平面上。</li>
	<li>将PBMCs逐步转移至新的50 mL离心管中，直至完全收集该层。加入DPBS至25 mL刻度线，洗去淋巴细胞分离液及其他残留物。</li>
	<li>以 100 × g 离心 10 分钟 g 室温下离心并开启刹车。使用真空泵或类似装置小心吸除上清液，注意勿损伤细胞沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL DPBS中，并用DPBS定容至25 mL。重复洗涤一次后，用适用于后续步骤的培养基重悬。</li>
</ol>
<img alt="密度梯度离心示意图，显示各层：血浆、外周血单个核细胞、Histopaque、红细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65730/65730fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：密度梯度离心的示意图，用于展示不同分层。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65730/65730fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 冷冻保存
<ol>
	<li>将冻存容器冷却至 4 °C，将 FBS 置于冰上冷却。</li>
	<li>用 1 mL 移液器在 1 mL FBS 中重悬 PBMC 沉淀，FBS 应处于室温。</li>
	<li>在冰上按 1:5 的比例将 DMSO 与预冷的 FBS 混合，终浓度为 20% DMSO，然后将 FBS:DMSO 混合液放回冰上。该溶液需现配现用。</li>
	<li>将含 FBS 的 PBMC 细胞悬液转移至预先标记好的 2 mL 冻存管中。每支收集管使用一支冻存管。调整细胞数量至每毫升 1 × 107 至 5 × 107 之间。使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。</li>
	<li>用 1 mL 移液器将 1 mL FBS:DMSO 混合液逐滴加入管中，约每秒 1–2 滴。逐滴加入可实现持续且均匀的混合。</li>
	<li>将冻存管放入预冷的冻存容器中，再将冻存容器置于 -80 °C 超低温冰箱中保存 24 小时。冻存容器可提供每分钟 -1 °C 的可控降温速率。</li>
	<li>从 -80 °C 超低温冰箱中取出冻存管。取出后立即将冻存管转移至液氮气相中长期保存。记录每个样本的存放位置。</li>
</ol>
4. 解冻
<ol>
	<li>准备所有所需溶液：含 50 mL 胎牛血清及青霉素 50 U/mL、链霉素 50 U/mL 的 RPMI 1640 细胞培养基。该溶液可在 3°C 下保存最多 2 个月。</li>
	<li>将细胞培养基预热至 37 °C。向无菌的 50 mL 锥形管中加入 3 mL 预热的细胞培养基。</li>
	<li>从液氮罐中取出样本。在 37 °C 水浴中解冻样本约 3.5 分钟，当最后一块冰即将融化时立即从水浴中取出。此时管内应仍可见针尖大小的冰粒。 
	注意：DMSO 对 PBMC 有害，操作应尽可能迅速。</li>
	<li>用 1 mL 移液器从冻存管中取出细胞:FBS:DMSO 混合液。将 PBMC 样本加入已准备好的 50 mL 管中的细胞培养基中。分三次（2 mL、2 mL 和 1 mL）用共 5 mL 培养基冲洗冻存管。</li>
	<li>将培养基转移至管中，以回收可能残留的细胞。在室温下以 100 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 1 mL 适用于后续实验的培养基。细胞即可用于后续实验。 
	​注意：然而，在使用新鲜或冻存细胞进行功能检测时，通常建议在基于淋巴细胞分离液的分离或细胞解冻后，在培养箱中静置一段时间（通常为过夜）。</li>
</ol>
5. 细胞培养
<ol>
	<li>分离或解冻后，将细胞在 37 °C、5% CO2/95% 空气条件下培养过夜。</li>
	<li>用 1 mL 添加了 10% 胎牛血清、50 U/mL 青霉素和 50 U/mL 链霉素的 RPMI 培养基重悬细胞。后续使用有多种选择，可根据实验需要对细胞进行处理。</li>
	<li>对于常规储存，使用无菌的 6 孔细胞培养板，在静置后收集细胞。用 1 mL 移液器将 1 mL 细胞悬液转移至一个孔中，并加入 4 mL 细胞培养基。 
	注意：不同个体间分离得到的 PBMC 数量差异较大，每分离 8 mL 血液使用一个含 5 mL 细胞培养基的孔即可。然而，从血沉棕黄层（buffy coats）中分离 PBMC 时，PBMC 数量显著高于全血样本，因此应将细胞分至多个孔中培养。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中静置培养 24 小时。此孵育步骤适用于新鲜分离的细胞以及冻存后复苏的细胞。</li>
</ol>
6. ATP 检测
<ol>
	<li>将解冻的外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于1 mL RPMI培养基中，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS）、50 U/mL青霉素和50 U/mL链霉素。</li>
	<li>取样并测定细胞浓度，然后使用台盼蓝进行活死细胞鉴别。取10 µL重悬的细胞与90 µL细胞培养基混合，再从中取10 µL与10 µL台盼蓝混合。将混合液加入细胞计数板或自动细胞计数仪中，测定活细胞与死细胞的数量。</li>
	<li>在96孔白色聚苯乙烯板中，每孔加入100 µL细胞悬液，细胞密度为1 × 105 个细胞/100 µL。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中静置培养24小时。</li>
	<li>使用ATP检测试剂盒测定ATP浓度。
	<ol>
		<li>利用ATP与荧光素结合时产生的光信号进行检测，发光强度可通过酶标仪读取。将培养板从培养箱中取出，室温平衡15分钟。裂解细胞后孵育5分钟，然后加入检测试剂，按照试剂盒说明书进行测定。使用内标法确定ATP水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 高分辨率呼吸测定法
<ol>
	<li>打开高分辨率氧电极仪，预热30分钟。</li>
	<li>根据所述方案处理细胞 图1. 按照要求配制所有所需的储备液 表1.</li>
	<li>移液 2.1 mL 呼吸缓冲液（表1) 分别加入两个高分辨率氧电极室中，并使用腔室内置的磁力搅拌子持续搅拌缓冲液（750 转/分钟），于 37 °C 30分钟，直至极谱氧传感器的氧通量信号稳定。 
	注意：在氧电极测量室中，通过极谱式氧电极实时测量耗氧量（通量）及测量室中的氧饱和度。必须进行背景校准，以消除背景噪声并确保结果可靠。</li>
	<li>根据制造商的方案对极谱法氧气传感器进行空气校准23.</li>
	<li>将分离的PBMC重悬于1 mL线粒体呼吸介质（MIR05，其成分为 表1）并稀释至 8 x 106 cells/mL</li>
	<li>空气校准后，从氧电极室中吸出呼吸介质，并向每个呼吸计室中加入 2.1 mL 细胞悬液。若测量过程中需要，可对腔室重新充氧（参见 h 点处的开放操作） 图2)，培养室中的氧饱和度不应低于 100 µM.</li>
	<li>插入塞子以封闭室腔，室腔设计容量为 2.0 mL。吸取形成的细胞悬液。</li>
	<li>持续混匀细胞悬液 37 °C 使用置于腔室内的磁力搅拌器（750 rpm）搅拌。等待约20分钟，直至获得稳定信号。测定内源性呼吸（(a) 在 图2).</li>
	<li>为测定呼吸链中不同复合物的活性，通过塞子上的钛注射端口向反应 chamber 中加入线粒体呼吸所需的底物和抑制剂。请使用以下在反应室中的终浓度。</li>
	<li>为了破坏细胞膜，加入 5 µL 8.1 mM 皂苷通过腔室密封塞的钛注射端口注入，以去除天然底物（b） 图2 而线粒体膜保持完整。</li>
	<li>通过腔室密封塞上的加样口加入底物2 M谷氨酸和800 mM苹果酸，记录呼吸信号直至达到稳定状态。信号通常在2–4分钟内稳定。 
	注意：也可使用丙酮酸等其他底物。</li>
	<li>添加 8 µL 通过腔室密封塞上的加样孔加入500 mM的二磷酸腺苷（ADP），记录呼吸信号直至达到稳定状态。信号通常在2-4分钟内（d）稳定。 图2.</li>
	<li>添加 20 µL 通过腔室密封塞上的进样口加入1 M琥珀酸，并记录呼吸信号直至达到稳定状态。信号通常在2-4分钟后（e）稳定。 图2.</li>
	<li>逐步梯度加入1 M羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP） 0.5 µL 直至不再出现进一步增加。等待2-4分钟，直至信号稳定（f） 图2当呼吸不再进一步增加时，继续进行下一步操作。 
	注意：操作FCCP时需谨慎，因其对人类健康存在风险。</li>
	<li>添加 5 µL 通过腔室密封塞的进样口加入0.1 mM 鱼藤酮，记录呼吸信号直至达到稳定状态。信号通常在2–4分钟内稳定（g）。 图2. 
	警告：操作鱼藤酮时需谨慎，因其对人类健康存在风险。</li>
	<li>添加 1 µL 通过腔室密封塞的注射口加入4 mg/mL寡霉素，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在2-4分钟（h）内达到稳定。 图2. 
	注意：操作寡霉素时需谨慎，因其为对人体具有健康风险的有毒物质。</li>
	<li>添加 1 µL 通过腔室密封塞上的进样口加入5 mM抗霉素A，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在2-4分钟内达到稳定（i） 图2. 
	警告：操作抗霉素A时需谨慎，因其为对人体具有健康危害的有毒物质。</li>
	<li>在评估实验数据时，为排除不参与氧化磷酸化的酶所消耗的氧气，需从所有其他测定值中减去抗霉素A的数值。</li>
	<li>加入200 mM N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐（TMPD；电子供体）和800 mM 抗坏血酸，以维持TMPD处于还原状态。通过反应室密封塞上的进样口注入底物，并记录呼吸信号直至获得稳定读数。信号通常在2–4分钟内稳定（j） 图2.</li>
	<li>TMPD 易发生自氧化，因此需从复合体 IV 的实测耗氧量中减去其自氧化引起的耗氧量。</li>
	<li>加入 NaN3 通过腔室密封塞的注射口加入 ≥ 100 mM 的试剂，并记录呼吸信号直至达到稳定状态。信号在 2–4 分钟后趋于稳定，此时复合体 IV 活性被抑制，仅剩 TMPD 自氧化反应持续进行。 
	警告：操作叠氮化钠时需小心，因其为对人体具有健康危害的有毒物质。</li>
</ol>
<img alt="细胞呼吸示意图显示代谢状态下 O₂ 浓度的变化；通量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65730/65730fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：O的示意图路线2 通量 氧通量的示意图流程如所示。曲线在加入抑制剂和底物后分为 a-k 的不同阶段。a：内源性呼吸；b：透化细胞；c：解偶联的复合物 I 呼吸；d：偶联的复合物 I 呼吸；e：氧化磷酸化；f：复合物 I 和复合物 II 的最大解偶联活性；g：复合物 II 的解偶联呼吸；h：质子漏呼吸；i：残余呼吸；j：复合物 IV(U) 未耦联呼吸和TMPD的自氧化；k：TMPD的自氧化 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65730/65730fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
8. 柠檬酸合酶活性
<ol>
	<li>将柠檬酸合酶活性作为独立参数进行测定，并用其对高分辨率氧电极的测量结果进行归一化处理。</li>
	<li>将分离的外周血单个核细胞（PBMC）重悬于1 mL线粒体呼吸介质（MIR05）中，并稀释至8 × 10⁶个细胞/mL6 cells/mL</li>
	<li>在液氮中速冻，并于−80 °C 直到进行实验或测量新鲜细胞为止。</li>
	<li>配制所需的所有溶液：0.1 M 三乙醇胺盐酸缓冲液（pH 8.0）、1.0 M Tris-HCl 缓冲液（pH=8.1）、10% Triton X-100、10 mM 草酰乙酸溶于 0.1 M 三乙醇胺盐酸缓冲液（pH 8.0）、1.01 mM DTNB 溶于 1.0 M Tris-HCl 缓冲液（pH=8.1）、12.2 mM 乙酰辅酶A溶于双蒸水2O.</li>
	<li>配制反应液（表1) 含 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB；0.1 mM）、乙酰辅酶A（0.31 mM）、EDTA（50 µM）、三乙醇胺盐酸盐（5 mM）和 Tris 盐酸盐（0.1 M）。</li>
	<li>制备起始试剂（表1) 加入溶于双蒸水的 0.5 mM 草酰乙酸2O.</li>
	<li>将样品置于冰上解冻，因为柠檬酸合酶若解冻过快则不稳定。</li>
	<li>添加 40 µL 将样品置于冰上，加入96孔板前 110 µL 使用多通道移液器加入反应介质。</li>
	<li>将反应液和样品在培养箱中预热 30 °C 5分钟。将起始试剂在水浴中预热至 30 °C 5 分钟。</li>
	<li>添加 50 µL 使用多通道移液器将起始试剂加入各孔。测定吸光度 30 °C 在412 nm波长下通过酶标仪读取20分钟。</li>
</ol>

PBMC Collection and Cryostorage for Mitochondrial Bioenergetics Analysis

<ol><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cognitive+impairment%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).</li>
<li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+aging+and+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging.</a> Biology. 8 (2), 48(2019).</li>
<li>Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleiveland%2C+CR+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health.+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).</li>
<li>Silaidos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-associated+differences+in+mitochondrial+function+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMCs%29+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Sex+Differ%22%5BJournal%5D)">Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain.</a> Biol Sex Differ. 9 (1), 34(2018).</li>
<li>Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+human+samples+for+assessment+of+mitochondrial+bioenergetics%3A+Gold+standards%2C+limitations%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives.</a> Life. 11 (9), 949(2021).</li>
<li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroMol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of aging.</a> NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).</li>
<li>Migliore, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+the+role+and+the+most+suitable+biomarkers+of+oxidative+stress+in+Alzheimer%27s+disease+and+in+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).</li>
<li>Leutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+trophic+support+enhances+apoptosis+in+PC12+cells+expressing+Alzheimer%E2%80%99s+APP+mutation+and+sensitizes+cells+to+staurosporine-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death.</a> J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Leuner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%3A+Focus+on+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes.</a> Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).</li>
<li>Leuner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+apoptosis%2C+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+lymphocytes+as+potential+biomarkers+for+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+Suppl%22%5BJournal%5D)">Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease.</a> J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).</li>
<li>Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Indoleamine+2%2C3-Dioxygenase+production+and+its+association+to+inflammatory+cytokines+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+culture+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tryptophan+Res%22%5BJournal%5D)">Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus.</a> Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236(2020).</li>
<li>Cortez-Espinosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD39+expression+on+Treg+and+Th17+cells+is+associated+with+metabolic+factors+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes.</a> Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).</li>
<li>Mahmoud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Diabetea+tea+%E2%84%A2+consumption+on+inflammatory+cytokines+and+metabolic+biomarkers+in+type+2+diabetes+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients.</a> J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).</li>
<li>Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+modulation+of+immune+function+by+%CE%B2-glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Dietary modulation of immune function by β-glucans.</a> Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).</li>
<li>Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+lymphocyte+activation+marker+expression+and+cytokine+secretion+profile+in+stimulated+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%3A+an+in+vitro+model+to+monitor+cellular+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function.</a> J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).</li>
<li>Otaegui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+micro+RNA+expression+in+PBMC+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients.</a> PLoS One. 4 (7), e6309(2009).</li>
<li>Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+complex+interplay+between+T+cell+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function.</a> Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).</li>
<li>Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuel+feeds+function%3A+energy+metabolism+and+the+T-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response.</a> Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+dysfunctions+of+blood+mononuclear+cells+link+with+cardiac+disturbance+in+patients+with+early-stage+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure.</a> Sci Rep. 5, 10229(2015).</li>
<li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+pediatric+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock.</a> Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).</li>
<li>Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+global+transplant+laboratory+standard+operating+procedures+for+blood+collection%2C+PBMC+isolation%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage.</a> Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function+in+permeabilized+and+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells.</a> J Vis Exp. (120), e54985(2017).</li>
<li>Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%E2%80%99s+disease%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 30(2020).</li>
<li>Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases of the brain.</a> Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案提供了一种从人血中分离并低温冻存外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，适用于生物能量学分析。该方法可轻柔地大量分离PBMCs，细胞活力高，且能获得足够数量的细胞用于生物能量学检测。其缺点是即使尽量减少中断，分离过程仍耗时较长，但后续的低温冻存使得生物能量学检测可在不同时间点进行。采用此方法，样本可先收集，并在后续时间点统一检测。该方法也适用于多中心临床试验中的样本采集，并可在中心实验室统一进行参数测定。
冷冻保存技术使得细胞能够长期储存，并可在之后进行检测。外周血单个核细胞（PBMC）的分离是一个耗时约2-3小时的过程，且每次只能处理少量样本。单个实验人员若同时从超过两名个体中分离新鲜PBMC，将不可避免地导致细胞质量下降。若需使用新鲜细胞进行后续实验，则会增加操作复杂性，带来额外的压力和时间负担。将细胞分离与实验操作分步进行，可简化研究流程，并提高检测的标准化程度。具体而言，可先采集血液样本，完成分离后对样本群体进行冷冻保存，再择期开展特定实验。样本可来自不同地点和不同时间点，最终在同一时间、同一地点统一检测。
生物能...

人外周血单个核细胞（PBMCs）在多个科学领域中具有广泛的应用，包括免疫学和生物能量学相关问题的研究，例如与衰老过程或退行性疾病相关的研究1,2。PBMCs在组成上具有异质性，主要包括淋巴细胞（B细胞、T细胞和NK细胞）、单核细胞以及树突状细胞。这些细胞在不同个体之间，甚至同一个体内部有时会表现出显著差异，因此需要标准化的操作流程来处理这些细胞。细胞活性和分离纯度等重要参数是其操作的基本要求，同时还会受到采样时间、褪黑激素水平、受试者是否空腹等环境因素的影响3,4。
基于对PBMCs生物能量学的研究，本文介绍了一种适用于其他方法的PBMCs分离、冷冻保存和培养技术。尽管肌肉活检被认为是线粒体能量代谢的金标准5，但血液细胞的检测是一种快速且微创性较小的操作。此外，越来越多的研究表明，衰老和阿尔茨海默病（AD）中线粒体功能的变化不仅发生在脑组织中，也出现在外周组织中6,7,8,9,10。该方法还可用于研究其他疾病和状态，包括糖尿病和肥胖11,12,13。多发性硬化症患者的基因表达模式可借此分析，也可广泛用于免疫功能及其影响因素的研究14,15,16。
外周血单个核细胞（PBMCs）通常依赖氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）17,18。因此，PBMCs 作为替代模型具有广泛的应用前景。在以往的研究中，PBMCs 的能量代谢已被用于研究器官功能障碍，例如早期心力衰竭19、脓毒性休克20，以及线粒体功能的性别相关差异4。建立一种通用的 PBMCs 冷冻保存、分离与培养方法，将有助于提高不同研究机构所获得结果之间的可比性。目前各步骤的实验方案存在较大差异21,22，本方法的目标是为 PBMCs 的生物能量学测定提供操作指南。
本文介绍了一种用于测量外周血单个核细胞（PBMCs）生物能量参数的方法。我们阐述了从人血液中分离、冷冻保存以及检测PBMCs生物能量学特性的实验方法。该方法可用于确定患者的生物能量参数，并在临床背景下对其进行评估。要实施这些检测，研究人员需要能够获得可采集新鲜血液样本的患者群体。

<table><tbody><tr><td>0.1 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液 (pH = 8.0)</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris-盐酸缓冲液 (pH = 8.1)</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.01 mM DTBB</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>10 % Triton X-100</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>10 mM 草酰乙酸</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>14&amp;ndash;20 G 无菌采血针 Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly</td><td>Sarstedt</td><td>156353_v</td><td></td></tr><tr><td>37% 盐酸</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co. KG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇 (EtOH)</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>乙酰辅酶A</td><td>Pancreac Applichem</td><td>A3753</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;(70% 异丙醇)</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>去离子水 (bidest.)</td><td>使用 MilliQ Academic 系统制备（自制）</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>ATP标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6016949</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll 分离液</td><td>Biochrom</td><td>6115</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜 MSC Advantage</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙 (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪 TC20 自动细胞计数器</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 Heraeus Megafuge 16 R</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双腔计数板，用于细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>冻存管 Cryo.S</td><td>Grainer Bio-One</td><td>126263-2DG</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37008</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102952</td><td></td></tr><tr><td>消毒喷雾剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手套（乳胶、橡胶或乙烯基）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 (12.5 ml) DistriTips</td><td>Gilson</td><td>F164150</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液 (DPBS; 10x)</td><td>Gibco (Thermo Scientific)</td><td>15217168</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 (EtOH 100%)</td><td>Carl ROTH GmbH &amp; Co. KG</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱 (-80&amp;deg;C)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>支架/适配器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 Midi 40</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>MIR05</td><td>自行配制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冻存容器</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>10110051</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪 CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮罐 Locator 6 plus</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>草酰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2k</td><td>Orobororus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>移液器 Performance Pipettor 10 &amp;mu;L, 100 &amp;mu;L, 1000 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI-1640)</td><td>Gibco (Thermo Scientific)</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl ROTH GmbH &amp; Co. KG</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>四甲基对苯二胺 (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>止血带/血压袖带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108382</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Biochrom</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vaccubrand GmbH &amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViewPlate-96</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005181</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅 WNB22</td><td>Memmert GmbH &amp; Co. KG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

真核细胞的生理功能主要依赖于线粒体提供的能量。线粒体功能障碍与代谢性疾病及衰老相关。氧化磷酸化在此过程中起决定性作用，对维持细胞能量稳态至关重要。外周血单个核细胞（PBMCs）已被确定为一种微创样本，可用于检测线粒体功能，并已被证明能够反映疾病状态。然而，在人体样本中，线粒体生物能量功能的测定可能受到多种因素的限制，包括采样量、采样时间（通常跨越数天）以及采样地点。对采集的样本进行冷冻保存可确保样本收集和检测的一致性。应注意确保冷冻保存细胞与新鲜制备细胞之间所测参数具有可比性。本文描述了从人血液样本中分离并冷冻保存PBMCs以分析其线粒体生物能量功能的方法。按照本方案冷冻保存的PBMCs在细胞数量和活力、三磷酸腺苷（ATP）水平以及呼吸链活性测定方面，与新鲜收获的细胞相比仅有轻微差异。本方法仅需8–24 mL人血液，使得在多中心临床研究中采集样本并在现场测定其生物能量学成为可能。

细胞活力与数量 
为了成功进行分离和冻存，细胞数量和活力应尽可能高。在冻存前后，需对细胞进行计数并测定其活力，以确保细胞的健康状态和质量。图3 展示了外周血单个核细胞（PBMC）在冻存前后的代表性图像，细胞数量和活力几乎没有差异，表明PBMC的分离与保存成功。
<img alt="细胞活力和细胞计数分析图；对照组与1个月处理结果的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65730/65730fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：冷冻保存对细胞数量和活力的影响。 实验分组包括对照组（新鲜分离的外周血单个核细胞，PBMCs）以及经过1个月冷冻保存后的PBMCs。细胞计数...

分离的外周血单个核细胞可用于免疫功能和免疫相关疾病、代谢性疾病或线粒体功能的研究分析。本文中，我们描述了一种从全血中制备外周血单个核细胞（PBMCs）并进行后续冷冻保存的标准方法。冷冻保存使得实验在时间和空间上具有独立性。

真核细胞的生理功能主要依赖于线粒体提供的能量。线粒体功能障碍与代谢性疾病相关……

通过该方法，我们旨在描述一种适用于冻存外周血单个核细胞（PBMCs）的实验流程，使其在解冻后生物能量学参数保持不变。细胞冻存的主要实验挑战之一在于，冻融过程可能对PBMCs造成损伤，从而影响后续的生物能量学检测结果。本实验方案致力于提供一种可靠保存PBMCs的方法，避免细胞受损，从而确保所测得的生物能量学参数不受干扰。保存PBMCs的可能性使得样本可以从不同中心收集，并在同一个地点进行检测。这还使检测在时间上更具独立性。PBMCs的冷冻保存使得在多个采集并保存细胞的地点可同时开展研究。随后可对收集的样本进行集中检测。这可以简化研究的流程与规划。首先，向无菌的50毫升锥形管中加入8毫升DPBS。向其中加入 8 mL 血液，并使用一支 3 mL 塑料巴斯德吸管充分混匀内容物。在另一支锥形管中加入 15 mL 淋巴细胞分离液，将管子倾斜 20 至 30 度。然后，使用一支三毫升的巴斯德吸管，将血液与DPBS混合液轻轻加至分离介质上方，形成第一层。将剩余混合液沿离心管管壁小心地叠加上去。缓慢将离心管竖直，使剩余血液叠加在已形成的血液层上。将离心管置于水平转子中，于室温下以 1,000 G 离心 10 分钟，离心时关闭刹车。血液/外周血单个核细胞混合物将分为四层。用巴斯德吸管移除上层血浆的 2/3，然后用 1 毫升移液器收集外周血单个核细胞（PBMCs）。将PBMCs转移至一个新的50毫升离心管中，直至收集完整个细胞层。随后，用DPBS补足体积至25毫升，以去除残留的分离液及其他杂质。在室温下，以100 ×g离心10分钟，离心时开启刹车。然后，用真空泵吸去上清液。接着，用一毫升 DPBS 重悬沉淀，并加入更多 DPBS 至总体积为 25 毫升，以洗涤并重悬沉淀。将冻存容器冷却至 4 摄氏度。然后，将胎牛血清置于冰上。用一毫升胎牛血清重悬含有分离出的外周血单个核细胞的细胞沉淀。接着，按1:5的比例在冰上将DMSO与冷却的血清混合。使用每个收集管对应一支标记好的2毫升冻存管，将细胞悬液转移至冻存管中。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和细胞活力。用1毫升移液器向管中加入1毫升DMSO/FBS混合液。然后，将试管放入预冷的冻存盒中，将冻存盒置于零下80摄氏度的冰箱中冷冻24小时。次日，从冰箱中取出试管，储存于液氮的气相中。细胞计数和活力在冻存前后保持一致，表明分离和保存成功。

cryopreservation-bioenergetic-evaluation-human-peripheral-blood

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人外周血单核细胞的冷冻保存与生物能量评价

人类共感染难以复制 体外然而，人类疟原虫可被轻易地进行体外培养 体外，新鲜分离的自然感染HIV的人类外周血单个核细胞亦可如此。这为研究HIV共感染背景下疟原虫的早期免疫应答提供了一个极佳的模型。...

一个 体外 HIV共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

本方案详细介绍了在临床试验现场可实际应用的高质量外周血单个核细胞（PBMC）和血浆生物样本的制备方法，可用于转化生物标志物分析。...

临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

本文介绍了一种针对冻存全血样本的细胞松弛素B阻滞微核试验的优化方案。这种用于微核分析的全血冻存优化方法是一种可靠的技术，适用于大规模采样和多中心研究，也可用于其他与血液相关的检测。...

冻存全血微核试验

本方案提供了外周血单个核细胞采集、保存和复苏的简易指南，适用于流式细胞术和RNA测序等后续分析与实验流程。同时演示了血浆和白膜层的收集方法。...

从全血中分离并低温保存高活力人外周血单个核细胞：初学者指南

本方案详细介绍了用于生物样本库建设及其他用途的、与高通量自动化兼容的人类外周血单个核细胞分离方法。...

从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞 通过 高通量免疫磁珠分离

哺乳动物的腹腔含有多种对先天免疫反应至关重要的免疫细胞群体。为了对这些细胞进行生物化学和功能分析，需要一种高效的分离方法。本文提供了一种从小鼠腹腔中分离腹腔细胞的全面方法。...

小鼠腹腔细胞的分离

关键词：小鼠，腹腔，细胞分离，免疫细胞，腹膜巨噬细胞，原代细胞培养

本文介绍一种高效扩增和纯化大量人自然杀伤（NK）细胞并评估其功能的方法。...

人外周血自然杀伤细胞的扩增、纯化及功能评估

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。...

通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

本文介绍了一种从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞的方法。通过唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）刺激并扩增PBMC来源的γδ T细胞。大规模扩增的γδ...

使用唑来膦酸扩增人外周血 γδ T 细胞

人呼吸道合胞病毒（HRSV）可导致婴幼儿严重的细支气管炎。严重HRSV疾病发病机制的一部分由宿主免疫反应引起。利用HRSV刺激原代人免疫细胞，可提供一种快速且可重复的模型系统，用于研究炎症通路的活化及感染过程。...

一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

学习人外周血单核细胞的标准化冷冻保存方法，确保解冻后生物能量参数保持稳定。该技术支持多中心样本采集与集中分析，为免疫功能和线粒体研究提供可靠的细胞保存方案。

人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

探索更多视频