斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

在发育过程中建立胚胎体轴模式时，细胞被认为能够解码信号的强度、动态变化及组合方式。我们正在利用光遗传学技术在斑马鱼胚胎中操控这些信号特征。该方法将有助于我们理解胚胎细胞如何解码信号，从而做出最早的细胞命运决定。

本文讨论的光遗传学方法利用光作为远程控制手段，快速且可逆地激活BMP或nodal信号通路。由于光照易于定向，这些方法可在信号调控实验中提供更精确的控制。本实验方案介绍了在斑马鱼胚胎中使用这些光敏感工具的方法。

通过这种改进的时间和空间控制，现在可以在斑马鱼发育过程中进行精确的信号调控。我们期望这能加深对细胞如何解码信号以做出命运决定的理解，从而有助于揭示胚胎体轴模式的形成机制。首先，使用培养箱和LED微孔板照明器构建一个光照箱，以控制光照和温度。

然后，将六孔板放置于培养箱的上层搁板，并检查光束是否均匀覆盖整个六孔板。使用一张白纸观察光照覆盖的分布情况。使用照度计测量辐照度和空间均匀性。

注射前至少一天，制备注射用培养皿和琼脂糖包被的六孔板。用胚胎培养基冲洗注射用培养皿模具，然后轻轻放入熔化的琼脂糖中。待琼脂糖凝固后，小心使用标签处将模具取下。

接下来，为去壳胚胎的免疫荧光实验准备火焰抛光的玻璃移液管。将玻璃移液管末端插入本生灯火焰中，并持续旋转，直至边缘变得光滑。使用此处所示的mRNA制备注射混合液。

进行表型分析实验时，在单细胞阶段将针头穿过卵膜直接插入细胞中心，并注入1纳升的注射混合液。若进行免疫荧光实验，则需在去膜胚胎的单细胞阶段将针头插入细胞中心。对于这两种实验，均需准备足够的胚胎样本，包括未暴露未注射、未暴露但注射、暴露但未注射，以及既暴露又注射的胚胎。

每种条件下至少选择30个胚胎。进行免疫荧光检测时，额外准备一皿未注射的胚胎，作为评估发育阶段进程的参照。注射后，将胚胎和培养皿在28摄氏度下孵育。

首先，将显微注射后的斑马鱼胚胎在28摄氏度条件下孵育。约在1.5小时受精后（HPF），即4至16细胞阶段，剔除未受精及发育异常的胚胎。进行表型分析实验时，用铝箔包裹未暴露的对照组培养板，其中包含未注射和已注射的胚胎。

将覆有铝箔的培养皿置于28摄氏度光盒的下层搁板，将未覆盖的培养皿置于上层搁板。确认培养皿盖已盖好后，开启蓝光并关闭光盒门，以避免意外的室内光线照射。在约1.5 HPF进行免疫荧光实验时，用铝箔分别包裹已曝光和未曝光的培养皿，而对照培养皿则保持不包裹。

将所有培养皿放入28摄氏度的光盒中，但不开启LED。关闭光盒门，以防止意外暴露于室内光线下。在约5 HPF时，使用解剖显微镜评估代理胚胎的发育阶段。

同时，移除包裹的培养皿，以确保所有培养皿受热均匀。当示踪胚胎发育至原肠胚40%外胚层延伸阶段时，打开暴露组培养皿，将其置于光源箱的上层搁板上，保持未暴露组培养皿盖好并置于下层搁板。

立即打开蓝光，关闭门，并设置20分钟的计时器。为准备固定，尽可能减少室内光线。固定前，从4°C取出含有4%甲醛的试管，并将其放置在光盒旁边。

20 分钟后，打开光盒的门，取出未暴露于光照的培养皿。使用火焰烧灼过的玻璃移液管尖端将对光敏感的胚胎从培养皿中移出。然后，将火焰烧灼过的玻璃移液管尖端浸入 4% 多聚甲醛中，使胚胎沉入液体，从而将其浸入 4% 多聚甲醛中。

将固定后的胚胎在 4 摄氏度下保存过夜。进行表型分析实验时，对表达 bOpto-BMP 和 bOpto-Nodal 的斑马鱼胚胎进行光照处理，并在受精后 24 至 32 小时之间（即受精后一天）将其从光照箱中取出。使用解剖显微镜观察表型，并建立评分标准。

为方便起见，在胚胎仍位于绒毛膜内时进行评估。使用移液器探查或重新定位胚胎，以便从不同角度观察。进行免疫荧光检测时，将胚胎在4%多聚甲醛中于4摄氏度孵育过夜后，去除多聚甲醛，并用PBST清洗三至五次。

弃去 PBST，加入 100% 甲醇。密封试管并轻轻颠倒混匀，使残留的 PBST 与甲醇充分混合。再用甲醇洗涤胚胎两次后，于 -20 °C 保存，可保存至少两小时至数年。

使用配备光学切片功能的显微镜，采集免疫染色胚胎的图像。在适当的 mRNA 用量和光照条件下进行的免疫荧光染色实验表明，未注射且未受光照的胚胎中 pSmad 水平相似，而注射后接受光照的胚胎则表现出更高的 Smad 磷酸化水平。