Name: 在基因工程小鼠模型中识别、诊断和分级恶性周围神经鞘瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解利用P0-GGF-beta-3基因工程小鼠模型识别和分级恶性周围神经鞘瘤的病理学方法。该技术结合组织学与免疫组化，为神经纤维瘤病相关肿瘤研究提供可靠框架。

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本研究工作获得了美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353 和 R01 NS109655 资助 S.L.C.；R01 NS109655-03S1 资助 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 资助 S.L.C.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 资助 S.L.C.）的资助。

Pathology Assessment of PN-MPNST Progression in the P0-GGFβ3 Mouse Model

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+diagnosis+and+pathogenesis+of+neurofibromatosis+type+1+%28NF1%29-associated+peripheral+nervous+system+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Anatomic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms.</a> Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>Rad, E., Tee, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1%3A+Fundamental+insights+into+cell+signalling+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).</li>
<li>Brannan, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+neurofibromatosis+type-1+gene+leads+to+developmental+abnormalities+in+heart+and+various+neural+crest-derived+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues.</a> Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).</li>
<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+predisposition+in+mice+heterozygous+for+a+targeted+mutation+in+Nf1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1.</a> Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).</li>
<li>Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromas+in+NF1%3A+Schwann+cell+origin+and+role+of+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment.</a> Science. 296 (5569), 920-922 (2002).</li>
<li>Cichowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+tumor+development+in+neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1.</a> Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).</li>
<li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+Nf1+transiently+promotes+self-renewal+but+not+tumorigenesis+by+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells.</a> Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).</li>
<li>Rhodes, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdkn2a+%28Arf%29+loss+drives+NF1-associated+atypical+neurofibroma+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation.</a> Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).</li>
<li>Chaney, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdkn2a+loss+in+a+model+of+neurofibroma+demonstrates+stepwise+tumor+progression+to+atypical+neurofibroma+and+MPNST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST.</a> Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).</li>
<li>Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+mechanisms+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development.</a> International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620(2021).</li>
<li>Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor%3A+models%2C+biology%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation.</a> Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+inactivation+of+Pten+with+EGFR+overexpression+in+Schwann+cells+models+sporadic+MPNST%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST.</a> Sarcoma. 2012, 620834(2012).</li>
<li>Miettinen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+evaluation+of+atypical+neurofibromatous+tumors+and+their+transformation+into+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+in+patients+with+neurofibromatosis+1-a+consensus+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview.</a> Human Pathology. 67, 1-10 (2017).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Magallon-Lorenz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+genomic+analysis+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+lines+challenges+current+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis.</a> iScience. 26 (2), 106096(2023).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+neuregulin-1%2FErbB+signaling+pathway+promotes+the+proliferation+of+neoplastic+Schwann+cells+in+human+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).</li>
<li>Kohli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pan+erbB+inhibitor+PD168393+enhances+lysosomal+dysfunction-induced+apoptotic+death+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).</li>
<li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Vogel, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tumor+model+for+neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1.</a> Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).</li>
<li>Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReuss%2C+DE+%22WHO+Classification+of+Tumours+of+the+Central+Nervous+System%2C+Revised+4th+Edition%22">WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition</a>. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).</li>
<li>Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+sarcoma+preclinical+modeling%3A+integrating+transgenic+mouse+models+and+patient-derived+models+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research.</a> Cancers. 15 (3), 588(2023).</li>
<li>Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+hematopoietic+progenitor+cell+antigen+CD34+in+vascular+and+spindle+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cutaneous+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors.</a> Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD-34+is+expressed+by+a+distinctive+cell+population+in+peripheral+nerve%2C+nerve+sheath+tumors%2C+and+related+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).</li>
<li>Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+gene+functions+in+tumorigenesis+by+ex+vivo+ablation+of+floxed+alleles+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).</li>
<li>Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+titrating+antibodies+for+immunocytochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).</li>
<li>Brossier, N. M., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+shed+new+light+on+the+pathogenesis+of+neurofibromatosis+type+I-related+neoplasms+of+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system.</a> Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的组织学与生物化学方法为神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤（MPNST）发生机制的基因工程小鼠（GEM）模型的诊断与表征提供了框架。多年来，我们发现这些方法在评估GEM模型中发生的外周神经鞘膜肿瘤病理方面非常有用21,25,26。然而，尽管本文概述的方案有助于确定GEM模型中肿瘤在多大程度上准确再现了人类对应肿瘤的病理特征，但这些策略仍存在一些局限性，需加以认识。首先，P0-GGFβ3 小鼠的肿瘤表型几乎完全外显，这使得获得大量带有神经纤维瘤和MPNST的小鼠相对容易，可用于基因组研究以及全基因组规模的shRNA筛选21,25,26。该模型中表型的高外显率也使P0-GGFβ3小鼠在临床前试验中具有较高应用价值。然而应认识到，并非所有GEM癌症模型都具有这一特点。因此，我们强调了确定可预测发生肿瘤的动物比例的重要性。当使用肿瘤发生频率较低的动物模型时，我们发现采用磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）等影像学手段来明确识别携带肿瘤的个体，进而将其纳入临床前试验或其他研究，是一种有利策略。然而，若需重复扫描，该方法可能因成本过高而难以实施。因此，我们也强调了明确所关注GEM模型的平均生存时间的重要性26——了解动物预期发生肿瘤的时间，可减少为识别具有目标表型个体所需的扫描次数，从而降低相关成本。
还需要认识到，小鼠体内体积较大的肿瘤实际上仍是相对少量的组织。在本方案中，我们建议将肿瘤组织均分为三部分，分别用于组织学/免疫组织化学分析、建立早期传代细胞培养以及目标生物分子（蛋白质、RNA、DNA）的提取。然而，肿瘤大小存在差异，若肿瘤体积较小，则可能无法获得足够的组织以进行上述分割。在此情况下，研究人员需判断应优先进行肿瘤诊断还是其他用途的组织利用。32在此情况下，我们的倾向是：在开展其他实验之前，必须先获得准确的诊断，以明确所研究的对象。我们发现，通常仅需使用不到三分之一的肿瘤组织即可建立明确的肿瘤诊断。在处理较小的肿瘤时，我们通常会取下一小块肿瘤组织，用组织学包埋纸包裹后放入组织盒中，以确保组织在后续处理过程中不会丢失。这种方法的缺点是，若需按照世界卫生组织（WHO）标准进行分级，可能会导致研究者对肿瘤的分级偏低；其原因是，癌症中常同时存在低级别和高级别的区域，若取样过小，则所得分级结果将取决于所取样本在肿瘤中的具体位置。
我们所描述的用于确定周围神经鞘瘤身份的方案在很大程度上依赖于免疫组织化学。尽管对于某些细胞类型偶尔可采用替代方法（例如，进行Unna染色以鉴定肥大细胞），但对于神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤中大多数细胞类型而言，这种情况并不普遍适用。因此，必须格外谨慎，确保所使用的免疫组织化学实验流程已得到适当优化。根据我们的经验，多个因素可能会影响诊断性免疫组织化学的结果。研究者在首次使用某种一抗时，必须进行梯度稀释实验；此外，在使用先前已优化过抗体的新批次时，也应重新进行梯度稀释实验33。同时必须注意确保试剂的新鲜度。根据我们的经验，过氧化氢和DAB在存放时间较长后特别容易失效，可能导致研究者错误地判断染色结果为阴性。
我们所描述的丛状神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及在MPNST鉴别诊断中需考虑的各种肿瘤的免疫组织化学谱，是我们在实践中最常遇到的情况21,25,26,34。然而，由于MPNST及其他此类恶性肿瘤常出现分化方向的异质性，研究者可能会遇到与本文所述略有不同的染色模式。正是由于这些细微差异，我们强烈建议在对新的基因工程小鼠（GEM）肿瘤发生模型进行表征时，团队中应包括一位具有经验的人类或兽医病理学家。在本方案中，我们已将世界卫生组织（WHO）分级系统应用于GEM模型及人类MPNST。我们倾向于使用该分级系统，是因为其分级标准相对明确，且便于在人类与小鼠MPNST之间进行比较2,28。但需要指出的是，WHO分级标准并未被所有病理学家一致接受，原因是目前尚不明确应用于MPNST的三个WHO等级是否能够有效预测患者的临床预后。因此，许多病理学家更倾向于将MPNST简单地分为低级别或高级别恶性肿瘤。按照这一分类方法，约85%的MPNST被视为高级别恶性肿瘤，其特征为活跃的有丝分裂活性、显著的细胞异型性和深染性，且常伴有肿瘤坏死。低级别MPNST则表现为较低的细胞密度、较轻的核深染以及较少的有丝分裂活性。
我们发现，异体移植早期传代的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞是验证这些细胞系致瘤性的简便方法。然而，当细胞未能成功建立异体移植模型时，需考虑一些问题32。根据我们的经验，尽管绝大多数早期传代的MPNST细胞能够成功建立异体移植，但偶尔也会遇到早期传代细胞系无法成瘤的情况。尽管如此，染色体微阵列比较基因组杂交（aCGH）和全外显子组测序结果表明，这些早期传代的细胞仍存在多种基因组异常，符合肿瘤细胞的特征25,26。此外，我们也发现某些早期传代的细胞状态不佳，通常是因为在收获用于移植前让细胞过度生长至汇合状态所致。因操作不当而受损的细胞（例如，使用非酶解细胞解离液孵育时间过长，或反复吹打次数过多）在移植后表现也较差。我们还需指出，文中所提及的移植建立所需时间是基于我们经验的估计值。偶尔我们会遇到某些早期传代细胞系虽能成功建立异体移植，但所需时间更长。
上述方法为表征新开发的外周神经系统肿瘤GEM模型的关键特征，以及准确诊断这些动物出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）提供了全面的手段。我们概述的建立早期传代MPNST细胞培养物并利用这些培养物进行同种移植的方法，也为GEM模型中鉴定出的肿瘤的致瘤性提供了明确证据。需要强调的是，在建立早期传代培养物时，我们并未进行单克隆筛选。尽管我们认识到将肿瘤细胞置于培养环境中时不可避免地会发生一定程度的筛选，但这些初步结果表明，早期传代GEM来源的MPNST培养物中鉴定出的突变与原发肿瘤中的突变高度相似。然而，通过aCGH分析，我们还发现，若将这些早期传代培养物继续进行更长时间的传代，其基因组将发生改变，并逐渐偏离这些肿瘤细胞早期传代时的基因组特征。

在过去三十年中，许多实验室尝试通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组，或过表达在人类癌症中过表达的基因产物，来构建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠（GEM）模型可用于多种目的，例如证实新引入的基因组修饰能够启动肿瘤发生、鉴定在肿瘤进展过程中继发发生的其他遗传或表观遗传改变，以及明确驱动肿瘤起始和进展的关键信号通路。与依赖免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有完全功能的免疫系统，因此能更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，在使用GEM癌症模型进行上述研究时，研究人员必须确认在GEM肿瘤中获得的观察结果与其对应的人类肿瘤具有相关性。这种验证应包括对GEM肿瘤病理学特征的全面评估，并确定GEM肿瘤的病理特征是否重现了相应人类肿瘤类型的病理表现。
肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）是影响人类神经系统的最常见遗传性疾病，其发生率约为每3,000至3,500名活产婴儿中1例1,2,3。NF1患者会在皮肤中（称为皮肤神经纤维瘤）以及大神经和神经丛中（称为丛状神经纤维瘤）出现多个良性的周围神经鞘瘤。尽管皮肤神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤均会因造成身体、行为和/或社交功能障碍而降低患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤（PNs）尤其危险4,5。&#160;这是因为PNs常转化为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs），后者是一种侵袭性梭形细胞肿瘤，其生存率极低1,2。造成这种低生存率的主要原因是目前用于治疗MPNSTs的放疗和化疗方案效果不佳。然而，开发新的更有效的治疗方法一直面临挑战。这主要是因为尽管MPNSTs在NF1患者中较为常见，但总体上仍属于罕见肿瘤。因此，很难获得足够数量的人类肿瘤用于研究，也难以招募到足够的MPNST患者开展临床试验。为了克服这些局限性，研究人员已构建了多种基因工程小鼠（GEM）模型，旨在进一步揭示驱动神经纤维瘤发病机制及丛状神经纤维瘤向MPNST进展的异常机制，并推动候选治疗药物的临床前试验。
NF1 患者在 NF1 基因的一个拷贝中存在失活性突变。当施万细胞谱系中的某个细胞在另一个原本功能正常的 NF1 基因上发生失活性突变时，会触发神经纤维瘤的发生。然而令人意外的是，当构建携带生殖系 Nf1 失活性突变的小鼠时，这些小鼠并未出现神经纤维瘤6,7。随后的研究表明，当小鼠的施万细胞中 Nf1 基因完全缺失，同时其他所有细胞类型中 Nf1 呈单倍剂量不足（即 Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠）时，可发展出丛状神经纤维瘤，这提示在其他多种细胞类型中 Nf1 基因剂量的降低是神经纤维瘤发生所必需的8。即便如此，Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠中的丛状神经纤维瘤仍未能进展为恶性周围神经鞘瘤（MPNST），因此仅部分模拟了人类对应疾病的生物学特征。当 Nf1 突变与其他肿瘤抑制基因（如 Trp539 或 Cdkn2a10）的突变共同存在时，才可引发 MPNST 的发生；但在这些基因工程小鼠（GEM）模型中，MPNST 多为 de novo 发生，或起源于生物学潜能未明的非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBPs）11,12，而非由已存在的良性丛状神经纤维瘤转化而来（参见文献13,14 对这些模型的详尽综述，以及引入其他与 MPNST 相关的功能缺失突变（如 Suz12 和 Pten 基因）的其他模型15）。
这些小鼠模型对于确定NF1、TP53和CDKN2A等基因在NF1相关周围神经系统肿瘤发病机制中的作用，以及用于候选治疗药物的临床前试验具有不可估量的价值。然而，我们对丛状神经纤维瘤如何进展为生物学潜能不确定的非典型神经纤维瘤性肿瘤（ANNUBPs16），进而发展为恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的过程仍缺乏完整认识。近期有报道指出，Nf1和Arf基因缺失的小鼠可发展出ANNUBPs并进一步进展为MPNSTs，这在理解该过程方面取得了一些进展11。然而，目前尚无基于Nf1突变的小鼠模型能够完全模拟人类中所见的丛状神经纤维瘤向MPNSTs进展的全过程。此外，是否存在着多条不同的通路导致MPNSTs的发生尚不明确。因此，上述基因工程小鼠（GEMs）可能仅模拟了导致神经纤维瘤向MPNSTs进展及MPNST发病的多种不同通路中的某一部分。这一点由以下事实进一步强调：MPNSTs也可散发发生，且部分散发性MPNSTs显然并不携带NF1突变17,18。
尽管 Magollon-Lorenz 等人最近提出，至少部分缺乏 NF1 突变的散发性恶性周围神经鞘瘤（MPNST）实际上是黑色素瘤或另一种类型的肉瘤19，但我们近期报道了一例散发性 MPNST 及其来源的细胞系（2XSB 细胞），该肿瘤为 NF1 野生型20。在对原发肿瘤及 2XSB 细胞系进行特征分析过程中，我们系统性地排除了其他可能的诊断，包括黑色素瘤以及在散发性恶性周围神经鞘瘤鉴别诊断中常规需考虑的多种其他肉瘤类型20。此外，我们注意到 Magollon-Lorenz 等人承认，他们在所研究的三株散发性 MPNST 细胞系中的发现并不能推广至所有被鉴定为散发性 MPNST 的肿瘤，即不能据此推断所有此类肿瘤均非 MPNST。
为了构建一种神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）发病机制不一定依赖于特定肿瘤抑制基因突变的GEM模型，我们构建了转基因小鼠模型，其中在施万细胞特异性髓鞘蛋白零（P0）启动子驱动下，强效施万细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1）发生过表达。0）启动子（P0-GGFβ3 小鼠)21我们先前已证实，人类神经纤维瘤、恶性周围神经鞘瘤（MPNST）以及MPNST细胞系均表达多种NRG1异构体，同时表达介导NRG1信号传导的erbB受体酪氨酸激酶（erbB2、erbB3和erbB4），且这些erbB受体处于持续活化状态。22我们还证明了erbB激酶的药理学抑制剂能有效抑制恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的增殖22生存23和迁移24. 与我们在人类中的观察结果一致，P0-GGFβ3 小鼠可形成丛状神经纤维瘤25 高频率进展为恶性周围神经鞘瘤21,25我们已证明 P0-GGFβ3 MPNSTs 与其人类对应物相似，通常会发生突变 Trp53 和 Cdkn2a以及可能促进肿瘤发生的众多其他基因组异常25. 发生于P的恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）0-GGFβ3 小鼠不具有失活的 Nf1 突变。然而，通过遗传互补实验，我们证明了 NRG1 能够促进 P 中的肿瘤发生0-GGFβ3 小鼠主要通过与之发生改变的相同信号级联途径 Nf1 损失26；这一结论基于我们的发现，即用 NRG1 过表达替代 Nf1 存在时的损失 Trp53 单倍剂量不足 (P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠）可产生发生恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的动物模型 从头合成，如顺式结构中所见Nf1+/-;Trp53+/- 小鼠27.
为了获得上述及其他相关信息，以证明 P0-GGFβ3 小鼠能够准确模拟 NF1 患者中观察到的神经纤维瘤发病过程以及神经纤维瘤向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）进展的过程，我们已开发出一系列专门的方法，用于处理这些动物的组织样本，准确诊断其肿瘤，对这些小鼠中出现的 MPNST 进行分级，并建立和表征早期传代的 P0-GGFβ3 及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 细胞培养体系，同时系统性地比较 P0-GGFβ3 PN 和 MPNST 以及 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 与相应人类肿瘤的病理特征。这些方法中的许多可推广应用于其他神经系统肿瘤的基因工程小鼠（GEM）模型。此外，其中部分方法还可更广泛地适用于肿瘤发生于其他器官部位的 GEM 模型。因此，本文将详细描述这些方法学流程。

<table><tbody><tr><td>100 mm 组织培养板</td><td>康宁 Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺（DAB）</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-400</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 二抗（山羊抗小鼠）</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗小鼠）</td><td>Invitrogen</td><td>A21043 或 A11004</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 二抗（山羊抗兔）</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（NH₄Cl）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>钙调蛋白结合蛋白</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>E89，ab32330</td><td></td></tr><tr><td>CD117</td><td>Cell Marque</td><td>117R-18-ASR</td><td></td></tr><tr><td>CD163</td><td>Leica</td><td>NCL-L-CD163</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>ab29364</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>ab81289</td><td></td></tr><tr><td>CD86</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>ab53004</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>康宁</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolve Hybrid（基于d-柠檬烯的溶剂）</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>C-11, ab7753</td><td></td></tr><tr><td>结蛋白</td><td>安捷伦 Dako&amp;nbsp;</td><td>克隆 D33 (M0760)</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺（DAB）溶液</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>康宁</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>Forksolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>康宁</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>Fisherbrand</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Brightline-Hauser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>327-500</td><td></td></tr><tr><td>Iba1</td><td>和光纯药工业株式会社</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，小鼠抗小鼠</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-2400</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP（过氧化物酶）聚合物试剂盒，马抗兔</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Heracell 240i CO₂培养箱</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A415</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>12202</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MART1</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>M2-9E3，ab187369</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>人源：MAD5236（10C2），人源：MAB353（Rat-401）</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin 1 beta</td><td>内部</td><td>由 S.L.C. 制备（也可从 R 获得，货号 396-HB-050/CF）&amp;amp;D Systems</td><td></td></tr><tr><td>神经纤维瘤蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-67</td><td></td></tr><tr><td>NOD.Cg-&lt;em&gt;Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt; Il2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/SzJ 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>沃尔玛</td><td>优质之选品牌</td><td></td></tr><tr><td>P&lt;sub&gt;0&lt;/sub&gt;-GGF&amp;beta;3只小鼠</td><td>内部</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Leica</td><td>Paraplast 39601006</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Permount（二甲苯封片介质）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toldedo</td><td>Seven Excellence, 8603</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Dulbecco改良型）</td><td>康宁</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PMEL</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>EP4863(2)，ab137078</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>便携式异氟烷麻醉机</td><td>VetEquip 吸入式麻醉系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVA-DABCO（水性封片剂）</td><td>默克生命科学</td><td>10981100ML</td><td></td></tr><tr><td>电饭煲</td><td>Beech Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S100B</td><td>安捷伦 Dako&amp;nbsp;</td><td>Z0311&amp;nbsp; （现为 GA504）</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Ventana Medical Systems&amp;nbsp;</td><td>克隆 1A4</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠（二水合物）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Sox10</td><td>ABCAM&amp;nbsp;</td><td>ab212843</td><td></td></tr><tr><td>钢制组织学模具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>TCF4/TCFL2&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导&amp;nbsp;</td><td>(CH48H11) #2569</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>ACROS Organics</td><td>348600050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>康宁</td><td>25-051-31</td><td></td></tr></tbody></table>

在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models

患有常染色体显性遗传肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者常出现丛状神经纤维瘤（PN），这些肿瘤随后可转化为高度侵袭性的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。若能获得可精确模拟人类NF1患者中PN向MPNST进展过程的基因工程小鼠（GEM）模型，将有助于深入理解PN转化为MPNST的机制。然而，现有的Nf1基因敲除GEM模型并不能完全重现这一过程。因此，我们开发了P0-GGFβ3小鼠模型，这是一种通过在雪旺细胞中过表达雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1（NRG1），从而高频率诱导PN形成并进展为MPNST的GEM模型。然而，为了确定P0-GGFβ3小鼠中肿瘤发生及恶性进展过程是否真实模拟了NF1患者体内的病理过程，我们必须首先证实P0-GGFβ3小鼠周围神经鞘瘤的病理特征与其人类对应肿瘤的病理特征一致。
本文介绍了利用P0-GGFβ3和P0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠模型作为示例，在基因工程小鼠（GEM）模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专门方法。我们描述了用于诊断丛状神经纤维瘤（PNs）和恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）的组织学、免疫组织化学和组织化学方法，如何将这些肿瘤与其他病理表现相似的肿瘤类型相鉴别，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们还讨论了从GEM来源的MPNSTs建立早期传代培养物的方法，利用免疫细胞化学对这些培养物进行表征，以及通过建立同种移植模型来验证其致瘤性。总体而言，这些技术可全面表征在GEM模型中出现的PNs和MPNSTs的病理特征，并对这些小鼠肿瘤与其人类对应物的病理学进行关键性比较。

我们已建立一种方法，用于评估基因工程小鼠中神经系统肿瘤是否能准确再现其人类对应疾病的病理特征。在此，我们将这些组织学技术、明确的病理学标准以及培养方法应用于P0-GGFβ3小鼠模型中发生的神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤。

患有常染色体显性遗传肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）的患者常出现丛状神经纤维瘤（PNs），其会……

我们的研究团队专注于神经纤维瘤病1型，致力于理解与该疾病相关的癌症——丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤的病理机制。为此，我们采用多种技术手段，包括使用一种基因工程小鼠模型P0-GGF-beta-3。我实验室及其他研究丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤的实验室均面临相似的挑战。获取患者来源的肿瘤样本受限，阻碍了我们的研究工作。因此，构建和鉴定基因工程小鼠模型对于持续研究疾病机制以及潜在治疗方法的开发至关重要。周围神经肿瘤的识别较为困难，常被误诊为其他类型的癌症。为避免这一问题，我们开发了一种详细的方案，结合组织学、免疫组织化学和分级方法，以准确识别和分级这些肿瘤。这提高了未来研究的可靠性。我们的工作为研究和验证基因工程小鼠模型来源的肿瘤提供了一个框架，以确保其能够准确模拟人类疾病。我们将利用现有的基因工程小鼠模型来研究肿瘤微环境以及肿瘤转化所必需的因素，探讨丛状神经纤维瘤向恶性外周神经鞘瘤进展的原因。首先在P0-GGF-beta-3小鼠中识别出明显可见的大型肿瘤。在处死小鼠后，于无菌条件下解剖肿瘤。检查肿瘤是否与外周神经相关，并切除肿瘤。然后将明显可见的肿瘤分成三份。一份用于组织学检查，一份用于早期传代培养。将组织样本置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中进行组织学固定。将第三份样本冷冻，以备将来可能的实验使用。将组织样本及动物尸体的其余部分置于多聚甲醛PBS混合液中，在4摄氏度下过夜。一只P0-GGF-beta-3小鼠右侧 flank 区域出现体积较大的肉眼可见肿瘤，该小鼠的MRI扫描图像显示肿瘤与坐骨神经相连。组织学检查证实该肿瘤为神经纤维瘤。此外，还发现一只动物臂丛来源的肉瘤样恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。首先，取 P0-GGF-beta-3 小鼠的石蜡包埋肿瘤切片，用基于 d-柠檬烯的溶剂在室温下脱蜡 10 分钟。然后将切片置于新鲜的 d-柠檬烯基溶剂中，再孵育 10 分钟。用伊红对切片染色后，在保持载玻片被 d-柠檬烯基溶剂润湿的条件下，使用含二甲苯的封片介质封片。为了检查脊髓和神经根是否存在神经根肿瘤，将椎骨、相关肋骨及软组织置于 0.3 摩尔 EDTA 和 4% 多聚甲醛溶液中孵育。随后使用 PBS 冲洗样本。尝试用针刺穿椎骨以确认脱钙是否完成。针头应无阻力地刺入完全脱钙的骨组织。将脱钙的脊柱及关联结构切成适合放入组织包埋盒的小块，并进行所需的染色。在独立发生的恶性周围神经鞘瘤中观察到针对MPNST标志物的适当标记。在充分脱钙的脊柱中，脊髓、神经根、椎体和骨骼肌清晰可见。在一只P0-GGF-beta-3小鼠中还观察到背根神经鞘瘤。在明场显微镜下检查P0-GGF-beta-3小鼠的苏木精和伊红染色肿瘤切片，以识别潜在的周围神经鞘瘤。确保微小神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）与周围神经相关。识别可能含有周围神经鞘肿瘤的组织块，并进行特殊染色以确认或排除诊断。根据组织学特征区分潜在的周围神经鞘肿瘤（PNSTs）与恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）。人和P0-GGF-beta-3小鼠PNs具有细长且呈波浪状的细胞核，细胞排列疏松，由黏液样细胞外基质分隔。有丝分裂的存在以及肿瘤细胞丰富提示为恶性周围神经鞘瘤（MPNST）或高级别肿瘤。随后使用明场显微镜检查免疫染色切片。寻找MPNST中提示雪旺细胞分化的标志物S100 beta、Nestin和SOX10的均匀或斑片状免疫反应性。检查四级MPNST切片中明显的细胞丰富、活跃的有丝分裂活性及细胞学非典型性。神经纤维瘤由肿瘤性雪旺细胞及其他非肿瘤性成分构成，S100 beta染色显示部分细胞亚群呈阳性可证实这一点。肿瘤性许旺细胞也表达中间丝蛋白Nestin和转录因子SOX10。对P0-GGF-beta-3小鼠的丛状神经纤维瘤进行Luna染色，显示出肥大细胞的存在，而恶性周围神经鞘瘤（MPNST）中通常缺乏此类细胞。相反，丛状神经纤维瘤中Ki67免疫反应性几乎不存在，而在P0-GGF-beta-3小鼠三叉神经节来源的显微镜下MPNST中，肿瘤细胞核的Ki67标记率通常非常高。首先，将无菌盖玻片放入六孔组织培养板的孔中，并加入足量的多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白溶液，使其完全覆盖盖玻片。接着，用塑料封膜密封培养板以防止蒸发，并在4°C条件下孵育过夜。次日早晨，用无菌PBS洗涤盖玻片三次。向含有盖玻片的每个孔中加入2毫升细胞悬液和培养基，使每孔接种10,000个细胞。用PBS洗涤盖玻片后，使用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞，孵育18分钟。免疫染色前，用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。将免疫染色并洗涤后的盖玻片在1至5微克的Hoechst染料中孵育10分钟。随后用PBS额外洗涤5分钟。使用等体积的PBS和甘油混合液封片，并用荧光显微镜采集图像。用非酶细胞解离液处理细胞 30 秒至 1 分钟。然后每 1 毫升非酶细胞解离试剂中加入 5 毫升 DMEM。使用血细胞计数板对细胞进行计数。以5 ×g离心5分钟。用100微升DMEM重悬细胞，细胞浓度为每100微升含1×10⁶至2×10⁶个细胞。将动物置于俯卧位，并用70%乙醇消毒注射部位。在右侧 flank 皮下注射 1 至 2 次，每次 10 的 6 次方个细胞。将小鼠单独置于无垫料的笼子中，使其恢复。为防止低体温，将笼子的一部分放在加热垫上。展示了早期传代P0-GGF-beta-3 MPNST细胞的低倍和高倍图像。这些细胞具有致瘤性，能够在软琼脂中形成集落，并在免疫缺陷小鼠中形成移植物。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

在基因工程小鼠模型中识别、诊断和分级恶性周围神经鞘瘤

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本文介绍了在基因工程胰腺癌小鼠模型中应用高分辨率超声成像的方法。主要目的是提供检测和评估内源性胰腺肿瘤的详细操作指南。...

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本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。...

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利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

黑色素瘤是一种极具侵袭性的疾病，会迅速扩散至其他器官。本方案描述了超高频超声成像结合三维重建技术的应用，用于监测转移性黑色素瘤Braf/Pten小鼠模型中腹股沟淋巴结体积的变化。...

通过超高频超声成像分析Braf/Pten基因工程小鼠黑色素瘤模型中的淋巴结体积

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

本方法论文的目的是展示一种稳健且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤组织中富集、生成并扩增原代肿瘤细胞系。...

原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤细胞系的建立与扩增

了解利用P0-GGF-beta-3基因工程小鼠模型识别和分级恶性周围神经鞘瘤的病理学方法。该技术结合组织学与免疫组化，为神经纤维瘤病相关肿瘤研究提供可靠框架。

在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

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