在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

我们的研究团队专注于神经纤维瘤病1型，致力于理解与该疾病相关的癌症——丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤的病理机制。为此，我们采用多种技术手段，包括使用一种基因工程小鼠模型P0-GGF-beta-3。我实验室及其他研究丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤的实验室均面临相似的挑战。

获取患者来源的肿瘤样本受限，阻碍了我们的研究工作。因此，构建和鉴定基因工程小鼠模型对于持续研究疾病机制以及潜在治疗方法的开发至关重要。周围神经肿瘤的识别较为困难，常被误诊为其他类型的癌症。

为避免这一问题，我们开发了一种详细的方案，结合组织学、免疫组织化学和分级方法，以准确识别和分级这些肿瘤。这提高了未来研究的可靠性。我们的工作为研究和验证基因工程小鼠模型来源的肿瘤提供了一个框架，以确保其能够准确模拟人类疾病。

我们将利用现有的基因工程小鼠模型来研究肿瘤微环境以及肿瘤转化所必需的因素，探讨丛状神经纤维瘤向恶性外周神经鞘瘤进展的原因。首先在P0-GGF-beta-3小鼠中识别出明显可见的大型肿瘤。在处死小鼠后，于无菌条件下解剖肿瘤。

检查肿瘤是否与外周神经相关，并切除肿瘤。然后将明显可见的肿瘤分成三份。一份用于组织学检查，一份用于早期传代培养。

将组织样本置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中进行组织学固定。将第三份样本冷冻，以备将来可能的实验使用。将组织样本及动物尸体的其余部分置于多聚甲醛PBS混合液中，在4摄氏度下过夜。

一只P0-GGF-beta-3小鼠右侧 flank 区域出现体积较大的肉眼可见肿瘤，该小鼠的MRI扫描图像显示肿瘤与坐骨神经相连。组织学检查证实该肿瘤为神经纤维瘤。此外，还发现一只动物臂丛来源的肉瘤样恶性周围神经鞘瘤（MPNST）。

首先，取 P0-GGF-beta-3 小鼠的石蜡包埋肿瘤切片，用基于 d-柠檬烯的溶剂在室温下脱蜡 10 分钟。然后将切片置于新鲜的 d-柠檬烯基溶剂中，再孵育 10 分钟。用伊红对切片染色后，在保持载玻片被 d-柠檬烯基溶剂润湿的条件下，使用含二甲苯的封片介质封片。

为了检查脊髓和神经根是否存在神经根肿瘤，将椎骨、相关肋骨及软组织置于 0.3 摩尔 EDTA 和 4% 多聚甲醛溶液中孵育。随后使用 PBS 冲洗样本。尝试用针刺穿椎骨以确认脱钙是否完成。

针头应无阻力地刺入完全脱钙的骨组织。将脱钙的脊柱及关联结构切成适合放入组织包埋盒的小块，并进行所需的染色。在独立发生的恶性周围神经鞘瘤中观察到针对MPNST标志物的适当标记。

在充分脱钙的脊柱中，脊髓、神经根、椎体和骨骼肌清晰可见。在一只P0-GGF-beta-3小鼠中还观察到背根神经鞘瘤。在明场显微镜下检查P0-GGF-beta-3小鼠的苏木精和伊红染色肿瘤切片，以识别潜在的周围神经鞘瘤。

确保微小神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）与周围神经相关。识别可能含有周围神经鞘肿瘤的组织块，并进行特殊染色以确认或排除诊断。根据组织学特征区分潜在的周围神经鞘肿瘤（PNSTs）与恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）。

人和P0-GGF-beta-3小鼠PNs具有细长且呈波浪状的细胞核，细胞排列疏松，由黏液样细胞外基质分隔。有丝分裂的存在以及肿瘤细胞丰富提示为恶性周围神经鞘瘤（MPNST）或高级别肿瘤。随后使用明场显微镜检查免疫染色切片。

寻找MPNST中提示雪旺细胞分化的标志物S100 beta、Nestin和SOX10的均匀或斑片状免疫反应性。检查四级MPNST切片中明显的细胞丰富、活跃的有丝分裂活性及细胞学非典型性。神经纤维瘤由肿瘤性雪旺细胞及其他非肿瘤性成分构成，S100 beta染色显示部分细胞亚群呈阳性可证实这一点。

肿瘤性许旺细胞也表达中间丝蛋白Nestin和转录因子SOX10。对P0-GGF-beta-3小鼠的丛状神经纤维瘤进行Luna染色，显示出肥大细胞的存在，而恶性周围神经鞘瘤（MPNST）中通常缺乏此类细胞。相反，丛状神经纤维瘤中Ki67免疫反应性几乎不存在，而在P0-GGF-beta-3小鼠三叉神经节来源的显微镜下MPNST中，肿瘤细胞核的Ki67标记率通常非常高。

首先，将无菌盖玻片放入六孔组织培养板的孔中，并加入足量的多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白溶液，使其完全覆盖盖玻片。接着，用塑料封膜密封培养板以防止蒸发，并在4°C条件下孵育过夜。次日早晨，用无菌PBS洗涤盖玻片三次。

向含有盖玻片的每个孔中加入2毫升细胞悬液和培养基，使每孔接种10,000个细胞。用PBS洗涤盖玻片后，使用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞，孵育18分钟。免疫染色前，用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。

将免疫染色并洗涤后的盖玻片在1至5微克的Hoechst染料中孵育10分钟。随后用PBS额外洗涤5分钟。使用等体积的PBS和甘油混合液封片，并用荧光显微镜采集图像。

用非酶细胞解离液处理细胞 30 秒至 1 分钟。然后每 1 毫升非酶细胞解离试剂中加入 5 毫升 DMEM。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

以5 ×g离心5分钟。用100微升DMEM重悬细胞，细胞浓度为每100微升含1×10⁶至2×10⁶个细胞。将动物置于俯卧位，并用70%乙醇消毒注射部位。

在右侧 flank 皮下注射 1 至 2 次，每次 10 的 6 次方个细胞。将小鼠单独置于无垫料的笼子中，使其恢复。为防止低体温，将笼子的一部分放在加热垫上。

展示了早期传代P0-GGF-beta-3 MPNST细胞的低倍和高倍图像。这些细胞具有致瘤性，能够在软琼脂中形成集落，并在免疫缺陷小鼠中形成移植物。