Name: 人体骨骼肌的纤维类型鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习使用MyDoBID技术从冻干人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并根据肌球蛋白重链亚型进行分类鉴定。该方法可分析I型和II型肌纤维的蛋白质表达差异，为研究肌肉生物学、衰老和运动生理学提供可靠的细胞水平分析手段。

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本研究中使用的抗 MHC I（A4.840）和抗 MHCIIa（A4.74）抗体由 H. M. Blau 博士研发，抗 MHCIIx（6H1）抗体由 C. A. Lucas 博士研发，并从发育研究杂交瘤库（DSHB）获得，该库由美国国立儿童健康与人类发育研究所资助，并由爱荷华大学生物科学系（爱荷华市，IA）维护。我们感谢 Victoria L. Wyckelsma 为本研究提供人类肌肉样本。图 1 中的大部分图像来源于 BioRender.com。
资金支持： 
本研究未获得外部资金支持。

在无菌条件下，使用局部麻醉（利多卡因）和改良的手动负压吸引 Bergstrom 针，从 n = 3 名（2 名男性，1 名女性）年龄为 70–74 岁的受试者股外侧肌获取人体肌肉样本11,12。这些样本来自先前一项经维多利亚大学人类研究伦理委员会（HRETH11/221）批准并遵循《赫尔辛基宣言》开展的研究13。 所有参与者均签署书面知情同意书，同意参加本研究。本方案所需全部材料的完整详情见材料表。此外，表 1 中提供了针对常见实验方案问题的故障排除策略列表。
1. 冷冻干燥
<ol>
	<li>将活检的肌肉样本保持在干冰上冷冻的同时，在天平上称量并去皮一个空的冷冻管。</li>
	<li>迅速称取至少 10 mg 湿重的冷冻组织，记录重量至小数点后一位。</li>
	<li>将组织放入已预先冷却的微量离心管中，管盖上已穿刺 3–4 个小孔，并将该管放入装有 2–3 粒干冰的小烧杯中。</li>
	<li>按照冷冻干燥机制造商的操作说明进行操作。</li>
	<li>确保冷冻干燥机上的所有阀门均已关闭，然后打开冷冻干燥机电源。</li>
	<li>使用控制面板检查真空设定值是否已设置为适用于人体组织的最佳冷冻干燥条件，即 0.12 毫巴 (mBar)（图 2）。</li>
	<li>在冷冻干燥机上按下 手动 模式，等待腔室冷却至 −40 oC。</li>
	<li>当腔室达到该温度后，取下盖子，然后取下玻璃腔室，将烧杯（含肌肉样本）放置在金属台上。</li>
	<li>重新安装玻璃腔室和盖子，关闭盖子上的真空释放阀，并等待真空指示灯变为绿色，以确保干燥机已达到真空密封状态。</li>
	<li>将肌肉样本冷冻干燥 48 小时。冷冻干燥完成后，按下真空按钮关闭真空泵，并打开盖子上的真空释放阀。</li>
	<li>取下腔室盖子，取出冻干后的样本。称量组织并记录重量至小数点后一位。</li>
	<li>计算重量减少的百分比；约 75% 的重量下降表明组织已成功冻干（本研究中，平均值 ± 标准差为 76 ± 9%，n = 11 个肌肉样本）。</li>
	<li>按下 自动 按钮以关闭真空泵和制冷系统，让设备恢复至室温。</li>
	<li>根据制造商的说明清洁冷却线圈，并从收集器中排出积聚的液体。 
	&#8203;注意：可立即开始纤维收集。若组织不用于纤维分离，请将冻干样本置于含干燥剂珠的密封容器中，并保存于 -80 °C。&#160; 警告：干冰属于危险品（第 9 类）；请参阅材料安全数据表（MSDS）以获取推荐的安全操作方法。</li>
</ol>
2. 纤维收集
<ol>
	<li>纤维收集样品的制备
	<ol>
		<li>标记至少50个微量离心管（Fiber 1至50），并向每个管中加入10 µL变性缓冲液。</li>
		<li>准备采集区域，配备两把精细组织解剖镊、无绒布、台式灯、体视显微镜（黑色载物台朝上）、涡旋振荡器和台式离心机。</li>
		<li>将冻干的肌肉样品置于培养皿盖上，再将皿盖放置于解剖显微镜的载物台上。</li>
		<li>观看单根肌纤维分离的视频。在开始研究之前，从纤维采集到单根肌纤维类型鉴定的完整方案至少练习两次。</li>
		<li>在收集纤维之前，计算 每次活检获取的每种纤维类型样本所需的总体积 如下所示。例如，若1根纤维的起始体积为10 µL，经MyDoBID处理后剩余体积为（1根纤维 × 10 µL）减去用于点印迹的1 µL，即9 µL（样品体积），则计算 所需总样本体积 通过将样品体积（µL）乘以将要进行的Western印迹数量，并将该量加倍以考虑冗余：（9 µL × 4次Western印迹）× 2 = 72 µL。计算 每种样本类型所需的纤维数量 通过将最终所需的样品体积（µL）除以每种纤维类型特异性的样品体积&#160;样品（例如，72 µL ÷ 9 µL = 8 根纤维）&#160;每种纤维类型对应的样本）。为实现此目标，需总共收集50根纤维。 
		注意：若上样蛋白量相当于约 3 mm 肌纤维（约 12 µg 湿重），则所需样品体积为同时进行 MyDoBID 和蛋白质印迹检测所需的最低蛋白浓度&#160;每个样品（参见&#160;补充文件 1&#160;有关详细信息）。然而，该体积未考虑特定蛋白质是否需要重复进行凝胶电泳。&#160; 注意：镊子尖端锋利，操作时需小心，避免刺伤皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单纤维分离
	<ol>
		<li>在一张5 cm × 1 cm的小纸片上，使用直尺画一条1 cm长的线段，并在线段上每隔1 mm做一标记。</li>
		<li>将此插入培养皿盖下方，作为估算所收集纤维长度的参考。</li>
		<li>将冻干的肌肉样本置于体视显微镜下，使用低倍放大（×7.5）。用一对精细的组织解剖镊子固定冻干肌肉，另一对镊子开始分离细小的纤维束（如视频所示）。</li>
		<li>分离出一束纤维，并继续解离，直至获得单根纤维片段&#160;从束中分离。</li>
		<li>收集至少50根长度不少于约1 mm的纤维。</li>
		<li>将纤维移至培养皿中的空置区域。在较高放大倍数（×50）下观察单根纤维片段。通过在末端进一步分离纤维以确认其为单根纤维。若纤维发生断裂而非分离，则表明其为单根纤维。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纤维的变性
	<ol>
		<li>使用镊子轻轻采集纤维，并直接放入分装好的变性缓冲液中（避免镊子接触缓冲液）。</li>
		<li>在显微镜下检查镊子，确认纤维已成功移除。盖紧管盖，将管底用力在实验台上敲击三次，以确保纤维进入缓冲液中。</li>
		<li>使用无尘纸将镊子擦拭干净，然后再移至下一根纤维。重复此过程，直至收集完所有纤维。</li>
		<li>涡旋纤维样品，并在2,500 × g下短暂离心5 s g 将样品吸至管底。 
		注意：离心时间（5 s）从开始时（0 ×）计时 g) 直至转速达到约 2,500 × g.</li>
		<li>将样品在室温下放置1小时，随后于-80 °C保存以备后续使用。使用前先将样品冷冻，然后解冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 点印迹
<ol>
	<li>膜的制备与活化
	<ol>
		<li>测量、标记并裁剪一张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（孔径 0.2 µm），使其适合 50 个样品（约 10.5 cm x 5.5 cm）。</li>
		<li>在左侧边缘从上到下用数字标记（1 至 10），在上侧边缘从左到右用字母标记（A 至 E），间隔 1 cm。</li>
		<li>准备四张尺寸为 12.5 cm x 7.5 cm 的滤纸。</li>
		<li>将两张滤纸叠放形成一叠，预先浸泡于 1× 转膜缓冲液中。</li>
		<li>将膜放入容器中，倒入 95% 乙醇，用量足以完全浸没膜（10–15 mL），在摇床上振荡 1 分钟。</li>
		<li>回收乙醇，将膜浸入 1× 转膜缓冲液（约 15 mL）中，继续在摇床上振荡 2 分钟。 
		注意：乙醇和转膜缓冲液均可在后续点印迹实验中重复使用，直至出现沉淀（使用六次后更换）。</li>
		<li>将浸透转膜缓冲液的滤纸叠放在平坦的可移动表面（如大盖子）上，并用滚筒压平。使用凝胶转移器或镊子将 PVDF 膜放置在滤纸叠上。</li>
		<li>在膜上方覆盖一张干燥的滤纸，用滚筒滚动以吸除膜表面多余的缓冲液。移除顶部滤纸时避免摩擦膜。 
		警告：甲醇（第 3 类，子风险 6.1）和乙醇（第 3 类）具有危害性。请参阅材料安全数据表（MSDS）以获取安全操作建议。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品在膜上的吸附
	<ol>
		<li>解冻纤维样品，在室温下短暂离心（5 秒），操作同步骤 2.3.4，并充分混匀样品。</li>
		<li>使用移液器加样时勿触碰膜表面，缓慢将每份样品约 1 µL 的液滴加至指定区域。每个纤维样品的指定区域尺寸约为 1 cm x 1 cm，应尽量将样品点加在该区域中心。</li>
		<li>让样品液滴至少渗透膜 15 分钟，确保无样品缓冲液残留且完全被吸收。</li>
		<li>使用塑料镊子小心将膜从湿润的滤纸叠上取下，置于一张干燥的滤纸上，干燥至少 5 分钟。</li>
		<li>当样品斑点完全变为白色后，重新活化膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜的再活化与封闭
	<ol>
		<li>重复步骤 3.1.5 和 3.1.6，对膜进行再活化。</li>
		<li>将膜放入洗涤缓冲液中，在摇床上振荡洗涤 5 分钟，弃去洗涤缓冲液。</li>
		<li>将膜置于封闭缓冲液中，在摇床上孵育 30 分钟。</li>
		<li>用洗涤缓冲液清洗膜 3 次，直至缓冲液不再浑浊。</li>
		<li>将膜保留在最后一次洗涤的缓冲液中，继续在摇床上振荡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫标记
<ol>
	<li>MHCIIa 的检测
	<ol>
		<li>将MHCIIa一抗用10 mL牛血清白蛋白（BSA）缓冲液按1:200比例稀释。</li>
		<li>弃去膜上的洗涤缓冲液，然后将稀释的MHCIIa抗体加入膜上。</li>
		<li>将装有膜（置于MHCIIa中）的容器置于摇床，在室温下孵育2小时，或在4 °C下过夜。</li>
		<li>回收MHCIIa抗体，并于4 °C保存。将膜置于摇床上，用封闭缓冲液洗涤2分钟。 
		注意：只要缓冲液保持澄清，所有一抗最多可重复使用五次。</li>
		<li>再冲洗两次，每次5分钟，共洗涤三次。</li>
		<li>将鼠源免疫球蛋白 G 辣根过氧化物酶（IgG-HRP）二抗用 10 mL 封闭缓冲液按 1:20,000 比例稀释后加入膜上。</li>
		<li>弃去洗涤缓冲液，将膜在鼠IgG-HRP二抗中室温摇床上孵育1小时。</li>
		<li>弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤膜（2次，每次5分钟）。</li>
		<li>将膜保留在最后一次洗涤液中浸泡，直至准备进行成像。</li>
		<li>打开凝胶成像仪，等待15分钟使仪器达到所需的工作温度，然后启动成像软件（参见 材料表).</li>
		<li>在软件窗口中，单击 新型单通道实验方案 (图3A）。如需获取膜的白光图像，在 应用 | 印迹 点击 比色法 (图3B).</li>
		<li>点击凝胶区域；每个选项均预设了特定尺寸，以适配不同类型凝胶的大小。请选择最符合膜尺寸的选项图3C).</li>
		<li>按1:1比例混合鲁米诺和过氧化物酶试剂以配制ECL工作液。配制的ECL混合液体积应足以覆盖整个膜，通常需要800–1,000 µL。</li>
		<li>将膜置于一个较大的透明塑料托盘上，并将ECL混合液均匀分散在膜上。</li>
		<li>将膜放置到成像板上。</li>
		<li>点击 放置凝胶 （黄色按钮）以获取实时摄像头画面。按住并拖动缩放按钮，以最大化膜的成像区域。&#160;如有需要，此时应校正膜的位置。&#160;</li>
		<li>点击 运行实验方案 （绿色按钮），等待膜的比色图像生成。保存该图像，以便将斑点与相应的纤维样品匹配。</li>
		<li>不移动膜，通过点击软件中相应选项来更换施加的程序 2 x 2 二合一像素合并 (Chemi 高分辨率) (图 3D).</li>
		<li>在下方 图像曝光与软件，优化 曝光时间，点击 微弱条带 (图3E) 信号累积模式.</li>
		<li>在……下方 设置，输入 1 s 对于 第一张图像，30 秒 对于 最后一张图像，以及 30 张图像 (图3F).</li>
		<li>点击 运行实验方案.</li>
		<li>在以下阶段保存图像： 在信号饱和之前 （所有可见点均为黑色）， 初始信号饱和 （部分点开始饱和），并且 过饱和斑点 （所有检测到强信号的斑点均过饱和）。</li>
		<li>在结束信号累积前保存所有必需的图像。将膜从成像仪中取出。</li>
		<li>使用凝胶释放器将膜重新放回含有洗涤缓冲液的容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MHCI 的检测
	<ol>
		<li>倒出洗涤缓冲液，将膜完全浸入洗脱缓冲液中，37 °C 处理 30 分钟。</li>
		<li>回收剥离缓冲液，用洗涤缓冲液在摇床上孵育膜5分钟进行冲洗。 
		注意： stripping 缓冲液在弃用前可重复使用 10 次。</li>
		<li>倒掉洗涤缓冲液，此次加入MHCI一抗，起始稀释浓度为1:200（范围为1:200至1:500），室温下摇床孵育1小时。</li>
		<li>孵育 MHCI 一抗后，回收抗体并按照步骤 4.1.4 和 4.1.5 洗涤膜。</li>
		<li>将鼠IgM HRP二抗用封闭缓冲液按1:20,000稀释。倒出膜上的封闭缓冲液，按照步骤4.1.7的方法加入鼠IgM二抗进行孵育。</li>
		<li>按照步骤 4.1.8 至 4.1.24 的方法进行洗涤和图像采集，检测 MHCI。 
		警告：剥离缓冲液含有有机膦 3-5%（第8类）。请参阅材料安全数据表（MSDS）以获取安全操作建议。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用肌动蛋白检测潜在的MHCIIx
	<ol>
		<li>再次剥离膜（步骤 4.2.1 和 4.2.2）。</li>
		<li>重复步骤4.1，此次使用以BSA缓冲液按1:500稀释的肌动蛋白一抗，随后使用以封闭缓冲液按1:20,000稀释的兔源HRP二抗。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 纤维类型鉴定
<ol>
	<li>MHCI、MHCIIa 和肌动蛋白信号分析
	<ol>
		<li>熟悉信号强度图示面板（图 4A），并记录步骤 5.1.2 至 5.1.4 的内容。</li>
		<li>信号强度饱和表示蛋白检测信号强。</li>
		<li>中等信号表示目标蛋白含量处于中等水平。</li>
		<li>微弱信号表示目标蛋白含量极少。</li>
		<li>使用信号强度图示面板将纤维分类为具有“饱和”、“中等”或“微弱”信号强度的类别（图 4A）。</li>
		<li>通过首先比较 MHCIIa 与 MHCI 的结果进行纤维类型鉴定（图 4B，左侧和中间印迹）。</li>
		<li>记录仅有一种 MHC 同工型呈现饱和或中等信号强度的纤维。</li>
		<li>若 MHC 同工型信号为“微弱”，则不标记该纤维（见 图 4B）。</li>
		<li>最后，对于未检测到 MHCI 或 MHCIIa 但观察到肌动蛋白（中等或饱和信号强度）的纤维，将其记录为潜在的 IIx 型纤维（图 4B，右侧印迹）。</li>
		<li>若纤维中 MHC 同工型信号微弱但检测到肌动蛋白（中等或饱和强度），则记录为未识别类型。</li>
		<li>若三种目标蛋白均检测到微弱信号或无信号（未收集到纤维），则弃用该样本（图 4C）。</li>
		<li>记录同时检测到 MHCI 和 MHCII 信号且信号强度为“饱和”或中等的纤维。此类样本不可用于纤维类型特异性制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纤维类型特异性样本的制备
	<ol>
		<li>为每份活检样本分别制备 I 型和 II 型样本。对于 II 型样本，合并最低所需数量的 MHCIIa 检测信号为饱和或中等水平的纤维（数量依据步骤 2.1.5 的计算结果）。</li>
		<li>在另一管标记为 I 型的离心管中，对检测到 MHCI 的纤维重复上述过程（图 4D）。</li>
		<li>若饱和信号的纤维数量不足，可使用具有中等信号强度的纤维。</li>
		<li>合并所有潜在的 IIx 型纤维。</li>
		<li>立即用于 Western 印迹分析，或在 -80 °C 下保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹法验证肌纤维类型
<ol>
	<li>每种肌纤维类型特异性样本使用 10 µL（最低样本体积要求，参见步骤 2.1.5）。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用指定的预制胶通过 SDS-PAGE 分离样本。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用凝胶成像系统检测凝胶中的蛋白质。</li>
	<li>将凝胶放入冷的 1× 转膜缓冲液中，孵育 10 分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，将蛋白质湿转至一张 0.45 µm 的硝酸纤维素膜（9.5 cm × 13.5 cm）上。</li>
	<li>转膜后，将膜置于容器中用超纯 H2O 短暂漂洗，随后倒出超纯水。</li>
	<li>向膜中加入 10 mL 抗体信号增强液，在室温下摇动孵育 10 分钟。</li>
	<li>回收抗体信号增强液，并用超纯 H2O 漂洗 5 次（每次 5 秒）。 
	注：抗体信号增强液可在丢弃前重复使用 5 次。</li>
	<li>倒出最后一次漂洗液，加入封闭液，在室温下摇动孵育 1 小时。</li>
	<li>使用干净的手术刀片或剪刀，在分子量确保 180 kDa 及以上蛋白质位于膜的上部区域的位置，水平切割膜。</li>
	<li>使用该上部区域进行进一步的肌纤维类型确认。</li>
	<li>使用 180 kDa 以下的部分检测不同的目标蛋白。</li>
	<li>在膜的上部区域，按照第 4.1 节操作，使用 MHCIIx 一抗和鼠源免疫球蛋白 M（IgM）HRP 标记的二抗。</li>
	<li>在更换为 MHCIIa IgG 一抗和鼠源 IgG HRP 二抗重复实验前，先按第 4.2.1 和 4.2.2 节所述方法剥离膜。</li>
	<li>再次剥离后，最后应用 MHCI IgM 一抗和鼠源 IgM HRP 二抗。 
	注：此步骤为定性分析，因此因膜剥离导致的任何蛋白损失无需担忧。</li>
	<li>比较不同 MHC 同工型间检测到的信号（如 图 5B 所示）。当在预期样本中（MHCI — I 型，MHCIIa — II 型，MHCIIx — IIx 型）检测到中等至饱和水平的信号强度时，该肌纤维类型特异性样本将被记录为可靠，可用于后续研究。</li>
	<li>若在同一样本中检测到多个 MHC 同工型信号强度相当，则记录该样本为不可靠。 
	注意：抗体增强液含有 50% 氢氧化钠。请参阅材料安全数据表（MSDS）以获取安全操作建议。</li>
</ol>

MyDoBID- A Novel Technique for Identifying Muscle Fiber Types Efficiently

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<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

纤维收集 
根据多年经验，大多数研究人员能够掌握该技术；然而，通过练习可提高纤维收集的速度和效率，从而更好地进行后续分析。为了能够分离出质量合格、可用于混合分析的30根单根纤维片段，建议每个样本收集50根纤维片段。建议仔细观看纤维收集操作视频，并完成两次练习（每次约50根纤维），以达到合理的操作水平。所有收集的纤维均需进行MyDoBID检测以鉴定纤维类型，从而评估该技术的操作效果。成功的操作表现为纤维样本中检测到的“无纤维”或“信号微弱”的MHC信号数量较少（见方案第5.1节）。
已知肌肉中可能存在混合型肌纤维，即同时含有 MHCI 和 MHCIIa 的纤维，或同时含有 MHCIIa 和 IIx2,14的纤维。MyDoBID 的一个局限性在于无法确定混合型纤维的存在，因为对 MHCI 和 MHCIIa 抗体均呈阳性的样本可能是单根混合型纤维，也可能是采集到了两根独立的纤维。此外，MyDoBID 无法将 MHCIIa 纤维与...

骨骼肌是一种异质性组织，其细胞的代谢和收缩特性各不相同，这取决于肌细胞（肌纤维）属于慢缩型（I型）还是快缩型（II型）。通过检测肌球蛋白重链（MHC）同工型可以确定纤维类型，这些同工型在收缩时间、缩短速度和抗疲劳能力等方面存在差异1。主要的MHC同工型包括I型、IIa型、IIb型和IIx型，其代谢特征分别为氧化型（I型和IIa型）或糖酵解型（IIx型、IIb型）1。这些纤维类型的比例因肌肉种类和物种而异。IIb型在啮齿类动物肌肉中广泛存在。人类肌肉中不存在IIb型纤维，主要由MHC I型和IIa型纤维组成，并含有少量IIx型纤维2。不同纤维类型的蛋白质表达谱存在差异，并可随年龄3、运动4,5和疾病6发生改变。
在不同骨骼肌纤维类型中测量细胞反应常常被忽视或难以实现，原因在于通常采用肌肉匀浆（包含所有纤维类型的混合物）进行检测。单根肌纤维 Western blot 技术可对单个肌纤维中的多种蛋白质进行分析7。该方法此前已被用于获得利用匀浆制备样本无法获取的新型且具有信息价值的单纤维特征。然而，原始的单纤维 Western blot 方法存在一些局限性，包括耗时较长、无法生成样本重复以及需使用昂贵且敏感的增强化学发光（ECL）试剂。若使用新鲜组织，该方法的限制更为明显，因其需在有限时间内（即1-2小时内）完成单根纤维的分离，存在时间上的约束。幸运的是，通过从冻干组织中分离单纤维片段可缓解这一限制8。然而，从冻干样本中收集纤维的能力受限于活检组织的大小和质量。
本综合方案对使用点印迹法进行纤维类型鉴定的方法9进行了显著的细化和扩展。先前的研究已证明，仅需约2–10 mg湿重的肌肉组织即可满足冻干及单根肌纤维MHC同工型蛋白分析的要求9。Christensen等9使用约1 mm长肌纤维片段的30%进行点印迹检测以鉴定存在的MHC同工型，并通过蛋白质印迹法验证了结果。该研究显示，以点印迹替代蛋白质印迹可使整体成本降低约40倍（针对50个纤维片段）。随后，肌纤维被&#34;归类汇总&#34;为I型和II型样本，从而实现实验重复9。然而，该方法存在局限性：仅能获得两种纤维类型特异性样本，即I型（MHCI阳性）和II型（MHCII阳性纤维），其中II型样本包含MHCIIa与MHCIIx的混合物6,10。值得注意的是，当前方案展示了如何鉴定纯IIx型纤维，并提供了极为详细的实验流程（见图1总结），包括针对常见实验问题的故障排除策略。

<table><tbody><tr><td>1× 变性缓冲液</td><td>按配方制作</td><td>成分可从 Sigma-Aldrich 或其他化学试剂供应商处获取</td><td>&amp;nbsp;1×变性缓冲液通过将3×变性缓冲液1与1×Tris-HCl（pH 6.8）按体积比1:3稀释制得。置于-20℃保存。 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>3x 变性缓冲液</td><td>按配方制备</td><td>成分可从 Sigma-Aldrich 或其他化学试剂供应商处获取</td><td>3×变性缓冲液包含：0.125 M Tris-HCl、10% 甘油、4% SDS、4 M 尿素、10% 2-巯基乙醇和 0.001% 溴酚蓝，pH 6.8。&amp;nbsp; -20℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>N/A</td><td>100% 乙醇可从任意公司采购</td><td>用超纯水稀释至95%&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>兔抗肌动蛋白多克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; A2066</td><td>用 BSA 缓冲液按 1:1,000 比例稀释。</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>型号：MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>抗体增强剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32110</td><td>产品名称为 Miser Antibody Extender Solution NC。</td></tr><tr><td>烧杯（100 mL）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>型号名称：Mini Spin</td></tr><tr><td>封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉的洗涤缓冲液。</td><td>文凭</td><td>市售</td><td></td></tr><tr><td>BSA缓冲液：1 % BSA/PBST，0.02 % NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>BSA：Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; PBS：Bio-Rad Laboratories。NaN&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10x PBS：1610780&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;S2002</td><td>牛血清白蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲液（PBS）和叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>盒带开启杆&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>4560000</td><td>用于打开预制胶盒。</td></tr><tr><td>Chemidoc MP 成像系统&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>型号：Universal hood III</td><td>任何具备免染凝胶成像功能的成像系统。</td></tr><tr><td>标准滤纸</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1704070</td><td>包含冰袋、转移托盘、滚轴、2 个胶片夹、滤纸、泡沫垫以及带线缆的盖子。</td></tr><tr><td>Criterion 细胞（Bio-Rad）</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL（增强型化学发光）</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1705062</td><td>产品名称：Clarity Max Western ECL 底物</td></tr><tr><td>电泳缓冲液 1x Tris 甘氨酸 SDS（TGS）</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610772</td><td>将10倍浓度的TGS 1用超纯水按1:10比例稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>滤纸，0.34 毫米厚</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>3毫米厚，每包100张，315 × 335毫米</td></tr><tr><td>精细组织解剖镊</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>珠宝匠&amp;rsquo;5号镊子</td></tr><tr><td>扁平塑料托盘/盖&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>足够大以放置膜，确保表面完全平整。</td></tr><tr><td>冷冻干燥系统</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4.5 L 带玻璃腔室样品台</td></tr><tr><td>-80℃冰箱 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何能保持 -80 恒定温度的超低温冰箱 &amp;deg;C 是合适的。</td></tr><tr><td>凝胶释放器</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>在膜下移动以收集或转移膜。</td></tr><tr><td>灰色铅笔</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Image Lab 软件&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>N/A</td><td>图示基于软件版本 5.2.1，但也可使用其他版本。</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1660521</td><td>任何可调节至37的培养箱 &amp;deg;C 即可满足要求。</td></tr><tr><td>灯</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带搅拌子的磁力搅拌器</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>膜滚轮&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1651279</td><td>可购买转移试剂盒组合装。然而，若该产品不可得，任何表面光滑、长度足以滚过膜的圆柱形管均可替代使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管&amp;nbsp; (0.6 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG HRP 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31430</td><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L），RRID AB_228341。用封闭缓冲液按 1:20,000 稀释。</td></tr><tr><td>小鼠 IgM HRP 二抗</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>山羊抗小鼠 IgM μ链。使用浓度与小鼠 IgG 相同。</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链 I（MHCI）一抗</td><td>DSHB</td><td>A4.840&amp;nbsp;</td><td>稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链IIa（MHCIIa）一抗</td><td>DSHB</td><td>A4.74&amp;nbsp;</td><td>稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链IIx（MHCIIx）一抗</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>稀释范围：在BSA缓冲液中1:200至1:500。</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜 0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1620115</td><td>用于蛋白质印迹分析。</td></tr><tr><td>培养皿盖</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>动力包&amp;nbsp;</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>164-5050</td><td>产品名称：基础电源供应器</td></tr><tr><td>蛋白ladder</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26616</td><td>PageRuler 预染蛋白质标准品，10 至 180 kDa</td></tr><tr><td>PVDF 膜 0.2 &amp;micro;m</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>兔源 HRP 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31460</td><td>山羊抗兔IgG（H+L），RRID AB_228341。稀释比例与小鼠二抗相同。</td></tr><tr><td>摇床</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>尺子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>stripping 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21059</td><td>产品名称：Restore Western Blot 剥离缓冲液</td></tr><tr><td>无绒布（无尘布）</td><td>Kimberly-Clark 专业</td><td>34120</td><td>产品名称：Kimwipe</td></tr><tr><td>转移缓冲液（1× Tris 甘氨酸缓冲液（TG），20% 甲醇）</td><td>TG：Bio-Rad Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp; 甲醇：Merck</td><td>TG缓冲液：1610771&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 甲醇：1.06018</td><td>将10倍浓度的TG缓冲液用超纯水稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至1×。加入100%甲醇至终浓度为20%甲醇。4℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>转移托盘</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;紫外活化预制凝胶</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>5678085</td><td>凝胶类型：4&amp;ndash;15% Criterion TGX 免染蛋白凝胶，26 孔，15 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液（1x TBST）</td><td>10x TBS：Astral Scientific&amp;nbsp; Tween 20：Sigma</td><td>&amp;nbsp;BIOA0027-4L</td><td>1x TBST 配方：将 10x Tris 缓冲盐水（TBS）用超纯水稀释至 1x&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，加入Tween 20至终浓度0.1%。将缓冲液于4℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>清洗容器</td><td>系统</td><td>市售</td><td>任何适合膜的大致尺寸的保鲜盒均可使用。</td></tr></tbody></table>

人类骨骼肌纤维类型鉴定

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

本文所述技术可用于通过点印迹法鉴定单个肌纤维片段中的特异性肌球蛋白重链（MHC）同工型，下文简称肌球蛋白重链点印迹检测以鉴定肌纤维类型（MyDoBID）。本方案描述了人骨骼肌组织的冷冻干燥及单根肌纤维片段分离的过程。利用MyDoBID技术，分别使用针对MHCI和IIa的特异性抗体对I型和II型肌纤维进行分类。随后，将已分类的肌纤维按每份活检样本汇总为特定肌纤维类型的样品。
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和紫外光激活凝胶技术测定各样本中的总蛋白含量。使用蛋白质印迹法（western blotting）验证样本的肌纤维类型。本文还阐述了进行蛋白上样量归一化的重要性，以增强在多个蛋白质印迹实验中对目标蛋白的检测效果。相较于单根肌纤维的蛋白质印迹分析，将分类后的肌纤维整合为特定纤维类型的样本具有多项优势，包括样本适用性更广、样本通量更高、所需时间更短以及成本更低，同时仍能保留使用匀浆化肌肉样本时常被忽略的有价值的纤维类型特异性信息。本实验方案的目的是实现对冻干人骨骼肌样本中分离出的I型和II型肌纤维进行准确且高效的鉴定。
随后将这些单根肌纤维进行组合，以制备I型和II型肌纤维特异性样本。此外，本方案进一步扩展，通过使用肌动蛋白（Actin）作为标志物来鉴定IIx型肌纤维：对MHCI和MHCIIa呈阴性反应的纤维，经蛋白质印迹法（western blotting）确认为IIx型纤维。每种肌纤维特异性样本随后均用于通过蛋白质印迹技术定量分析多种目标蛋白的表达水平。

使用点印迹法鉴定单个 MHCI、MHCIIa 和 MHCIIx 肌纤维 
MyDoBID 的一个特点是可对特定肌纤维中 MHCI、MHCII 和肌动蛋白（Actin）信号强度的差异进行分类（图 4A）。肌纤维类型的鉴定依据是 MHCI 和 MHCIIa 同工型的有无（图 4B）。有 6 根纤维未检测到 MHC 或肌动蛋白信号，表明未成功采集到肌纤维。该次点印迹实验的结果为：鉴定出 22 根 II 型纤维、7 根 I 型纤维和 3 根潜在的 IIx 型纤维；另有 2 个样本未能识别，6 个样本被归类为“无纤维”采集（图 4B，C）。对于未检测到 MHCI 或 MHCIIa 信号但肌动蛋白呈阳性的纤维，通过排除法将其鉴定为潜在的 IIx 型纤维。根据信号强度图谱对 MHCI 和 MHCIIa 的信号强度进行分类时，将“中等”或“饱和”强度的纤维分别合并为 I 型或 II 型样本。未识别出的纤...

本方案展示了如何从冻干的人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并利用点印迹技术根据肌球蛋白重链（MHC）同工型进行纤维类型分类。鉴定出的MHC I型和II型肌纤维样本可进一步通过蛋白质印迹法分析其纤维类型特异性的蛋白质表达差异。

此处所述技术可用于通过点印迹法鉴定单根肌纤维片段中的特异性肌球蛋白重链（MHC）同工型。

我们的研究聚焦于骨骼肌，骨骼肌由具有独特代谢和收缩特性的细胞组成，这些细胞被划分为慢缩纤维和快缩纤维。我们深入探究导致这些差异的因素，并探讨其在衰老、运动以及多种疾病背景下的意义。由于通常仅对同质化的肌肉组织进行检测，不同骨骼肌纤维中细胞反应的测量往往被忽视或难以实现。MyDoBID 技术使我们能够反复分析以往无法测量的肌纤维类型蛋白差异。本方案可准确、高效地从冻干的人体骨骼肌样本中鉴定出 I 型和 II 型肌纤维。这一经过修订的新方法为研究人员在细胞水平上探究骨骼肌中蛋白质差异提供了简便的途径。值得注意的是，该技术有助于识别 IIx 型肌纤维，而这类肌纤维在历史上一直难以区分。该方法使研究人员能够揭示所有类型的肌纤维，包括难以检测的 IIx 型肌纤维。借助 MyDoBID 技术，许多问题如今得以解答。例如，可以研究IIx型肌纤维的特性，并确定是否存在证据表明在衰老或疾病过程中IIx型肌纤维出现选择性萎缩。还可以观察特定的运动干预对每种肌纤维类型的影响。开始时，将冻干的肌肉样本置于体视显微镜下，并在低倍镜下进行观察。用一把精细的组织解剖镊子固定肌肉，用另一把镊子分离出细小的纤维束。分离出一束纤维后，轻轻将其撕开，直至从该束中分离出单根纤维片段。然后将纤维转移至培养皿的干净区域。在50倍放大倍数下检查每一段单根纤维。尝试在一端进一步分离该纤维。如果纤维开始断裂，则说明这是一根单纤维。用镊子小心收集纤维，并将其放入先前准备好的变性缓冲液分装液中。将离心管用力在实验台上敲击三次。随后涡旋振荡纤维样品，并在2,500 × g条件下短暂离心5秒，以确保样品沉至管底。将样品在室温下静置1小时，然后于-80摄氏度保存，以备后续使用。首先，准备四张尺寸均为 12.5 厘米 × 7.5 厘米的滤纸。将其中两张叠放在一起，放入转移缓冲液中浸泡透彻。将 PVDF 膜置于 95% 乙醇中，并在摇床上振荡处理 1 分钟。回收乙醇，将膜浸入转移缓冲液中，振荡两分钟。接着，将浸湿的滤纸叠放在平坦的可移动表面（如一个较大的盖子）上，并用滚筒将其压平。使用凝胶释放器或镊子，小心地将PVDF膜放置在滤纸叠上。随后，将一张干燥的滤纸放在该膜上，用滚轮在滤纸上滚动，以吸收膜表面多余的缓冲液。取下顶部滤纸时避免摩擦膜表面。从冷冻保存中取出分离的纤维样品，在室温下解冻，然后离心并充分悬浮样品。将每份样品各取一微升（1 µL）滴加到指定膜区域的中央。避免移液器吸头接触膜表面。让样品液滴完全被膜吸收，静置15分钟。然后使用凝胶释放器或镊子，小心地将膜从湿润的滤纸叠上揭下。将其放置在一张干燥的滤纸上，静置至少五分钟以脱水。待样品点完全变为白色后，重新激活膜。然后进行目标蛋白的免疫标记。学习如何利用信号面板强度对点印迹图像中MHC同工型和肌动蛋白信号的强度进行分类。强、中等和弱的目标蛋白检测分别由饱和、中等和

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

人体骨骼肌的纤维类型鉴定

在本视频中，我们演示了人类骨骼肌组织样本的制备及其透射电子显微镜染色方法，以观察和定量亚细胞水平的糖原分布。...

透射电子显微镜定量分析人体骨骼肌中糖原分布

本文介绍了一种快速肌纤维分析方案，该方法可提高染色质量，从而利用免费软件 ImageJ...

一种利用肌球蛋白重链免疫组织化学对大鼠肌肉横截面肌纤维群体分析的快速自动化方案

肌球蛋白重链同工型的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维类型鉴定的先进技术即，I型、IIA型、IIX型、IIB型）。本文介绍了一种染色方案，并提供一种新型半自动算法，可促进对肌纤维类型及肌纤维形态的快速评估。...

小鼠骨骼肌形态及纤维类型组成的半自动分析

本技术报告描述了一种改良的 Bergström...

从人体胫骨前肌上部隔室采集骨骼肌活检样本以进行力学评估

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy...

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本方案描述了从小鼠氧化型腓肠肌中分离完整单根肌纤维并建立高纯度肌母细胞培养物的方法。优化后的操作可稳定地从每只小鼠获得约300–500根完整的肌纤维，适用于后续的分子与细胞分析。...

单纤维分离检测法用于评估氧化型肌纤维行为

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

我们提出一种无需纯化即可鉴定脂肪酸的方案。该方法结合了三类脂肪酸衍生物的保留时间信息及其质谱数据，这三类衍生物分别为：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）和3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。...

Bacillus cereus 中脂肪酸的鉴定

学习使用MyDoBID技术从冻干人体骨骼肌中分离单根肌纤维，并根据肌球蛋白重链亚型进行分类鉴定。该方法可分析I型和II型肌纤维的蛋白质表达差异，为研究肌肉生物学、衰老和运动生理学提供可靠的细胞水平分析手段。

人类骨骼肌纤维类型鉴定

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