Name: 分裂视网膜作为研究脊椎动物视网膜内核层神经元的改进平装制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学习分裂视网膜平装制备技术，通过移除感光细胞显著改善抗体扩散效率，实现对小鼠内核层神经元的高效免疫标记和电生理研究。该方法使抗体渗透速度提升20倍以上。

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本研究工作得到了以下美国国立卫生研究院（NIH）基金的支持：NIH基金R01EY031596（资助C.M.）；NIH基金R01EY029985（资助C.M.）；NIH基金P30EY010572（资助C.M.）；NIH基金R01EY032564（资助B.S.）。我们感谢Tammie Haley在制备视网膜切片过程中提供的技术支持，同时感谢Charles Allen博士慷慨提供本研究中使用的mRNA FISH探针。

小鼠可自由获取水和食物，并维持在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中。小鼠通过暴露于异氟烷后进行颈椎脱位法实施安乐死。所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则，并经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会批准。
注意：为了保持活体组织的健康状态，眼球摘除、视网膜分离和视网膜切分应尽快完成。目标是在 &lt; 每只眼睛4分钟。这三个步骤需依次进行。野生型小鼠：成年（&gt;3个月大雄性和雌性C57BL/6J小鼠用于实验。对于突触形态学研究，使用在Pcp2启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠（Pcp2-cre/GFP）14 使用了转基因小鼠：在免疫组织化学或电生理实验中，为实现水平细胞的GFP可视化，采用了一种三重转基因小鼠：vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d。vGATFlpo和vGluT2Cre品系为基因敲入小鼠，分别在其各自启动子下游表达Flpo或Cre重组酶。Ai80d小鼠是一种交叉型报告基因小鼠（CatCh/EYFP），仅在特定条件下表达Ca2+ 可渗透通道视紫红质（ChR2）在表达Cre和Flpo重组酶的细胞中表达。因此，这种三重转基因小鼠仅在既往表达过VGAT和vGluT2的细胞中表达ChR2。
1. 视网膜分离与视网膜切分的材料准备
<ol>
	<li>准备硝酸纤维素膜的小片 
	注意：将分离的视网膜从硝酸纤维素膜上取下可降低显微镜观察时的背景荧光，并简化膜片钳记录。膜的移除可在组织固定前或固定后进行。对于已固定的分离视网膜，无需对硝酸纤维素膜小片进行处理。对于活体分离视网膜，则需按照步骤 1.1.3 - 1.1.5 对膜进行处理，以便轻柔地从组织上分离。
	<ol>
		<li>将16片（或更多）硝酸纤维素膜裁剪成5 mm × 5 mm的正方形。可批量制备额外小片以供后续使用。</li>
		<li>将一半的膜小片留出备用。这些膜小片将不使用封闭液处理。</li>
		<li>将剩余的膜小片在无去污剂的免疫组化封闭液（例如含3%马血清和0.025% NaN3的PBS溶液）中室温孵育10分钟，轻轻振荡。 
		注意：NaN3为强毒性物质，操作时应穿戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>将膜小片在碳酸氢盐缓冲的Ames培养基中室温孵育10分钟，轻轻振荡，充分洗涤。</li>
		<li>将经过封闭处理的膜小片完全空气干燥（约20分钟）。标记并室温保存，注意与未处理的膜小片分开存放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制Ames培养基
	<ol>
		<li>配制碳酸氢盐缓冲的Ames培养基，并在持续通入碳氧混合气体（95% O2 和 5% CO2）的条件下保持溶液处于室温。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠眼球摘除
<ol>
	<li>根据机构 IACUC 指南，采用任何可用方法处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠翻转至一侧，用两根手指轻轻按压眼眶周围，使眼球从颅骨中突出。</li>
	<li>使用弯头解剖剪，在突出的眼球下方剪断视神经，将眼球与颅骨分离。</li>
	<li>用剪刀托起眼球，放入盛有冰冻 Ames 培养基的培养皿中。 
	注意：若后续应用中组织在分离后需固定，可使用冰冻 PBS 代替 Ames 培养基。</li>
	<li>对另一只眼球重复步骤 2.1 至 2.4。</li>
</ol>
3. 视网膜解剖
<ol>
	<li>使用定制的玻璃转移移液管，将一只眼球转移至一个新的培养皿中，该培养皿内含有新鲜且冰冻的Ames培养基。 
	注意：定制转移移液管的宽口设计可防止组织被意外压碎，而使用玻璃材质可最大限度减少组织与移液管壁之间的黏附。然而，如果实验人员已熟练掌握该操作，也可使用宽口塑料转移移液管。</li>
	<li>使用镊子通过固定眼球周围的结缔组织，将其稳定在培养皿底部。随后，使用25G针头沿锯齿缘（ora serrata）线穿刺，以形成Vannas剪刀进入的开口。</li>
	<li>使用Vannas剪刀沿锯齿缘线剪开，直至角膜与眼球其余部分分离（补充图1A）。用镊子将晶状体从眼杯中取出（补充图1B）。</li>
	<li>使用定制玻璃移液管将眼杯转移至大量（≥100 mL）碳氧饱和Ames培养基中，并对另一只眼球重复步骤3.1–3.3。 
	注意：将眼杯置于碳氧饱和Ames培养基中，可在对另一只眼球进行解剖时维持组织活性。</li>
	<li>将一个眼杯转移至盛有新鲜碳氧饱和Ames培养基的培养皿中。</li>
	<li>使用Vannas剪刀从巩膜边缘向内剪一小口，然后使用两把镊子将巩膜从视网膜上剥离（补充图1C）。避免用镊子夹住视网膜，而应通过剪刀剪开形成的小瓣拉动巩膜使其分离。</li>
	<li>使用Vannas剪刀剪断连接巩膜与视网膜的视神经（补充图1D），然后使用剪刀或镊子轻轻撬动，将视网膜从巩膜上分离，从而获得游离的视网膜（图1A）。 
	注意：通常情况下，视网膜色素上皮（RPE）会保留在眼杯上；若RPE附着于视网膜上，也无需额外步骤去除。此时，可根据需要使用手术刀修剪视网膜边缘，以防止在后续展平步骤中发生卷曲（图1B）。</li>
	<li>使用手术刀将视网膜切成两半或四等份（图1C），然后使用定制转移移液管将组织块重新转移至大量（≥100 mL）持续碳氧饱和的Ames培养基中。 
	注意：切成两半或四等份可根据实验需求自行选择，应根据具体应用选择最合适的分割方式。</li>
	<li>在进行视网膜分割前，对另一只眼球重复步骤3.5–3.8。</li>
</ol>
4. 视网膜分离
<ol>
	<li>弃去培养皿中的 Ames 培养基，更换为新鲜的充碳氧气体（carbogenated）Ames 培养基。 
	注意：为在整个视网膜分离过程中维持碳氧气体饱和状态，需每隔约 5 分钟将培养皿中的培养基更换为新鲜的充碳氧气体 Ames 培养基。</li>
	<li>使用定制的转移移液管，将一片视网膜放置于载玻片（7.5 cm × 5 cm）上，节细胞层朝上，然后用精细擦拭纸吸除周围液体以展平视网膜（图 1D）。如有必要，在解剖显微镜下用细头画笔轻轻牵拉视网膜边缘。</li>
	<li>用镊子将一片干燥的 5 mm × 5 mm 硝酸纤维素膜轻轻压在视网膜上，使其黏附于节细胞层一侧（图 1E）。 
	注意：若需从活体组织上移除膜（例如用于电生理实验），则此步骤应使用经血清处理的干燥膜（详见步骤 1.1.3–1.1.5）。这可降低膜与节细胞层之间的黏附强度，便于在分离后将视网膜从硝酸纤维素膜上取下。</li>
	<li>将视网膜翻转，使硝酸纤维素膜贴附于载玻片上，并在视网膜的感光细胞侧放置另一片干燥的 5 mm × 5 mm 硝酸纤维素膜（图 1F）。</li>
	<li>将湿润的画笔尖接触两层膜之间的缝隙，利用毛细作用使 Ames 培养基渗入膜夹层结构中（图 1G）。该操作可降低膜与视网膜之间的黏附力，仅当视网膜因使用精细擦拭纸过度干燥时才需进行此步骤。 
	注意：若视网膜失去光泽，表明其已过度干燥，此时必须执行步骤 4.5。</li>
	<li>为确保膜均匀黏附，用湿润的画笔对上层膜施加轻微的向下压力（图 1H）。</li>
	<li>用一对镊子固定下层膜于载玻片上，同时用另一对镊子以缓慢、稳定的动作轻轻剥离上层膜。此操作将导致视网膜在外界膜（OPL）上方发生分离（图 1I）。</li>
	<li>弃去含有感光细胞的上层膜（图 1J，左）。下层膜则包含内层视网膜，此后称为“分离视网膜”（图 1J，右）。</li>
	<li>立即将分离后的视网膜放回充碳氧气体的 Ames 培养基中。 
	注意：对于活体组织实验，视网膜在分离后可在充碳氧气体的 Ames 培养基中恢复 15–30 分钟，以利于实验效果。</li>
</ol>
<img alt="组织包埋过程；显示包埋步骤的实验，包含显微切片和工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig01.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 1"> 
图 1：视网膜分离操作流程。（A）在冷PBS或Ames培养基中完成眼球摘除并制备眼杯后，将小鼠视网膜从眼杯中分离，并将PBS替换为室温下经碳氧混合气饱和的Ames培养基。（B）使用手术刀修剪视网膜边缘，直至无向内卷曲的区域（可选步骤）。（C）使用手术刀将视网膜切成四等份或两半。（D）使用定制的转移移液器将一块视网膜放置于载玻片上（节细胞层朝上），并用精细擦拭纸彻底去除多余的Ames培养基。确保半干燥的视网膜在进入下一步前平整地贴附于载玻片表面。使用蘸有Ames培养基的画笔尖端轻轻展开未展平的视网膜区域。（E）用镊子将一块预先裁切好的干燥硝酸纤维素膜（5 mm × 5 mm）放置在展平的视网膜上。（F）翻转硝酸纤维素膜，使视网膜的光感受器层朝上，然后在视网膜上方再放置另一块干燥的膜。（G）将湿润的画笔尖端接触两层膜之间的空隙，利用毛细作用将Ames培养基吸入夹层中。此步骤可降低膜与视网膜之间的黏附性，仅在使用精细擦拭纸过度干燥视网膜时才需要进行。（H）使用湿润的画笔尖端轻轻向下按压夹层中心的视网膜。（I）用一对镊子将底层膜固定在载玻片上，同时用另一对镊子轻轻将顶层膜从底层膜上剥离。（J）内层视网膜（左）保留在底层膜上，而光感受器层（右）则随顶层膜被剥离下来。图中（A）、（B）、（C）、（D）和（J）使用解剖显微镜拍摄；比例尺约为1 mm；（E–I）使用智能手机摄像头拍摄，无放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
5. 免疫荧光实验用分离视网膜的制备
注意：分离的视网膜在步骤5.5之前仍将附着在硝酸纤维素膜上。请完整执行步骤5.1、5.2、5.3或5.4中的任意一个，而非全部四个步骤，因为这些步骤适用于不同的实验。
注意：操作多聚甲醛（固定剂）时，请使用适当的个人防护装备并小心操作。
<ol>
	<li>平铺免疫荧光制备
	<ol>
		<li>将分离的视网膜置于冰上，用足量的4%多聚甲醛溶液完全覆盖，孵育30分钟。</li>
		<li>将分离的视网膜用5–10 mL室温PBS洗涤3次。可选暂停步骤：分离的视网膜可在4 °C的PBS中保存最多24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色用视网膜分离后垂直切片的制备
	<ol>
		<li>将分离的视网膜置于冰上，用足量的4%多聚甲醛溶液完全覆盖，孵育30分钟。</li>
		<li>用5–10 mL室温PBS洗涤分离的视网膜3次。可选暂停步骤：分离的视网膜可在4 °C的PBS中保存最多24小时。</li>
		<li>将视网膜（膜仍附着）依次浸入4 °C的10%、20%和30%蔗糖溶液中，每种浓度各1小时，以对组织进行冷冻保护。</li>
		<li>将经冷冻保护的分离视网膜包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，于 -80 °C 保存（最长6个月），直至进行冷冻切片。</li>
		<li>从-80 °C取出包埋的分半视网膜，使用冷冻切片机切割成20 µm厚的切片。将切片贴附于静电充电的玻璃载玻片上，室温晾干，随后于-20 °C保存，可保存长达6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双荧光准备 原位 杂交与免疫组织化学
	<ol>
		<li>将分离的视网膜置于冰上，用足量的4%多聚甲醛溶液完全覆盖，孵育2小时。</li>
		<li>用5–10 mL室温PBS洗涤分离的视网膜3次。可选暂停步骤：分离的视网膜可在4 °C的PBS中保存最多24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电生理实验的准备工作
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪将带纤维的厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成记录电极。仅使用实测电阻在6-10 MΩ之间的电极。</li>
		<li>用内液（单位：mM，含 125 K-葡萄糖酸盐、8 KCl、5 HEPES、1 MgCl₂）回填已拉制的移液管2，1 CaCl2，0.2 EGTA、3 ATP-Mg 和 0.5 GTP-Na。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从硝酸纤维素膜上移除分离的视网膜
	<ol>
		<li>使用疏水屏障笔在显微镜载玻片上制备圆形孔（直径约1 cm），室温下晾干5–10分钟。</li>
		<li>将分离的视网膜置于预先准备好的疏水屏障笔画出的孔内，并加入足量 PBS 以完全覆盖。</li>
		<li>在解剖显微镜下，将细毛画笔的毛尖插入组织边缘下方，轻轻向上提起。以此方式沿视网膜周围作环形操作，将其从膜上剥离。</li>
		<li>使用镊子从漂浮的视网膜组织下方移除膜。</li>
		<li>小心吸去残留的PBS，使视网膜组织片紧贴载玻片，节细胞面朝下。 
		注意：以下步骤无需按顺序执行。请根据所需应用选择适当的实验方案（即免疫染色，或双重荧光原位杂交 [FISH] 与免疫组织化学 [IHC]，或电生理学）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 免疫染色
<ol>
	<li>若尚未准备，使用疏水屏障笔在显微镜载玻片上绘制圆形孔（直径约1 cm），并使其在空气中干燥5–10分钟。所有孵育步骤和洗涤步骤均将在这些笔画出的孔内进行。</li>
	<li>将分离的视网膜或垂直切开的视网膜切片置于抗体孵育液（AIS：含3%马血清、0.5% Triton X-100、0.025% NaN3的PBS溶液）中，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>将分离的视网膜或垂直切开的视网膜切片与用AIS稀释的一抗在室温下孵育1小时。 
	注意：一抗的孵育时间需根据不同靶蛋白和抗体进行优化。</li>
	<li>用室温PBS洗涤组织3次。</li>
	<li>将组织与用AIS稀释的二抗在室温下孵育1小时。用室温PBS洗涤组织3次。</li>
	<li>如需进行细胞核染色，将组织与用PBS稀释的DAPI在室温下孵育30秒。用室温PBS洗涤组织1次。</li>
	<li>在每块组织上滴加一滴封片介质，并加盖盖玻片。</li>
	<li>在盖玻片边缘涂抹指甲油以密封样品。将载玻片置于4 °C保存。</li>
</ol>
7. 双重FISH与IHC
<ol>
	<li>将分离的视网膜置于杂交炉中，在 40 °C 下烘烤 30 分钟，以增强其与载玻片的黏附性。</li>
	<li>按照试剂盒生产商提供的说明书完成 RNAscope FISH 实验步骤，但以下情况除外并作如下修改：
	<ol>
		<li>无需进行抗原修复步骤。使用蛋白酶 III，在室温下孵育 18 分钟。</li>
		<li>所有洗涤步骤均需在由疏水屏障笔所形成的孔内载玻片上进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品与一抗（稀释比例见材料表）在 PBS 中混合，于杂交炉中 40 °C 孵育 30 分钟。随后用室温 PBS 洗涤样品 3 次。</li>
	<li>将样品与二抗（稀释比例见材料表）在 PBS 中混合，于杂交炉中 40 °C 孵育 30 分钟。随后用室温 PBS 洗涤样品 3 次。</li>
	<li>将样品在 1x DAPI 中室温孵育 30 秒。随后用室温 PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>在每块组织上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。</li>
	<li>用指甲油封固盖玻片边缘以密封样品。将载玻片于 4 °C 保存。</li>
</ol>
8. 电生理学
<ol>
	<li>取出硝酸纤维素膜后，将分离的视网膜转移至膜片钳记录室，并用铂金丝网轻轻固定。</li>
	<li>在整个实验过程中，持续用含有95% O2 和5% CO2 的碳合 Ames 溶液灌注分离的视网膜，保持溶液温度在32–34 °C之间。 
	注意：实验期间可使用 Dodt 梯度反差显微镜观察组织。</li>
	<li>在室内光照条件下，对内核层（INL）神经元进行全细胞电压钳记录。
	<ol>
		<li>记录过程中，可通过微注射装置施加药物化合物，或使用470 nm LED刺激视蛋白通道（ChR2），以模拟光反应。 
		​注意：光强可使用数字光功率计进行测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>进行共聚焦免疫荧光实验时，使用配备 40x/1.3 或 63x/1.40 油浸物镜的共聚焦显微镜采集图像。使用 FIJI 调整图像的亮度和对比度，并从图像堆栈生成 Z 投影。</li>
</ol>

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal Cells in the Murine Split Retina

<ol><li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li>
<li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cells%3A+elementary+building+blocks+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li>
<li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina%3A+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li>
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作者声明不存在竞争性财务利益。

光感受器将光子吸收转化为神经递质释放后，双极细胞（BCs）和水平细胞（HCs）是视网膜中最早处理视觉信号的神经元23。尽管这些神经元的重要性已被广泛认识，但它们的许多功能仍未被充分理解，甚至尚未被探索。许多关于BC和HC生理学的研究可能会受益于一种改进的视网膜平铺制备方法，该方法在保持横向连接的同时，提高了对内核层（INL）神经元的可及性。分离视网膜法的开发旨在提供一种简便的实验流程，以便在平铺取向的视网膜中对BCs和HCs进行高质量的电生理记录和显微成像。本文所述的视网膜分离制备方法可在每只小鼠（每个视网膜约10分钟）视网膜分离后约20分钟内完成，无需使用特殊设备。该方法借鉴了现有的光感受器去除技术，但在简便性、速度和通用性方面有显著改进4,10,11,12,13。与以往分离视网膜各层的方法不同，视网膜分离无需冷冻、冻干或反复在视网膜上使用粘合剂。经过练习后，几乎可利用硝酸纤维素膜一次性撕除全部光感受器。该方法的快速与简便性使得视网膜脱离碳合空气饱和的Ames培养基的时间最短化，从而在较长时间内维持细胞的高存活率；分离后的视网膜可在碳合空气饱和的Ames培养基中维持数小时。为证明该制备方法中INL神经元的良好状态，活/死细胞染色（图4）和膜片钳电生理记录（图&#160;6）均证实了视网膜双极细胞（RBCs）和水平细胞（HCs）在分离后的存活能力。
在分离的视网膜中去除感光细胞层，可在免疫标记过程中显著缩短抗体向内核层（INL）的扩散时间，从而带来显著优势。一抗和二抗标记可在2小时内完成，相比传统的平铺染色方法（通常需要72小时或更长时间，具体取决于靶标）5,6,7,8,20,22，是一项重大改进。因此，可在组织制备的同一天获取显微镜数据，从而极大加快免疫荧光实验的进程。为了促进mRNA探针的退火，&#160;FISH实验通常建议的固定时间（约24小时）远长于免疫标记18。然而，本文展示的实验表明，2小时的固定仍可获得极佳的FISH标记效果（图5）。尽管固定时间从30分钟延长至2小时，但仍无需进行抗原修复步骤即可获得优异的免疫标记结果，不过该结果可能因抗体或抗原的不同而有所差异。FISH实验方案中的蛋白酶处理可能干扰抗体标记，原因可能是靶表位遭到破坏。这一问题通过使用可识别多个表位的多克隆抗体得以规避，从而降低了表位破坏影响免疫标记的可能性。此外，采用中等强度的蛋白酶处理（ACD蛋白酶III），可在保证足够组织通透性的同时，避免表位过度改变。
有时，视网膜会沿外核层（ONL）发生分离，导致光感受器胞体层残留，而内核层（INL）细胞则不可见。为避免此情况，应确保视网膜完全平展地贴附在玻片表面，并清除视网膜周围残留的液体。用画笔更用力地按压硝酸纤维素膜也可能有助于防止在ONL处发生分离。如果膜过于湿润或视网膜发生折叠，则成功分离的概率将显著降低。使用DAPI对细胞核进行染色有助于评估分离质量，并确定残留光感受器的覆盖范围。光感受器细胞核较小、荧光较亮且位置更表浅（补充&#160;图3A），而双极细胞（BC）核较大、荧光较暗且位置更深（补充图3B）。在某些情况下，撕裂平面在视网膜不同区域可能略有变化，导致部分区域的光感受器胞体未被完全去除（补充图3C）。对于显微成像和电生理学应用而言，只要光感受器被充分去除的区域仍可正常采集高质量数据；在成像或使用膜片钳记录时，很容易找到大片暴露的内层视网膜区域。若需要更彻底地去除光感受器，可使用另一片硝酸纤维素膜进行第二次撕裂，但无法保证实现100%的光感受器去除。因此，在进行基因表达或蛋白质组学研究时应谨慎使用此类分离视网膜，因为残留的光感受器成分可能影响实验结果。而对于单细胞层面的应用，此问题无需担忧，因可在数据分析中排除光感受器来源的数据。
分离视网膜制备方法的优势在对广域中间神经元进行电生理记录时尤为显著。传统的垂直切片会切断广域细胞广泛延伸的突起，而分离视网膜制备法能够保持外丛状层（OPL）和内丛状层（IPL）的完整性，从而可以记录到来自广域细胞的输入信号，例如水平细胞（HCs24）、A17细胞25、TH阳性无长突细胞（TH ACs26）以及NOS-1阳性无长突细胞（NOS-1 ACs27），这些信号在垂直切片中通常会被遗漏。因此，在解释实验结果以及与以往基于视网膜切片所获得的数据进行比较时，需要谨慎考虑。尽管如此，在使用药理学手段模拟光刺激的实验中，这些结果与从视网膜切片记录到的数据相似19。通过在细胞特异性启动子驱动下表达ChR2，可以在内核层（INL）中记录双极细胞（BCs）的同时，选择性地激活目标细胞群，以研究该细胞对垂直信息传递通路的影响。此外，在分离视网膜中直接记录内核层更深层的神经元（如无长突细胞）也是可行的。在这种情况下，虽然膜片钳电极必须首先穿过表层的内核层神经元，但与传统的全层铺片制备相比，其路径所遇到的组织阻碍显著减少。
除了测量广视野细胞对其他神经元的影响外，该方法还能够直接对水平细胞（HC）进行单细胞膜片钳记录，其树突在外界从层（OPL）中形成广泛的缝隙连接网络28。水平细胞向光感受器发送关键的反馈信号，从而调控视觉信息在视网膜内的垂直传递。然而，由于在垂直切片中水平细胞的树突野被截断，目前尚缺乏单细胞记录数据。本研究在三重转基因小鼠品系中获得了结构和生理均保持完整的水平细胞，并记录了由ChR2激活诱导的电流（图6 C-E）。除ChR2刺激外，分离的视网膜还可用于研究内源性水平细胞电流及缝隙连接耦合28。尽管分离视网膜为研究突触连接以及由化学物质施加或ChR2刺激引发的神经元活动提供了便捷的模型，但由于缺乏光感受器，无法直接探究自然光反应或光适应机制。
原位 近年来，视网膜成像技术取得了显著进展。然而，大多数成像研究仅局限于整体铺片视网膜样本中的神经节细胞层29作者认为，由于分离的视网膜中缺乏光感受器，该模型将成为在外界丛状层（OPL）和内核层（INL）进行活体钙成像的理想体系。除钙成像外，该模型在应用基因编码的生物传感器（如iGluSnFR）方面也具有广阔潜力。30,31iGABASnFR32，以及 pHluorin33结合分离的视网膜制备技术，这些强大的工具可能为探索双极细胞和水平细胞在视网膜光信号处理中所涉及的突触相互作用和生物物理特性提供一种高效的方法。

视网膜是位于眼球后部的一层薄神经组织，负责接收光信号并将其转化为脑部可解读的电化学信号。在视网膜后部，视杆细胞和视锥细胞受到光刺激，导致神经递质谷氨酸的紧张性释放速率降低1。双极细胞（BCs）和水平细胞（HCs）是首批感知并响应这种谷氨酸浓度变化的神经元，其胞体位于内核层（INL）最外侧区域。这些二级神经元执行视网膜中的第一阶段信号处理，塑造视觉的关键特征，如光适应、对比敏感度以及空间和颜色拮抗性2。尽管这些功能已被归因于BCs和HCs，但介导这些过程的神经环路和生化机制尚未完全阐明3。因此，开发和改进用于研究BC和HC生理功能的工具与方法至关重要。
垂直（横断面）视网膜切片已长期&#160;被证明是研究双极细胞（BCs）和水平细胞（HCs）最实用的模型；然而，在该模型下，实验者无法获取双极细胞和水平细胞生理学的某些方面。直接记录水平细胞的活动或间接测量其对双极细胞的影响，均不能反映视网膜固有的连接性，因为在切片过程中这些细胞的侧向突起已被切断。视网膜全层制备（whole mount retina preparations）通过保留这些侧向突起避免了这一问题，但周围视网膜层的存在使得对这些细胞的记录仍具挑战性4尽管免疫染色有大量实例5,6,7,8 和膜片钳记录9 从整体视网膜平铺样本中的INL神经元获取数据，有望加快并简化此类数据的采集过程。由于横切面样本存在固有局限性，且整体平铺模型面临技术挑战，因此促使了这种替代性视网膜平铺制备方法的开发。
以下研究介绍了一种简便的实验方案，可从活体平铺视网膜中去除感光细胞层，从而增强对双极细胞（BCs）和水平细胞（HCs）的可及性，便于简化膜片钳记录操作，并实现更快、更高效的免疫标记。该方法通过剥离附着在分离视网膜两侧的两片硝酸纤维素膜，使组织沿感光细胞轴突处裂开，从而获得保留外丛状层（OPL）及所有内层视网膜结构的分裂视网膜。尽管已有研究报道过机械分离视网膜各层的技术，但这些方法要么不适用于膜片钳和显微成像，要么需要对组织进行繁琐的操作。其中一些方法要求使用冷冻或冻干组织进行分层，因此无法与电生理实验兼容10,11,12。另一些方法虽适用于活体组织，但需使用滤纸进行5至15次连续剥离4,11，或通过胰蛋白酶处理去除感光细胞13。本文所述技术在前人基础上进行了改进，简化了感光细胞去除流程，并拓展了后续应用的范围。

<table><tbody><tr><td>#1.5 玻璃盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>2 把 Dumont #5 镊子</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>Becton Dickenson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED</td><td>THORLABS</td><td>M470L2</td><td></td></tr><tr><td>5-306 弯头剪刀</td><td>Miltex</td><td>5-306</td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 一次性巴斯德移液管&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td>用于构建定制转移移液管</td></tr><tr><td>Ai80d 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>25109</td><td>RRID: IMSR_JAX:025109</td></tr><tr><td>含 L-谷氨酸的 Ames 培养基</td><td>US Biological</td><td>A1372-25</td><td></td></tr><tr><td>放大器控制软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.3 软件</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白 D28K 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA-5 85669</td><td>RRID: AB_2792808，宿主物种 = 兔；稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 CtBP2 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>612044</td><td>RRID:&amp;nbsp; AB_399431，宿主物种 = 小鼠；稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>抗 GPR179 抗体</td><td>NA</td><td>NA</td><td>由 Kirill Martemyanov（佛罗里达州朱庇特市斯克里普斯研究所）赠送；宿主物种 = 绵羊；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗 PKC alpha 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4334</td><td>RRID: AB_477345，宿主物种 = 兔；稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>抗 PKC alpha 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc8393 AF594</td><td>RRID: AB_628142，宿主物种 = 小鼠；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗 PSD95 抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610495</td><td>RRID:&amp;nbsp; AB_397862，宿主物种 = 小鼠；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗 RGS11 抗体</td><td>NA</td><td>NA</td><td>由 Ted Wensel（德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院）赠送；&amp;nbsp; 宿主物种 = 兔；稀释比例介于 1:1000 至 1:5000 之间</td></tr><tr><td>抗突触素 P38 抗体</td><td>Sigma</td><td>S-S5768</td><td>RRID: AB_477523，宿主物种 = 小鼠；稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>Aquamount 封片介质</td><td>Epredia</td><td>13800</td><td>载玻片封片介质</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td></tr><tr><td>碳酰气罐（Carbogen tank）</td><td>Matheson</td><td>NA</td><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>定制转移移液管</td><td>自行构建</td><td>NA</td><td>操作说明：使用剪刀在塑料移液管开始变细的位置剪去其尖端。使用钳子安全地折断玻璃巴斯德移液管最后 2–3 英寸的部分。将玻璃巴斯德移液管的窄端插入塑料移液管的宽口端。用 Parafilm 封口膜包裹两部分的连接处以增强密封性。</td></tr><tr><td>数字式光学功率计</td><td>THORLABS</td><td>&amp;nbsp;PM100D</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>电生理放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>电生理显微镜</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS, BX50WI</td><td>Dodt 梯度反差显微技术</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 40x/1.3&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.40&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Robbins Scientific</td><td>Model 1000</td><td>仅用于 RNAscope 实验流程</td></tr><tr><td>Immedge 疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe（精细操作擦拭纸）</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 油浸物镜</td><td>Leica</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 油浸物镜</td><td>Leica</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X 共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>已停产</td><td></td></tr><tr><td>中号 15 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>25060-60</td><td>视网膜解剖过程中眼球置于其中</td></tr><tr><td>MERIT 97-275 钢制剪刀</td><td>Merit</td><td>97-275</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>p-97</td><td></td></tr><tr><td>Mm-Gabrd-C2 mRNA 探针</td><td>ACD</td><td>459481-C2</td><td></td></tr><tr><td>小鼠安乐死舱</td><td>NA</td><td>NA</td><td>自行构建；由一个玻璃培养皿覆盖一个小玻璃罐组成。</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜滤器</td><td>GE Healthcare Life Sciences; Whatman</td><td>7184-005</td><td>孔径 0.45 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve Corporation</td><td>Picospritzer II&amp;nbsp;</td><td>文中称为微细胞注射装置</td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>用于构建定制转移移液管</td></tr><tr><td>塑料管</td><td>Tygon</td><td>R-603</td><td>用于连接碳酰气罐</td></tr><tr><td>铂金网格固定器</td><td>自行构建</td><td>NA</td><td>用于在电生理记录室中固定分离的视网膜。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0 号画笔</td><td>通用</td><td>NA</td><td>用于在视网膜分离过程中展平组织。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Molecular Probes</td><td>S36937&amp;nbsp;</td><td>文中称为抗淬灭封片介质</td></tr><tr><td>小型 10 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>眼球摘除后置于其中</td></tr><tr><td>小型玻璃片（7.5 cm × 5 cm）</td><td>通用</td><td>NA</td><td>分离视网膜组织片时放置于此</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>带静电的玻璃显微载玻片</td></tr><tr><td>带细丝的厚壁硼硅酸盐玻璃移液管&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀（直头）</td><td>Titan Medical</td><td>TMS121</td><td>不指定品牌；任何性能相当的剪刀均可使用</td></tr><tr><td>vGATFLPo 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>29591</td><td>RRID: IMSR_JAX:029591</td></tr><tr><td>vGlut2Cre 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>28863, 016963</td><td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td></tr><tr><td>Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>423105</td><td>文中称为 MI-NIR</td></tr></tbody></table>

改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

在脊椎动物视网膜中，双极细胞和水平细胞是光感受器检测到光子后最先处理视觉信息的神经元。它们执行诸如光适应、对比度敏感性以及空间和颜色拮抗等基本功能。全面理解调控这些细胞行为的精确神经环路和生化机制，将推动视觉神经科学研究和眼科医学的发展。然而，目前用于研究双极细胞和水平细胞的制备方法（视网膜铺片和垂直切片）在呈现这些细胞的解剖结构和生理特性方面存在局限性。本文中，我们介绍一种从活体小鼠视网膜平铺标本中去除光感受器细胞体的方法，从而更有效地接近双极细胞和水平细胞，实现高效的膜片钳记录和快速免疫标记。该分离视网膜的制备方法是将分离的小鼠视网膜夹在两片硝酸纤维素膜之间，然后轻轻将其分开。分离面位于外丛状层上方，得到两片硝酸纤维素膜，其中一片附有光感受器细胞体，另一片则保留剩余的内层视网膜。与垂直视网膜切片不同，这种分离视网膜制备方法不会切断内层视网膜神经元的树突过程，因而能够记录到整合了缝隙连接网络以及广视野无长突细胞输入的双极细胞和水平细胞活动。本研究展示了该制备方法在电生理学、免疫组织化学以及原位杂交实验中研究水平细胞和双极细胞的广泛适用性。

视网膜分离可保存光感受器终末
为了证实视网膜分离不会损伤外丛状层（OPL）中二级神经元的树突，对分离后的视网膜进行垂直切片，并使用针对突触小泡蛋白突触素（synaptophysin，绿色）和蛋白激酶Cα（PKCα；红色）的抗体进行染色。图2显示，分离后视网膜顶部出现强烈的突触素免疫荧光条带，表明光感受器突触终末得以保留。此外，PKCα染色显示视杆双极细胞（RBCs）形态正常。未见光感受器细胞核，表明视网膜的分离位置位于外丛状层与最内层的光感受器胞体之间（图2）。
<img alt="使用 DAPI、PKCα 和突触素对视网膜各层进行免疫荧光标记；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig02.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 2"> 
图 2：分离的视网膜保留了感光细胞终末结构。 荧光共聚焦显微图像显示了在完成分离操作后经冷冻切片（厚度为 20 µm）得到的分离视网膜的垂直截面。每幅图像均为共聚焦 z 轴层扫的最大投影图像。该切片使用抗 PKCα 抗体（上中图）和抗突触素抗体（上右图）进行免疫标记，分别用于显示视杆双极细胞（RBCs）和突触小泡。合并图像（下图）显示位于外丛状层（OPL）中 RBC 顶端突起上方的感光细胞终末内含有突触小泡（绿色）。细胞核用 DAPI 染色（蓝色）。在外核层（ONL）内未见感光细胞核。缩写：ONL = 外核层；OPL = 外丛状层；INL = 内核层；IPL = 内丛状层；GC = 节细胞。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
  
视网膜分离后外丛状层突触形态得以保留
使用在 pcp2 启动子驱动下于红细胞中表达 GFP 的小鼠14 OPL 中的突触前和突触后蛋白经免疫标记，以评估分裂后该突触层的完整性14尽管光感受器轴突受到剪切力的作用，但分裂操作并未影响外丛状层（OPL）中光感受器-双极细胞突触的形态，RGS11标记的杆状双极细胞树突和CtBP2标记的光感受器突触带均保持正常定位15 被观察到（图 3）。在每个视杆细胞与RBC之间的突触接触处，RGS11表现为位于突触带（绿色）马蹄形结构内的红色斑点。在后续实验中，使用抗GPR179抗体16 用于标记突触后ON-BC树突末端16，使用抗PSD-95抗体标记突触前杆状光感受器终末（补充图2这些结果再次证实了在离体视网膜制备中OPL的稳定性，因为RBC树突被证实与其突触前伴侣——视杆细胞终末——紧密关联。
<img alt="显示蛋白质定位的共聚焦显微镜图像；GFP、CtBP2、RGS11 的共定位指示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig03.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 3"> 
图 3：视网膜分离后外丛状层（OPL）中的突触形态得以保留。 来自一只转基因小鼠分离视网膜的共聚焦免疫荧光图像，该小鼠在Pcp2启动子驱动下于杆状双极细胞（RBCs）中表达GFP。视网膜中不同RBCs的GFP表达水平（蓝色）存在差异。分离后，视网膜经固定，再与抗CtBP2抗体（绿色）和抗RGS11抗体（红色）孵育，分别标记光感受器突触带和ON-BC树突末梢。每一对红-绿信号代表杆细胞与ON-BC之间的一个突触接触。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视网膜分离可维持红细胞活力
为了评估视网膜分离后内层视网膜神经元的存活情况，使用了一种膜不通透的近红外核染料（MI-NIR），该染料可用于识别死亡细胞。将分离后的视网膜与MI-NIR孵育后，进行固定，并用抗PKCα抗体标记以识别杆状双极细胞（RBCs）。分离视网膜的共聚焦显微图像显示，组织不同区域的细胞存活率存在区域性差异，某些区域的细胞死亡率高于其他区域。这种差异可能是由于在解剖、分离或操作过程中对视网膜特定区域造成的损伤所致（图4）。鉴于RBCs的胞体位于内核层（INL）最外侧，靠近分离面，因此有必要对其存活状态进行仔细评估。PKCα与MI-NIR极少共定位，证实了大多数RBCs在视网膜分离后仍保持存活状态（图4）。
<img alt="荧光显微镜，DAPI，PKCα，MI-NIR，细胞成像，蛋白定位，通道合并分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig04.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 4"> 
图 4：视网膜分离后杆状双极细胞仍具有活性。 荧光共聚焦显微图像显示以平铺视角观察的分离视网膜区域。分离后，活体视网膜在 37 °C 下与 MI-NIR 染料（红色）孵育 30 分钟。随后将视网膜固定，并使用抗 PKCα 抗体进行免疫标记以显示杆状双极细胞（RBCs）。在该视网膜区域中，PKCα 与 MI-NIR 的共定位较少见。MI-NIR 与不属于杆状双极细胞的细胞核（蓝色）发生共定位。缩写：MI-NIR = 膜不通透性近红外活死细胞染料。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
  
分离的视网膜适用于双重 FISH 与 IHC
通过延长标准免疫组化（IHC）的固定时间，可对分离的视网膜依次进行荧光原位杂交（FISH）和免疫组化处理，从而同时标记mRNA和蛋白质17,18。实验证实，使用4%多聚甲醛固定2小时可获得稳定的mRNA标记效果，同时仍能保留蛋白表位以供抗体结合。在分离的视网膜上先进行FISH，再进行IHC，以可视化GABAA受体亚基δ（GABRD；反义mRNA探针）的表达，并结合RBCs的位置（抗PKCα抗体）进行分析，其位于外侧内核层（outer INL）（图5A）。GABRD mRNA在RBCs中表达稀少（图5A）；然而，在完整视网膜的横切面上，可见该转录本在无长突细胞和节细胞中大量表达（图5B）。在外侧内核层（图5A），GABRD mRNA的分布较均匀，而在内侧内核层（inner INL）（图5C），其表达集中在特定细胞中。针对其他GABA受体亚基的反义探针产生不同的标记模式，表明探针具有特异性（数据未显示）。
<img alt="免疫荧光显微镜；DAPI、PKCα、GABRD 在视网膜各层中的定位；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig05.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 5"> 
图 5：分离视网膜与完整视网膜中的双重 FISH 与 IHC 检测。 （A, C）平铺分离视网膜的共聚焦显微图像，以及（B）完整视网膜的垂直切片图像。（A）和（C）中的图像分别为内核层上部和下部区域光学切片的最大投影。（B）中的虚线矩形表示用于生成（A）和（C）中投影图像的大致边界。分离视网膜（A, C）经 2 小时固定后，使用针对 GABRD 的反义 mRNA 探针（红色）进行标记。随后，用抗 PKCα 抗体对分离视网膜染色以标记视杆双极细胞（RBCs，绿色）。为清晰起见，在下部内核层的投影中省略了 PKCα 信号通道。（B）中的完整视网膜在切片前固定 24 小时，之后用针对 GABRD 的反义 mRNA 探针（红色）进行标记。所有样品在封片前均用 DAPI（蓝色）染色 20 秒。缩写：INL = 内核层。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
分离的视网膜非常适合对双极细胞和水平细胞进行膜片钳电生理记录
在传统的全层视网膜标本中，对双极细胞（BC）或水平细胞（HC）的胞体进行膜片钳记录时，移液管需从节细胞层侧或光感受器细胞侧接近。这两种方式均需穿过视网膜的多个层次才能到达内核层（INL），在此过程中移液管尖端常被组织碎片阻塞。在振动切片机制备的视网膜切片中，双极细胞和水平细胞的胞体易于接近，但其树突过程可能被切断，从而破坏其横向连接。然而，在分离的视网膜标本中，视杆双极细胞（RBC）和水平细胞的胞体位于组织表面，使膜片钳移液管的接近性显著改善，同时保留了外丛状层（OPL）的横向神经环路。
图6 显示了在分离视网膜中记录到的双极细胞（BCs）的化学模拟光反应。灌流的Ames培养基中添加了L-AP4（4 µM），一种III组mGluR激动剂，用于模拟暗光条件下光感受器释放的谷氨酸。将mGluR6拮抗剂CPPG（600 µM，溶于Ames培养基）吹注到膜片钳记录细胞的树突上（细胞钳制在-60 mV），以通过抑制mGluR6来模拟光脉冲。细胞对CPPG吹注产生两种类型的内向电流反应。一种类型表现为先出现瞬时电流，随后进入平台期（图6A），类似于在视网膜切片中记录到的RBCs典型的光诱发电流19；另一种类型在整个吹注期间持续维持（图6B），类似于ON型视锥双极细胞（ON-CBC）中记录到的电流19。
另进行了一项实验以靶向 HCs，这是一种树突分布广泛的细胞类型，通常在脑片制备中难以完整保存。使用了一种表达通道视紫红质（ChR2）和 GFP 的小鼠品系，以便在荧光显微镜下易于识别。首先，记录 HCs 对一系列去极化阶梯脉冲（-100 mV 至 50 mV，步长 = 15 mV）的电流反应，这些细胞表现出先内向后外向的电流响应（图 6C）。随后，用短暂的蓝光脉冲（200 ms，470 nm）刺激这些细胞，在两个细胞中诱发了显著的、由 ChR2 驱动的内向电流（图 6D）。
<img alt="电生理学研究图；视杆细胞、视锥细胞中的电流；GFP标记细胞成像；对470 nm光的反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图6"> 
图6：分离视网膜内核层神经元的膜片钳记录。（A）一个假定的视杆双极细胞（RBC）和（B）锥双极细胞（CBC）在灌流的含L-AP4（4 µM）Ames培养基中以-60 mV进行电压钳制。向钳制细胞的树突局部施加CPPG（600 µM）可引发内向电流，在RBC中该电流呈瞬时性，而在CBC中则持续存在。（A）中的RBC记录为单次轨迹，而（B）中的CBC记录为3次轨迹的平均值。（C）来自vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d小鼠水平细胞（HC）的膜片钳记录。红线表示用于激活ChR2介导的大内向电流的200 ms、470 nm光脉冲持续时间。（D）一个在-60 mV电压钳制的HC在-70 mV至+35 mV之间以15 mV为步长进行电压阶跃并返回-60 mV时的注入电流反应。插图显示了电压阶跃起始前后6 ms时间窗内的相同轨迹。（E）vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d小鼠平铺分离视网膜的免疫荧光显微图像，显示表达GFP的水平细胞。比例尺 = 20 µm。电生理数据以20 kHz采样率采集，并用5 kHz低通贝塞尔滤波器过滤。随后导出数据，使用Python 3进行离线可视化和分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视网膜分离技术可实现对内核层和外丛状层结构的快速分析
视网膜的外界膜（ELM）和外核层（ONL）构成一个约 90 µm 厚的屏障，阻碍抗体向内层视网膜的扩散，从而导致免疫染色条件不理想20,21,22。因此，使用传统的视网膜平铺标本对外丛状层（OPL）或内核层（INL）进行免疫标记时，往往需要耗时较长的染色方案，抗体孵育时间通常需 48–96 小时5,6,7,8,20,22。
去除感光细胞可使抗体快速渗透至内层视网膜神经元。因此，使用染料标记的一抗，可在短短1小时内实现对内层视网膜蛋白靶标的标记。抗PKCα和Calbindin-D抗体分别用于标记内核层（INL）中的杆状双极细胞（RBCs）和水平细胞（HCs）（图7）。与传统的垂直视网膜切片（会截断广域神经元的侧向突起）不同，分离视网膜制备法能够完整呈现广域细胞（如水平细胞）的全树突分支结构（图6E，图7）。
<img alt="显示使用 DAPI、PKCα、Cal-D 和合并通道进行蛋白质定位的共聚焦显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65757/65757fig07.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="图 7"> 
图 7：分离视网膜中内层视网膜蛋白的快速免疫标记。 从平铺视角观察分离视网膜的共聚焦免疫荧光图像。将分离的视网膜在室温下与抗 PKCα 抗体（黄色）和抗钙结合蛋白 D 抗体（绿色）孵育 1 小时，分别标记 ON-双极细胞（ON-BCs）和水平细胞（HCs）。(A) 每个单通道图像均为由四个光学切片组成的平均 Z 投影：DAPI（平均 z10-13）、Calbindin-D（平均 z11-14）、PKCα（平均 z11-14）。(B) 在合并图像中，上述投影被叠加显示。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/65757fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：视网膜分离的关键步骤。 所有图像均使用安装在解剖显微镜目镜上的智能手机摄像头拍摄。（A）小鼠眼球在去除角膜后的俯视图。（B）小鼠眼杯在晶状体被移除后的俯视图。（C）在小鼠眼杯的巩膜上做一个小切口。箭头指示由镊子向相反方向牵拉的两片巩膜瓣，以开始将视网膜与巩膜分离。（D）当巩膜部分从视网膜上被拉开后，将Vannas剪刀插入巩膜与视网膜之间，切断视神经，从而释放视网膜。红色虚线圆圈显示视神经乳头位置，剪刀方向示意正确的切割路径（将剪刀插入巩膜与视网膜之间）。图中还显示巩膜被完全剥离后分离出的视网膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/Fig.%20S1_RE.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：分离视网膜中外丛状层突触前和突触后成分的表征。 来自分离视网膜中外丛状层（OPL）的共聚焦免疫荧光图像。将分离的视网膜在室温下与抗GPR179和抗PSD95抗体共同孵育1小时，分别标记ON-BCs的树突末端和视杆细胞光感受器的终末。左侧和中间图像为多个光学切片的最大投影；最右侧图像为上述投影的叠加。可见ON-BC树突末端的GPR179斑点与视杆细胞光感受器终末紧密关联，表明OPL内突触连接保持完整。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/Fig.%20S2_RE.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：故障排除：评估分离视网膜的质量。 使用DAPI染色的分离视网膜荧光显微图像，用于观察细胞核。可根据细胞核的直径和组织深度来识别不同类型的细胞。(A) 光感受器细胞核较小、荧光较亮，位置更表浅；而(B) 双极细胞（BC）细胞核较大、荧光较暗，位置更深。(C) 一处光感受器未完全去除区域的低倍图像。处于焦平面的细胞核来自位置较深的双极细胞（BC），而图像边缘失焦的细胞核则属于位置更表浅的光感受器细胞。图(A)和(B)的比例尺 = 20 µm。图(C)的比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65757/Fig.%20S3_RE.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了一种替代性的视网膜平铺制备方法，通过去除感光细胞胞体，可加快抗体扩散速度，并改善对内层视网膜神经元进行免疫组织化学染色时的膜片钳电极接触条件。 原位 杂交和电生理实验。

脊椎动物视网膜中的双极细胞和水平细胞是在光子被感光细胞接收后，最先处理视觉信息的神经元。

我们的研究团队致力于探索视网膜中视觉信息处理的神经环路及突触机制。Morgans 实验室正在研究双极细胞中光适应的分子机制，而 Sivyer 实验室则关注内层视网膜神经元如何影响神经节细胞的功能。在整体视网膜标本中获取内核层神经元是解剖学和生理学研究面临的一项挑战。虽然在垂直切片中可以接触到内核层神经元，但视野中的神经元数量极少。此外，切片会严重损伤神经元的侧向突起和连接，从而影响生理学研究。在分离视网膜技术中去除感光细胞可显著改善抗体向内层视网膜的扩散，与传统的整体视网膜标本相比，内层视网膜靶标的免疫标记速度可提高20倍以上。分离视网膜技术还大大改善了膜片钳电生理记录过程中对内核层神经元的接触。该技术将为新的研究方法打开大门，并加快实验进程。例如，我们计划利用该技术，通过在双极细胞中表达通道视紫红质，研究双极细胞对黑视蛋白神经节细胞的输入。 使用宽口移液管，将一只小鼠眼球转移至一个新的培养皿中，培养皿内含有冰冷的新鲜Ames培养基。用一对镊子将眼球多余的结缔组织固定在培养皿底部，以稳定眼球。接着，用25号针头沿锯齿缘线刺穿眼球，为Vannas剪刀创建一个进入口。使用环钻剪沿锯齿缘剪开，直至角膜分离。用一对镊子从眼杯中取出晶状体，然后使用宽口移液管将眼杯转移至含有大量持续通入碳氧混合气的艾姆斯溶液的培养皿中。将一个眼杯转移至盛有新鲜碳氧混合气饱和艾姆斯溶液的培养皿中。使用Vannas剪刀从巩膜边缘向内做一小切口。用两把镊子小心地将巩膜从视网膜上剥离。接着，剪断连接巩膜与视网膜的视神经，然后用剪刀轻轻撬动，将视网膜从巩膜上分离下来以完成分离。接下来，使用手术刀将视网膜切成两半或四等份。用宽口移液管将视网膜组织块放入大量持续通入碳氧混合气体的Ames培养基中。在进行视网膜分离之前，对另一只眼睛重复视网膜解剖操作。首先，将含有小鼠视网膜的培养皿中的艾姆斯（Ames）培养基更换为新鲜的碳合艾姆斯培养基。使用宽口移液管将一块分离的小鼠视网膜转移至载玻片上，确保节细胞面朝上。用精细擦拭纸吸去多余液体，使其展平。如有必要，在解剖显微镜下使用细头画笔轻轻将视网膜边缘拉平。用镊子将一片干燥的硝酸纤维素膜放置在视网膜上，使其贴附于神经节细胞一侧。将视网膜翻转，使硝酸纤维素膜朝下置于载玻片上，并在视网膜的光感受器一侧再放置另一片干燥的硝酸纤维素膜。现在，用Ames培养基润湿画笔的笔尖。轻轻向下按压上层膜，以帮助其均匀贴附。接着，用一对镊子将下层膜固定在玻璃上，然后小心使用另一对镊子以缓慢而稳定的动作剥离上层膜。弃去含有感光细胞的上层膜，将含有内层视网膜的下层膜放回通有碳氧混合气体的Ames培养基中。随后，将附有硝酸纤维素膜的分离小鼠视网膜置于冰上，浸入4%多聚甲醛溶液中固定30分钟。接下来，用5至10毫升室温的PBS替换多聚甲醛，以洗涤分离的视网膜。在将分离的视网膜从硝酸纤维素膜上取下之前，使用疏水屏障笔在载玻片上绘制圆形孔穴。让孔穴在空气中干燥5至10分钟。随后，将分离的视网膜放入已制备好的孔穴中，并加入足量PBS使其完全浸没。在解剖显微镜下，用精细的画笔轻轻抬起组织边缘，围绕视网膜画圈，使其与膜分离。使用镊子和画笔将膜从漂浮的视网膜片下方移除。然后小心吸除残留的PBS，使视网膜组织贴附在载玻片上，节细胞面朝下。在分离的视网膜顶部进行突触素免疫荧光标记表明，光感受器的突触终末得以保留。然而，光感受器细胞核缺失，证实视网膜切分发生在光感受器轴突处。通过标记非双极细胞树突中的RGS11以及光感受器突触带中的CtBP2来评估突触完整性。分离操作未对外丛状层中光感受器终末的形态造成损伤。使用近红外核染料评估了分离视网膜中RBC的存活率。观察到组织内细胞存活率存在区域差异，某些区域细胞死亡较多，但大部分RBC在分离后仍保持存活。针对PKC alpha的红细胞免疫荧光标记以及针对calbindin-D的水平细胞标记显示，在分离的视网膜中孵育一小时后，抗体迅速扩散。

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