新生小鼠鞘内注射用于基因组编辑与药物递送
2024年3月8日
本方案详细介绍了在新生小鼠中进行鞘内注射以实现基因编辑和药物递送的逐步操作步骤。
本课题组采用跨学科方法，结合基因组学发现与功能建模，研究神经发育障碍的遗传与表观遗传基础。我们利用患者来源的诱导性多能干细胞（iPSC）或基因突变小鼠，开展分子、神经生理及神经行为学分析，以解析神经发育障碍的病理生理机制。我们的目标是开发基于基因编辑的疾病治疗策略。
脑室内注射（也称为ICV注射）是直接将治疗物质递送至新生小鼠中枢神经系统的唯一方法。然而，该方法必须穿透大脑皮层。鞘内（IT）注射是一种在临床中常用的给药操作，可作为将治疗物质直接递送至中枢神经系统的有效手段。
然而，由于新生幼鼠体型微小且身体脆弱，对其进行鞘内注射可能带来重大的技术挑战。我们正致力于开发一种高效且可靠的非病毒、非纳米颗粒递送方法，用于检测小鼠大脑中的基因编辑效果和治疗功效。与传统的脑室内注射相比，鞘内注射显著降低了风险，因为它无需直接穿透大脑皮层。
这种优势可最大限度地减少对局部皮质组织及周围神经的潜在损伤。鞘内注射还可使药物给药体积至少增加五倍，因此单次注射即可显著提高重复给药时的可视性。开始操作时，将幼鼠移至远离母鼠的另一个笼子中进行处理。
开始注射操作前，使用解剖显微镜确认幼鼠的椎间隙，或至少确认脊髓管的中线位置。用25或10微升注射器吸取10微升所需注射物质，如药物制剂、病毒悬液或对照用人造脊髓液等。待动物完全麻醉（通过身体活动减少或消失确认）后，将幼鼠轻柔地置于显微镜下。
用左手的食指和拇指，仔细触诊位于双侧骨盆带之间的中线处的椎间隙。轻轻旋转尾部基底，以帮助确定脊柱的中线。在凹陷与中线相交处，将针头小心插入，针头倾斜角度为70至80度，同时确保其始终与正中矢状面保持一致。
当针尖接触骨组织时，逐渐将角度减小至约30度，并将针头向前推进约2毫米进入椎间隙。在50至60秒内缓慢注射最多10微升的液体。注射完成后，保持针头在原位停留10至20秒。
轻轻旋转针头以避免渗漏。注射后，将幼鼠置于加热垫上 10 至 15 分钟，使其充分恢复并复温。在野生型新生鼠中注射快绿后，立即观察到注射液广泛分布。
在通过鞘内注射基于CRISPR-Cas9的基因编辑工具10天后，YFP报告小鼠在整个大脑中均表现出广泛的YFP表达。
概述
本研究提供了一种在新生小鼠中进行鞘内注射的详细实验方案，可实现基因编辑和药物直接递送至中枢神经系统。该技术旨在克服新生幼鼠组织脆弱所带来的操作难题，并在不损伤周围组织的前提下提高治疗的可靠性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因编辑
- 发育生物学
背景
- 神经发育障碍可通过靶向基因编辑获益。
- 鞘内注射为脑室注射方法提供了一种创伤更小的替代方案。
- 由于新生小鼠体型小且脆弱，该操作特别适用于此类动物模型。
- 有效的递送方法对于在动物模型中测试基因编辑效果至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的向中枢神经系统直接给药的实验方案。
- 提高在神经发育障碍小鼠模型中基因编辑方法的安全性和有效性。
- 研究给药后注射物质的分布情况及其生物学效应。
使用的方法
- 使用新生小鼠作为生物模型的鞘内注射技术。
- 探索了药物制剂和CRISPR-Cas9制备物等物质用于直接脊髓给药的可能性。
- 精确性至关重要：需使用特定体积的注射器，并要求准确识别解剖结构。
- 强调对幼鼠注射后的护理和恢复过程。
主要结果
- 注射后证实了溶液在新生小鼠脑内的成功递送与分布。
- 鞘内注射后，观察到基因编辑响应下YFP报告基因的广泛表达。
- 与传统方法相比，该方法显示出显著增加的可给药体积。
- 较低的皮层组织损伤风险提高了基因递送的准确性。
结论
- 该研究展示了一种在新生动物模型中进行药物递送和基因编辑的创新且有效的方法。
- 该方法使得在神经发育障碍研究中的干预更加安全。
- 它强调了精确定位解剖结构对于提高中枢神经系统治疗效果的重要性。
常见问题
行业高管相关性
新生小鼠鞘内直接注射可将基因编辑工具和治疗药物精确递送至中枢神经系统，解决了神经遗传药物研发中的一个关键瓶颈问题。该方法可减少脱靶暴露和组织损伤，有助于提高早期药效和安全性评估的预测可靠性。该技术的标准化增强了从临床前模型向神经发育障碍潜在临床应用转化的连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在体内对神经遗传学靶点进行功能研究，同时最大程度减少皮层损伤。
- 通过实现基因编辑试剂和候选治疗药物直接递送至中枢神经系统，支持生物学风险评估。
- 有助于在新生动物模型中对靶点结合及作用机制结果进行可靠评估。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复的系统，用于在受控环境中评估靶向中枢神经系统的化合物和基因疗法。
- 通过减少操作变异并最大化递送一致性，提高检测方法的标准化水平。
- 能够在中枢神经系统给药后，实现对分布和表达的定量测量。
转化与临床前研究
- 将临床前递送方法与神经遗传性疾病临床鞘内给药策略相统一。
- 通过在新生模型中提供可靠的中枢神经系统暴露数据，支持基于风险评估的推进决策。
- 促进转化生物标志物及长期基因表达结果的评估。
流程与工作流整合
该方案融入了以中枢神经系统为靶点的治疗手段从发现到临床前研究的连续过程，架起了早期机制研究与转化研究之间的桥梁。
- 发现生物学：通过直接干预中枢神经系统，实现对神经发育靶点的假设验证和通路解析。
- 筛选：为新生儿中枢神经系统组织中的化合物和基因治疗评估提供经过验证的可重复研究平台。
- 分析：支持注射后中枢神经系统内分布、基因表达及表型结果的定量评估。
- 转化研究：确保临床前有效性研究与临床给药方式之间的连续性。
- 企业级复用：建立标准化、可扩展的操作流程，供神经遗传学研究项目重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高中枢神经系统靶向治疗开发和靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：增强新生儿中枢神经系统递送工作流程的可重复性、标准化程度和可扩展性。
- 战略价值：提升神经遗传学项目中“推进/终止”决策的质量，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于可靠的临床前数据，实现对中枢神经系统靶向资产的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备新生儿操作和精确定位解剖结构的技术专长。
- 需要专用的显微注射设备和影像支持，以确保准确递送。
- 必须严格遵守动物福利和操作标准化规程。
- 由于解剖结构差异，可能需要针对不同啮齿类品系或更大的动物模型进行调整。
- 必须谨慎控制注射体积和注射速率，以避免不良影响。
