脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

我们的目标是开发一种器官型肺组织模型。为此，我们优化了牛肺组织的脱细胞化过程以及肺细胞外基质水凝胶的重建。在本研究中，我们旨在了解不同脱细胞化方法对重建肺水凝胶生化特性和力学特性的影响。

脱细胞化方案面临的主要挑战之一是实现重建水凝胶的机械稳定性，这需要深入了解脱细胞化对机械性能的影响。这些性能（如刚度和黏弹性）对细胞行为具有关键作用。我们已建立了一套有效的牛肺脱细胞化方法，可获得可重复的肺源性水凝胶，其特性与人肺细胞外基质表现出显著的相似性。

因此，利用天然肺源dECM水凝胶在肺部疾病建模方面具有巨大潜力。我们构建了用于模拟稳态和疾病状态的组织模型，特别关注细胞与基质之间的相互作用。因此，我们致力于探究器官特异性细胞外基质在独特成分和力学特性方面对细胞行为的影响。

我们的当前研究重点是构建仿生的、患者特异性的癌症类器官模型。首先，从零下80摄氏度取出冷冻的牛肺组织，在室温下使其解冻。使用无菌手术刀和剪刀解剖组织，去除气管和软骨性气道。

然后将组织切成小块。用含有2%青霉素和链霉素的超纯水洗涤组织三次。将切碎的组织样本浸入2%碘溶液中一分钟。

然后用无菌蒸馏水连续洗涤两次。将组织块转移至50毫升离心管中，至15毫升刻度线处。用蒸馏水加满离心管，置于液氮中冷冻两分钟。

然后立即将离心管转移至含有37摄氏度水的烧杯中，孵育10分钟。经过五次冻融循环后，在37摄氏度下将样品与30毫升DNA溶液共同孵育1小时，并持续搅拌。将湿润的脱细胞细胞外基质样品在80摄氏度下冷冻24小时。

将冷冻样品转移至冷冻干燥机中，在真空条件下以干燥模式运行三至四天，直至完全干燥。冻干后，在含有干冰的研磨装置中将样品研磨成细粉。用1% Triton X-100在4摄氏度下轻柔旋转处理肺组织三天，每24小时更换一次溶液。

将样品在37摄氏度下于DNA溶液中孵育1小时，并持续搅拌。在持续滚动条件下用蒸馏水洗涤组织三天，每24小时更换一次水。最后一次洗涤后，按先前所示方法进行冻干和低温研磨。

在室温下，将15毫克/毫升的脱细胞细胞外基质粉末样品溶于1毫克/毫升的胃蛋白酶溶液中，持续搅拌消化48小时。保持溶液pH为2，以确保有效消化。将组织消化液在5000g离心10分钟，弃去上清液。

打开Discovery HR-2流变仪以进行振荡流变学测量。将置于冰上的250微升预凝胶消化液倒入预冷的下板上，以避免快速凝胶化。降低20毫米平行板，直至预凝胶溶液形成一个在两板之间间隙宽度为1毫米的圆盘状液层。

将应变设为0.1%，频率设为0.5赫兹。在将下板加热至37摄氏度并持续30分钟的过程中，实时测量储能模量和损耗模量，以观察膨胀动力学。当储能模量值不再增加并达到平台期后，进行蠕变恢复测试，以评估水凝胶的应力松弛行为。

对水凝胶施加1帕斯卡的剪切应力，持续15分钟，并测量应变。然后解除样品的应力，记录接下来15分钟内应变值的变化。最后，绘制应变随时间变化的曲线图，以展示应力松弛行为。

通过冻融法制备的水凝胶，其平均储能模量和损耗模量显著高于使用Triton X-100法制备的水凝胶。蠕变恢复测试表明，两种方法制备的水凝胶表现出不同的应力响应，显示出各异的黏弹性特性。