Name: 脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 了解脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征方法，使用牛肺组织优化脱细胞化技术，评估其对水凝胶生化与力学特性的影响，为构建器官型肺组织模型提供可靠方案。

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本工作由土耳其科学与技术研究委员会（TÜBİTAK）资助（项目编号：118C238）。本出版物/论文的全部责任由出版物所有者承担。TÜBİTAK 提供的经费支持并不意味着 TÜBİTAK 在科学意义上认可该出版物的内容。作者对科奇大学转化医学研究中心（KUTTAM）所提供的服务与设施表示衷心感谢。图1和图2a使用Biorender.com制作。

从当地屠宰场获取年轻（1-2岁）牛供体的新鲜原代肺组织，并将其置于密封塑料容器中冰上运输至实验室。动物屠宰用于普通肉类消费（肺组织作为废弃物丢弃），与本研究无关，亦非因本研究而进行。我们确认该屠宰场遵守国家关于动物屠宰的法律法规。此外，我们确认仅使用了废弃材料，且本研究项目未对屠宰动物数量产生任何影响。
1. 器官收获与组织制备
<ol>
	<li>将新鲜获取的牛肺组织在 -80 °C 下保存，直至实验使用。</li>
	<li>实验当天，将冷冻的肺组织在室温下解冻。</li>
	<li>使用无菌手术刀和剪刀解剖组织，去除气管和软骨性气道，并进一步切成小块（5 mm3）。</li>
	<li>用含有 2% 青霉素/链霉素（P/S）的超纯水彻底清洗至少 3 次。</li>
</ol>
2. 组织脱细胞
注意：采用两种不同的方案对天然牛肺组织进行脱细胞处理。
<ol>
	<li>冻融法
	<ol>
		<li>按照步骤1准备组织样本。将剪碎的组织浸入无菌蒸馏水（dH2O）中含2%碘溶液中1分钟。用无菌dH2O连续洗涤两次。</li>
		<li>将剪碎的组织块转移至50 mL离心管中，液面高度不超过15 mL，并使用便携式液氮容器进行五次手动冻融循环。用无菌dH2O将离心管加满，在液氮中冷冻2分钟。2分钟后立即转移至37 °C水浴中解冻10分钟。此过程构成一次冻融循环。</li>
		<li>将样本与30 mL DNase溶液（10 U/mL）在10 mM MgCl2 缓冲液（pH 7.5）中于37 °C孵育1小时，同时以100 rpm持续振荡。</li>
		<li>在100 rpm持续振荡条件下，用无菌dH2O进行为期3天的充分洗涤，每24小时更换一次溶液。</li>
		<li>按如下方法进行冷冻干燥和低温研磨20：将湿态dECM样本在-80 °C下冷冻24小时。将冷冻后的样本转移至冷冻干燥机中，在真空条件下干燥模式运行3至4天，直至完全干燥。冻干完成后，使用研磨装置和干冰将样本研磨成细粉。 
		注：由于该细粉在后续消化过程中的溶解性更佳，因此认为达到此细粉状态十分必要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Triton-X-100法
	<ol>
		<li>按照步骤1准备组织样本。将肺组织在4 °C下以1% Triton-X-100溶液轻柔旋转处理3天，每24小时更换一次溶液。</li>
		<li>将样本在10 mM MgCl2&#160;缓冲液（pH 7.5）中与DNase溶液（10 U/mL）于37 °C孵育1小时，同时持续振荡。</li>
		<li>在轻柔旋转条件下，用无菌dH2O进行为期3天的充分洗涤，每24小时更换一次溶液。</li>
		<li>按照步骤2.1所述方法进行冷冻干燥，随后进行低温研磨。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胃蛋白酶消化
<ol>
	<li>将粉末状 dECM 样品以 15 mg/mL（w/v）的浓度置于胃蛋白酶溶液（1 mg/mL 胃蛋白酶，0.01 M HCl，pH 2）中进行消化。在室温下持续搅拌消化 48 小时，并频繁调节溶液 pH 值以确保有效消化。</li>
	<li>将消化产物转移至离心管中，在5000 x g条件下离心 g 10 分钟</li>
	<li>收集上清液，并通过加入5 M NaOH和10×磷酸盐缓冲液（PBS）将其中和并调节至生理条件（pH 7，1×磷酸盐缓冲盐水（PBS））。 
	注意：建议使用浓碱溶液来调节酸性消化液的pH值，因为这种方法可避免可能引起的不必要体积膨胀&#160;对后续步骤中的凝胶化产生不利影响。</li>
	<li>将预凝胶消化产物于 −20 °C 保存，以备后续研究。</li>
</ol>
4. 组织学染色
<ol>
	<li>取少量（5 mm3）脱细胞组织样本，置于1 mL 3.7%甲醛溶液中，4 °C条件下固定过夜。</li>
	<li>将组织置于含有1 mL PBS配制的30%蔗糖溶液的离心管中，4 °C条件下缓慢摇动孵育12小时。</li>
	<li>为将组织包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，先向冷冻模具中加入1 mL OCT，将组织置于模具中央，再在组织上方覆盖2 mL OCT。</li>
	<li>将装有组织的冷冻模具置于干冰上，用液氮速冻。当OCT完全变为白色时即完成冷冻，通常需3分钟。将OCT包埋的组织储存于-20 °C，待用。</li>
	<li>在-25 °C条件下用恒冷切片机切取10 µm厚的组织切片，置于多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，转移至室温使组织切片在载玻片上融化。切片储存于-20 °C，待用。</li>
	<li>为确认脱细胞后细胞核的去除情况，按以下步骤进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。
	<ol>
		<li>室温孵育载玻片10分钟。将载玻片浸入PBS中，随后在染色缸中用50 mL即用型苏木精溶液染色3分钟，再用自来水冲洗3分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入95%乙醇中，在染色缸中用50 mL 0.5%醇溶性伊红溶液染色45秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行天狼星红染色以显示脱细胞后胶原成分的保留情况。
	<ol>
		<li>用PBS水化载玻片，随后在染色缸中用50 mL含0.1%天狼星红的苦味酸饱和水溶液染色1小时。</li>
		<li>用0.5%乙酸溶液冲洗载玻片5秒，并依次将所有载玻片浸入70%、95%和100%乙醇中各1分钟，进行逐级脱水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分析组织样本中的硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，按以下步骤进行阿利新蓝染色。
	<ol>
		<li>在染色缸中用50 mL含1%阿利新蓝的3%乙酸溶液（pH 2.5）染色30分钟。用流动自来水冲洗载玻片2分钟。</li>
		<li>依次将所有载玻片浸入70%、95%和100%乙醇中各1分钟，进行逐级脱水。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在样本上滴加0.1 mL封片剂，使用10倍物镜的光学显微镜观察结果。</li>
</ol>
5. 力学性能表征
<ol>
	<li>使用配备平行板几何结构的流变仪进行振荡流变学测量。</li>
	<li>将预冷（4 °C）下板上保持在冰上的 250 µL 预凝胶溶液倒入下板，以避免快速凝胶化。</li>
	<li>降低 20 mm 平行板，直至预凝胶溶液形成一个两板之间间隙宽度为 1 mm 的圆盘状液层。</li>
	<li>立即开始测量。在将下板加热至 37 °C 持续 30 分钟以观察凝胶动力学的同时，以固定频率和应变连续测量储能模量和损耗模量。采用 0.5 Hz 的固定频率和 0.1% 的应变。</li>
	<li>当储能模量值停止上升并达到平台期后，进行蠕变-恢复测试。</li>
	<li>对水凝胶施加 1 Pa 的剪切应力持续 15 分钟，测量应变，随后解除样品上的应力，并记录接下来 15 分钟内应变值的变化。</li>
	<li>绘制应变随时间变化的曲线图，以展示应力松弛行为。对三种不同的脱细胞细胞外基质（dECM）消化液分别进行三次重复测量。</li>
</ol>

Comparative Study of Decellularization Techniques for Bovine Lung ECM Hydrogels

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
<li>Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vascularized+lung+cancer-on-a-chip+with+lung+extracellular+matrix+hydrogels+for+in+vitro+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening.</a> Cancers (Basel). 13 (16), 3930(2021).</li>
<li>Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+bioengineering%3A+advances+and+challenges+in+lung+decellularization+and+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization.</a> Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).</li>
<li>Roth, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+freeze-thaw+cycles+for+decellularization+of+tendon+tissue+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 13(2017).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).</li>
<li>Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+viscoelasticity+on+cellular+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour.</a> Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

器官来源的水凝胶已成为有前景的模型，可重现天然组织的细胞外基质（ECM）并模拟器官特异性细胞功能。尽管脱细胞肺ECM已常用于组织工程，但对生物材料成分和机械性能进行系统表征，将有助于更深入理解细胞-ECM相互作用在稳态或疾病过程中如何被调控。特别是，对重构水凝胶的机械性能（如刚度和黏弹性）进行评估与控制具有重要意义，因为这些特性已被证实可调节多种细胞行为。因此，从生化成分和机械性能两个方面，比较和评估不同脱细胞方法在制备脱细胞ECM（dECM）水凝胶中的效果至关重要。20,23此处展示了两种不同的牛肺脱细胞方法：冻融循环法，主要基于机械性破坏及DNA含量的去除；以及使用常用去污剂Triton-X-100进行细胞核内容物的化学去除。图1）。对于冻融法，必须确保所有组织样本在液氮和水浴之间通过自动化且重复的流程进行充分冷冻和适当解冻24为了实现这一点，可将组织样本分装至多个管中，浸入液氮容器内进行冷冻，随后放入水浴中解...

传统的单层培养条件无法真实再现天然组织的微环境，且缺乏提供具有指导性配体的三维（3D）支架的能力，因而不能支持细胞-基质和细胞-细胞间的相互作用1。细胞外基质（ECM）的组成和机械特性具有高度的组织特异性和时间依赖性，并在病理条件下发生改变。因此，亟需开发可模拟天然ECM的三维组织模型，以实现对这些特性的可调控性、细胞行为的调节以及目标组织功能的实现。来源于天然ECM的生物材料因其能够直接利用组织特异性的ECM，在组织工程领域受到广泛关注1,2,3,4,5。基于ECM的载体已广泛应用于从组织再生到疾病模型构建的多个领域。它们被用作可注射或可植入的生物材料支架4,5，用于药物筛选应用6,7，用于促进细胞生长的材料开发8,9,10，作为生物墨水11,12,13，应用于微流控系统14，以及用于癌症组织模型的构建15,16,17,18,19。
组织和器官的脱细胞化是生成模拟组织特异性细胞外基质（ECM）支架的常用方法。&#160;将脱细胞化的组织和器官重构为水凝胶，可实现细胞在仿生三维组织模型中的包埋20。脱细胞化技术主要致力于去除细胞成分，同时保留ECM的组成。常用的物理方法包括冻融循环，化学方法则包括Triton-X-100处理，这些方法被广泛&#160;应用于组织脱细胞化。此外，通常采用DNase处理以清除残留DNA，从而在细胞包埋后最大限度地降低免疫反应。为优化脱细胞化工艺，关键在于实现细胞的最大程度去除和ECM的最小程度损伤21。 除上述因素外，对重构支架的生化和力学特性（包括黏弹性与刚度）进行表征，对于提升源自天然基质的工程化三维组织模型至关重要&#160;20。
器官特异性细胞外基质在肺组织工程中可模拟肺部微环境，用于研究发育、稳态或病理过程 体外 在生理模拟环境中测试治疗方法20,22,23先前的研究已证明去细胞化&#160;来自多种物种的肺组织，如大鼠、猪和人类，但这些方法尚未被应用于牛等较少使用的物种。更深入地理解脱细胞过程的参数及其对重建的细胞外基质（ECM）支架在生化组成和力学性能方面的影响，将有助于更精确地调控这些特性，并为健康与疾病状态下更可靠的组织模型奠定基础。本研究明确描述了采用两种不同方法——冻融循环和Triton X-100处理——对牛肺组织进行脱细胞化的过程，并对所得脱细胞肺ECM（dECM）水凝胶进行了生化与力学分析。研究结果表明，两种方法均可实现有效的脱细胞并保留ECM配体。值得注意的是，方法的选择显著影响重建水凝胶的刚度和黏弹性。由牛dECM制备的水凝胶在生化特性上与人肺细胞外基质具有显著相似性，并表现出可靠的热诱导凝胶化特性20如先前所述，这两种方法均适用于肺癌细胞、健康支气管上皮细胞以及患者来源的肺类器官的三维培养。20.

<table><tbody><tr><td>无水乙醇</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>阿利新蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HR-2 流变仪</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entellan 封片介质</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>伊红溶液</td><td>Bright-slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>梅氏苏木精染色液</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏膜来源胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>苦味酸</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>天狼星红</td><td>Polysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

细胞外基质（ECM）来源的水凝胶在组织工程中的应用日益广泛，因其能够模拟细胞的天然微环境 体外然而，维持细胞外基质（ECM）的天然生化成分、实现其机械稳定性，并充分理解脱细胞过程对ECM水凝胶机械性能的影响，仍具挑战性。本文描述了一种利用两种不同方案对牛肺组织进行脱细胞处理的流程，包括脱细胞效果的下游表征、重构脱细胞肺ECM水凝胶的制备，以及对其机械性能和细胞相容性的评估。牛肺组织的脱细胞处理采用物理方法（冻融循环）或化学方法（基于去垢剂）进行。通过苏木精-伊红染色验证脱细胞效果及主要ECM成分的保留情况。为评估脱细胞样本中残留的胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量，分别采用天狼星红染色和阿利新蓝染色技术。脱细胞肺ECM水凝胶的机械性能通过振荡流变学进行表征。结果表明，脱细胞牛肺水凝胶可提供可靠的器官型<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">&#160;保留大部分天然细胞外基质成分，为商用细胞外基质产品提供了一种替代方案。此外，这些发现表明，所选用的脱细胞方法显著影响所得水凝胶的凝胶动力学以及硬度和黏弹性特性。

脱细胞化 
通过物理（冻融）和化学（Triton-X-100）方法对牛肺组织进行脱细胞处理，以制备能够重现天然肺微环境的脱细胞外基质（dECM）水凝胶。解剖后，组织块用dH₂O洗涤2含氧类抗生素以去除可能影响脱细胞细胞外基质水凝胶无菌性的病原体。共进行五次液氮交替循环 37 °C 水浴用于冻融法以破坏细胞结构。在第二种脱细胞方法中，将天然肺组织块在1% Triton-X-100溶液中处理3天，并持续搅拌。两种方法中，将肺组织切成小块至关重要，以便溶液扩散至组织核心区域，并实现对细胞核内容物的物理破坏。在两种方法中，脱细胞过程的首个可视化指标是组织的粉红色逐渐转变为灰白色，此变化随循环次数增加而重复出现。此外，彻底去除残留DNA也极为关键，本方案中通过DNase处理实现。进一步地，两种方法脱细胞后，组织均在dH₂O中充分洗涤3天。2O中添加抗生素以维持组织的无菌状态。另一个需要注意的问题是，在将脱细胞细胞外基质（dECM）消化液中和并缓冲至生理条件的过程中，所有溶液均经过滤除菌，以确保无菌，并置于冰上以防止过早形成凝胶。肺dECM水凝胶的形成最终通过热诱导...

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同脱细胞方法，并对其各自的表征进行了全面阐述。

细胞外基质（ECM）来源的水凝胶在组织工程中的应用日益广泛，因其能够模拟细胞的天然微环境……

我们的目标是开发一种器官型肺组织模型。为此，我们优化了牛肺组织的脱细胞化过程以及肺细胞外基质水凝胶的重建。在本研究中，我们旨在了解不同脱细胞化方法对重建肺水凝胶生化特性和力学特性的影响。脱细胞化方案面临的主要挑战之一是实现重建水凝胶的机械稳定性，这需要深入了解脱细胞化对机械性能的影响。这些性能（如刚度和黏弹性）对细胞行为具有关键作用。我们已建立了一套有效的牛肺脱细胞化方法，可获得可重复的肺源性水凝胶，其特性与人肺细胞外基质表现出显著的相似性。因此，利用天然肺组织脱细胞外基质（dECM）水凝胶在肺部疾病建模方面具有巨大潜力。我们构建了用于模拟稳态和疾病状态的组织模型，特别关注细胞与基质之间的相互作用。因此，我们致力于探究器官特异性细胞外基质在成分独特性及力学特性等方面对细胞行为的影响。本研究目前的重点是构建仿生的、患者特异性的肿瘤类器官模型。首先，将冻存于零下80摄氏度的牛肺组织取出，在室温下使其解冻。使用无菌手术刀和剪刀解剖组织，分离并去除气管及软骨性气道。然后将组织切成小块。用含有2%青霉素和链霉素的超纯水洗涤组织三次。将切碎的组织样本浸入2%碘溶液中一分钟。然后用无菌蒸馏水连续洗涤两次。将组织块转移至50毫升离心管中，至15毫升刻度线处。用蒸馏水加满离心管，置于液氮中冷冻两分钟。然后立即将离心管转移至含有37摄氏度水的烧杯中，孵育10分钟。经过五次冻融循环后，在37摄氏度下将样品与30毫升DNA溶液持续搅拌孵育1小时。将湿润的脱细胞细胞外基质样品在80摄氏度下冷冻24小时。将冷冻样品转移至冷冻干燥机中，在真空条件下以干燥模式运行三至四天，直至完全干燥。冻干后，在含有干冰的研磨装置中将样品研磨成细粉。用1% Triton X-100在4摄氏度下轻柔旋转处理肺组织三天，每24小时更换一次溶液。将样品在DNA溶液中37摄氏度下孵育1小时，并持续搅拌。用蒸馏水在持续滚动条件下清洗组织三天，每24小时更换一次水。最后一次清洗后，按先前所示方法进行冻干和低温研磨。在室温下，将15毫克/毫升的脱细胞胞外基质粉末样品加入到1毫克/毫升的胃蛋白酶溶液中，持续搅拌消化48小时。保持溶液pH为2，以确保有效消化。将组织消化液在5000g条件下离心10分钟，弃去上清液。打开发现型 HR-2 流变仪以进行振荡流变学测量。将置于冰上的 250 微升预凝胶消化液倒入预冷的下板上，以避免快速凝胶化。降下 20 毫米平行板，直至预凝胶溶液在两板之间形成间隙宽度为 1 毫米的圆盘状液层。将应变设为0.1%，频率设为0.5赫兹。在将下板加热至37摄氏度并持续30分钟的过程中，实时测量储能模量和损耗模量，以观察膨胀动力学。当储能模量值停止上升并达到平台期后，进行蠕变恢复测试，以评估水凝胶的应力松弛行为。对水凝胶施加1帕斯卡的剪切应力，持续15分钟，并测量应变。然后卸去样品上的应力，记录接下来15分钟内应变值的变化。最后，绘制应变随时间变化的曲线图，以展示应力松弛行为。通过冻融法制备的水凝胶，其平均储能模量和损耗模量显著高于使用Triton X-100法制备的水凝胶。蠕变恢复测试表明，两种方法获得的水凝胶表现出不同的应力响应，表明其具有不同的粘弹性特性。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

我们开发了一种去细胞化肺细胞外基质以及新型仿生生物反应器，可用于生成具有功能的肺组织。通过将细胞接种至基质中并在生物反应器中进行培养，所生成的组织在体内移植后短期内即表现出有效的气体交换功能。...

肺组织工程操作步骤

本视频介绍了一种通过脱细胞化小鼠乳腺脂肪垫来制备细胞外基质水凝胶的技术 离体 辐照 用于 体外 研究。该水凝胶有助于模拟 体内...

去细胞化乳腺脂肪垫：从乳腺脂肪垫中提取细胞外基质水凝胶

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。...

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

这是一种利用肺部细胞外基质制备三维细胞培养支架的方法。将完整的肺组织加工成水凝胶，该水凝胶可支持细胞在三维环境中生长。...

可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。...

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

本方案描述了在保留细胞外基质成分的同时，对人心肌组织进行完全脱细胞处理。对细胞外基质的进一步加工可制备出微颗粒及一种具有细胞保护作用的自组装水凝胶。...

人类心脏组织制备自组装细胞外基质水凝胶的处理方法 体外 和 体内 应用

本文介绍了一种利用肾脏皮质细胞外基质制备水凝胶的方案，以保留天然肾脏细胞外基质（ECM）的结构和生化组成。文中描述了该水凝胶的制备过程及其应用。最后，探讨了利用该水凝胶支持肾脏特异性细胞与组织再生及生物工程构建的前景。...

制备肾皮质细胞外基质来源水凝胶

本方案介绍了一种在体外照射后对小鼠乳腺脂肪垫进行脱细胞处理并进一步形成水凝胶的方法。...

利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。...

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

本文介绍了一种制备脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，可为细胞生长提供优越的微环境，因此可作为理想的细胞支架和生物递送系统。...

脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的制备

本文介绍了一种分离区域性脱细胞肺组织的实验方案。该方案为研究细胞外基质的复杂性以及细胞与基质间的相互作用提供了有力的工具。...

区域特异性脱细胞肺组织的解剖与分离

了解脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征方法，使用牛肺组织优化脱细胞化技术，评估其对水凝胶生化与力学特性的影响，为构建器官型肺组织模型提供可靠方案。

脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

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