通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

本方案展示了一种分析低亲和力蛋白质复合物的全新方法。该方法使研究人员能够检测和表征某些蛋白质相互作用，即使这些相互作用较弱或短暂存在，而此类情况在以往通常极难甚至无法实现。蛋白质相互作用对细胞功能至关重要，但其检测与定量往往具有挑战性。

质谱光度法是定量分析蛋白质复合物形成的强大工具，但在处理稀释样品时存在局限性。我们正通过质量流控技术解决这一问题。本研究旨在填补科学界在溶液中可靠表征蛋白质间弱亲和力相互作用方面的空白。

本方法的优势在于，它能够在溶液中检测弱相互作用的蛋白质，且无需标记或固定。因此，研究人员可以观察其目标蛋白质及其相互作用，而无需担心干扰所研究的体系。实验开始时，先打开质量光度计，并在开始任何测量之前让仪器运行一小时。

打开电源并按下隔离按钮，以启动防震台。随后，开启空气压缩机以激活微流控装置箱。接着，启动数据采集软件，然后启动微流控控制软件。

为加载样品和校准品，将校准品离心管置于微流控盒的4号槽位，将样品离心管置于5号槽位。将清洗液CS2、CS2和CS3分别放置在微流控盒的1号、2号和3号位置。将连接缓冲液管路的盖帽连接至200毫升pH 7.4的缓冲液瓶。

然后将微流控芯片放置在制备板上。将S-flow单元传感器的另一端管路连接到微流控芯片第一通道的样品入口，完成样品管路的连接。将L-flow单元传感器的另一端插入微流控芯片第一通道的缓冲液入口，完成缓冲液管路的连接。

为收集流出液，将一根管路连接至微流控芯片第一个通道的出口，并将另一端放入废液收集瓶或烧杯中。在质谱光度计的物镜上滴加少量显微镜浸油。将微流控芯片放置在质谱光度计的载物台支架上，确保样品入口朝上，并使用载物台夹具固定芯片。

使用数据采集软件调节载物台，将第一通道的观察区域与光度计的物镜对齐。然后关闭质量光度计的盖子，并在数据采集软件中启动“液滴稀释找焦”功能。检查软件界面左下角的白色对焦环。

如果出现间隙，表明浸油中有气泡，应将载物台速度调至最大，并轻轻左右移动载物台以消除气泡。按下记录按钮，开始一分钟的测量，确保测量过程中无杂质存在。取下 pH 7.4 的 200 毫升缓冲液瓶的瓶盖，并将其连接到 pH 5.0 的 200 毫升缓冲液瓶上。

将微流控芯片放置于制备板上，如前所述操作，并使用微流控芯片上的第二个通道而非第一个通道进行流出液的收集。在微流控控制软件中，将M开关调至位置5，设置样品管线流速为每分钟8 µL，并确保样品管线内的压力保持在350 mbar以下。在计算流速时，应将流速的总差值与所需的样品稀释倍数相匹配。

实验结束后，遵循清洗流程以保持管路的清洁。首先，将微流控芯片放置在质量光度计的样品托上，测量质量光度样品。数据采集完成后，打开数据分析软件。

要加载文件进行分析，请点击左上角的加号图标，并选择 mp 校准文件。软件将开始分析该文件，所需时间可能因文件大小和测量次数而异。要进行质量校准，请点击右下角的“创建质量校准”按钮。

将显示一个对话框，其中包含拟合峰的对比值表格。请修改表格中的数值，使其与已知的拟合峰质量值一致，然后点击保存。新的校准文件将显示在数据分析软件左下角的质量校准面板中。

要添加样本文件，请点击左上角的加号图标，然后选择 mp 样本文件。要创建质谱直方图，请转到“分析”选项卡，选择“直方图模式”，并选择“质谱图”选项。根据需要调整 bin 宽度、质谱范围及其他必要参数。

在“图表”选项卡中根据需要进一步自定义图表。自定义完成后，可导出图表或将整个工作区保存为 DMP 文件。通过手动稀释进行的质量光度测定结果得到的质量直方图中，两个最显著的峰分别对应于未结合的 FcRn 单体和免疫球蛋白 G 抗体单体。

此外，在196和251千道尔顿处还明显观察到两个额外的峰，分别对应于免疫球蛋白G与FcRn形成的一比一和一比二化学计量比的复合物。