Name: 使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习利用黑腹果蝇幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络的技术。该方法结合遗传工具，可研究神经系统中微管调控蛋白，为神经发育和疾病机制提供重要见解。

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感谢熊英博士对本文的讨论和意见。本工作得到中国国家自然科学基金（NSFC）对 C. M.（31500839）的资助。

1. 幼虫解剖
注意：解剖用溶液类血淋巴盐水（HL3.1）18 和固定用溶液 4% 多聚甲醛（PFA）19,20 均在室温下使用，因为温度过低会导致微管解聚。
<ol>
	<li>用长柄钝头镊子挑选一只游走期3rd龄幼虫。用HL3.1溶液清洗后，置于体视显微镜下的解剖皿中。 
	注：游走期3rd龄幼虫可通过分枝状的前气门识别，在25 °C条件下约96 h时在培养管内爬行21。</li>
	<li>将幼虫背侧或腹侧朝上放置。通过两条长气管识别背侧，通过腹部的齿带识别腹侧。
	<ol>
		<li>根据所要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这有助于更精确、详细地观察特定目标区域。若需观察神经肌肉接头（NMJ）和肌细胞，应分别切开幼虫的背侧和腹侧区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用大头针固定口钩和尾部。调整大头针使幼虫处于充分伸展状态。向幼虫滴加一滴HL3.1溶液，防止其干燥。 
	注：可使用无Ca2+的HL3.1溶液，以减少解剖过程中肌肉的收缩。</li>
	<li>使用解剖剪在幼虫后端附近做一小段横向切口，但不要切断后端。然后沿腹中线向前端方向剪开。</li>
	<li>在幼虫四角插入四枚昆虫针。重新调整昆虫针位置，使幼虫在各个方向上均被最大程度拉伸。</li>
	<li>用镊子小心去除内脏器官，同时避免损伤肌肉组织。</li>
</ol>
2. 固定
<ol>
	<li>在解剖皿中仍将尸体固定于大头针上的情况下，加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA），浸没尸体 40 分钟。 
	注意：PFA 具有危害性，需采取有效防护措施，避免皮肤直接接触或吸入。</li>
	<li>取下大头针，将样品转移至 2 mL 微量离心管中。用含 0.2% Triton X-100 的 1× 磷酸盐缓冲液（0.2% PBST）冲洗 PFA，加至 2 mL 微量离心管中，在脱色摇床（15 rpm）上孵育 10 分钟。重复洗涤 5 次。</li>
</ol>
3. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>将尸体浸入封闭剂（含5%羊血清的0.2% PBST）中，室温封闭40分钟。</li>
	<li>除去封闭剂，加入200 µL一抗（例如，抗α-微管蛋白抗体，1:1000；抗Futsch抗体，1:50），用0.2% PBST稀释，4 °C孵育过夜。通过单克隆抗α-微管蛋白抗体免疫染色显示肌微管结构。抗Futsch抗体可间接反映神经肌肉接头处微管的形态。</li>
	<li>一抗孵育后，用0.2% PBST清洗幼虫10分钟，重复5次。</li>
	<li>将幼虫与200 µL二抗孵育例如，用含0.2% PBST的溶液稀释的山羊抗小鼠-488抗体（1:1000），室温避光孵育1.5小时。</li>
	<li>接下来，在避光条件下对微管进行染色时，向孵育管中加入核染料（如 TO-PRO(R) 3 碘化物（T3605）），稀释比例为 1:1000，孵育 30 分钟。20,22.</li>
	<li>用 0.2% PBST 洗涤 10 分钟，去除二抗和核染料。在避光条件下重复洗涤 5 次。</li>
</ol>
4. 封片
<ol>
	<li>将幼虫尸体置于载玻片上的0.2% PBST中，并在体视显微镜下进行调整。确保幼虫尸体的内表面朝上，并将所有幼虫尸体按所需位置排列整齐。</li>
	<li>用擦拭纸吸去多余的PBST溶液，然后轻轻滴加一滴抗荧光淬灭封片剂。</li>
	<li>将盖玻片缓慢而轻柔地覆盖在载玻片上，以完全覆盖解剖后的幼虫，避免产生气泡。</li>
	<li>在盖玻片周围涂抹指甲油。将载玻片置于避光环境中，以减少荧光衰减。</li>
</ol>
5. 图像采集
<ol>
	<li>获取图像时，使用激光扫描共聚焦显微镜，选择60倍油镜物镜（数值孔径1.42）或类似规格，并根据实验需求调整激光功率和波长。</li>
	<li>为识别神经肌肉接头（NMJ），在A3节段的肌肉4中采集图像（位置如图1F所示）。选择488 nm激光激发α-微管蛋白或Futsch，543 nm激光激发HRP成像通道。将成像参数调整为帧尺寸800像素 × 800像素、数字放大倍数2.0、NMJ处的成像间隔为0.8 µm（图2）。</li>
	<li>为识别肌肉中的微管结构，在A3-A5节段的肌肉2中采集图像（位置如图1G所示），该区域气管分支较少。选择488 nm激光激发α-微管蛋白，635 nm激光激发T3605成像通道。将成像参数调整为帧尺寸1024像素 × 1024像素、数字放大倍数3.0、肌肉细胞中的成像间隔为0.4 µm（图3）。</li>
</ol>

Viewing Microtubule Networks in Drosophila Neuromuscular Junctions and Muscle Cells

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头和肌细胞进行解剖和免疫染色的实验方案。该操作中有若干关键要点需特别注意。首先，在解剖过程中必须避免对目标肌肉造成损伤。建议在去除内脏器官前先将组织展开并固定，以防止镊子直接接触肌肉。为避免肌肉受损或从幼虫表皮上脱落，在洗涤和孵育过程中应确保摇床转速不超过15 rpm。此外，需精确控制表皮的延展程度，以保证神经肌肉接头形态的成像清晰且完整。建议通过预实验优化抗体浓度、固定条件、封闭时间和孵育时间。固定时间应控制在约40分钟，过短或过长均不利于微管网络的免疫染色效果。
神经元中的微管高度密集，使用传统显微镜难以清晰观察。与神经元相比，果蝇（Drosophila）的肌细胞明显更大，其中A3节段的肌肉2可达40 µm × 150 µm，适合进行高分辨率成像。因此，利用果蝇（Drosophila）肌细胞研究微管网络相关蛋白的调控是一种直观且清晰的方法，在验证神经肌肉接头（NMJ）表型方面具有重要意义20,<...

微管（MTs）作为细胞骨架的结构组分之一，在多种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞分裂、细胞生长与运动、细胞内运输以及细胞形态的维持。微管的动态行为和功能受到多种蛋白质相互作用的调控，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和 Kinesin1,2,3,4,5。
在神经元中，微管对于轴突和树突的发育与维持至关重要。微管的异常会导致神经元功能障碍甚至死亡。例如，在阿尔茨海默病患者的大脑中，Tau蛋白的过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，从而引起神经功能紊乱6。因此，研究微管网络将有助于理解神经发育过程以及神经系统疾病的发病机制。
神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元轴突末梢与肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构与功能的优良且有力的模型系统7Futsch 是一种蛋白质 果蝇 与哺乳动物中发现的微管结合蛋白MAP1B同源8仅在神经元中表达，并在神经肌肉接头突触小结的发育过程中发挥作用8,9在野生型中，通过抗Futsch免疫染色可观察到沿NMJ突起中心分布的丝状束结构。当该束结构到达NMJ末端时，可形成由微管组成的环状结构，或失去其丝状形态，呈现弥散且点状的外观。10微管环与暂停生长的生长锥相关，表明微管阵列处于稳定状态11因此，我们可以通过Futsch染色间接确定NMJ处稳定微管的发育情况。由于肌细胞体积较大， 果蝇 幼虫可清晰显示微管网络。通过分析微管的密度和形态，可发现影响微管网络稳定性的因素。同时，可将肌细胞微管网络状态与神经肌肉接头（NMJ）的结果进行交叉验证，以获得更全面的结论。
已有多种方案被用于研究微管网络及其动态特性。然而，这些研究大多集中于in vitro（体外）研究12,13,14,15,16。另有部分in vivo（体内）实验采用电子显微镜来检测细胞骨架17。本文所述方法基于荧光标记的抗体或化学染料对蛋白质或DNA的特异性结合，可在in vivo条件下于单个神经元水平上检测神经肌肉接头（NMJ）处的微管网络，并通过肌细胞中的观察结果加以验证。该方案结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中强大的遗传工具，操作简便、稳定且可重复，适用于在in vivo条件下对神经系统中调控微管网络的蛋白质进行多种表型分析和遗传筛选。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 鬼笔环肽</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>增强型抗荧光淬灭封片剂</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠抗体，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>激光共聚焦显微镜 LSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Futsch 抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>22C10</td><td>稀释比例 1:50</td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Wako</td><td>168-20955</td><td>终浓度：4% PB 缓冲液</td></tr><tr><td>不锈钢显微固定针</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>直径 0.1 mm</td></tr><tr><td>体视显微镜 SMZ161</td><td>Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体荧光显微镜 BX41</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red 标记的山羊抗 HRP 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 碘化物</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>转移脱色摇床 TS-8</td><td>Kylin-Bell lab instruments</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>dumont</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调控蛋白的突变与神经发育障碍及神经系统疾病相关，例如微管相关蛋白Tau与神经退行性疾病相关，微管剪切蛋白Spastin和Katanin 60分别导致遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。在神经元中检测微管网络有助于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，由于神经元体积较小，且轴突中的微管束排列密集，使得微管网络的可视化具有挑战性。本研究描述了一种分离幼虫神经肌肉接头和肌细胞的方法，并通过α-tubulin和微管相关蛋白Futsch的免疫染色来可视化微管网络 黑腹果蝇神经肌肉接头使我们能够同时观察到突触前和突触后的微管，且由于肌细胞体积较大， 黑腹果蝇 幼虫能够清晰地显示微管网络。此处，通过突变和过表达 Katanin 60 在 黑腹果蝇,&#160;然后检测神经肌肉接头和肌细胞中的微管网络，我们&#160;准确揭示Katanin 60在神经发育中的调控作用。因此，结合强大的遗传学工具 果蝇&#160;黑腹果蝇该方案极大地促进了针对微管网络调控蛋白在神经系统中作用的遗传筛选和微管动态分析。

我们展示了一步一步可视化神经肌肉接头（NMJs）和肌细胞中微管网络的实验流程。根据示意图（图1A-E）进行解剖后，进行免疫染色，并在激光共聚焦显微镜或立体荧光显微镜下观察和采集图像（图1F,G）。
神经肌肉接头（NMJ）的突触前和突触后微管结构均可使用抗α-微管蛋白抗体进行标记，通过调节激光扫描共聚焦显微镜的层厚，可显示不同切片中微管的形态（图2A-C）。Futsch也常用于神经示踪，以揭示神经元轴突中的微管组织。抗-HRP抗体用于标记神经元膜10,23,24。通过抗-Futsch与抗-HRP抗体的共染色，可检测神经元轴...

本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）强大的遗传工具，该方案可显著促进针对神经系统中微管网络调控蛋白功能的遗传筛选和微管动力学分析。

微管网络是神经系统的基本组成部分。许多微管调控蛋白的突变与……相关

目前，由于α、β微管蛋白异源二聚体在细胞质中含量丰富，微管动力学主要通过EB1等蛋白质中的微管间接观察。在人体中，尚缺乏有效工具直接观察微管蛋白异源二聚体，从而研究微管网络的动力学。我们的实验方案结合了神经肌肉突触和肌细胞中的微管，并利用在果蝇中强大的遗传学工具，为研究人体神经系统中调控微管网络的关键蛋白，提供了广泛的治疗性检测和遗传筛选的可能性。我们的研究聚焦于细胞骨架与神经发育之间的关系，以及其对神经系统疾病的影响。我们希望通过揭示细胞骨架调控蛋白对神经元的影响，阐明神经发育的机制及神经系统疾病的发病机理。首先使用长柄钝头镊子挑选一只游走期的黑腹果蝇三龄幼虫。用模拟昆虫血淋巴的生理盐水清洗幼虫，然后用擦拭纸将其擦干。接着根据需要观察的组织，将幼虫背侧朝上或腹侧朝上置于解剖皿中，并在体视显微镜下选择背侧或腹侧解剖方式。用针固定幼虫的口器、钩子和尾部，以保持其伸展状态。接下来，加入一滴血清模拟生理盐水，以防止幼虫干燥。使用解剖剪，在靠近后端处做一个小的横向切口，但不要完全切断。然后沿腹侧中线向前端方向继续剪开。现在将四枚昆虫针分别插入幼虫的四个角。调整昆虫针的位置，使幼虫尽可能充分伸展。用镊子轻轻去除内脏器官，注意避免损伤肌肉组织。固定幼虫时，将仍附着在解剖皿上的尸体浸入 100 微升 4% 多聚甲醛中。随后取下大头针，将样品转移至含有 0.2% PBST 的 2 毫升微量离心管中。将离心管置于摇床中振荡 10 分钟。在15转/分钟条件下。移除PBST，将经多聚甲醛固定的果蝇幼虫尸体与封闭剂在室温下孵育40分钟。用200微升以0.2% PBST稀释的一抗溶液替换封闭剂。将幼虫在4°C下孵育过夜。第二天，用0.2% PBST清洗幼虫10分钟。随后，从离心管中移除PBST，并加入200 µL稀释的二抗。在避光条件下于室温孵育一个半小时。在避光条件下孵育微管的同时，向孵育管中加入核染料（如 TO-PRO(R)3 碘化物）染色 30 分钟。最后，用 0.2% PBST 洗涤 10 分钟，去除二抗和核染料。首先将标记有抗体的黑腹果蝇幼虫尸体置于载玻片上的0.2% PBST中，并在体视显微镜下调整位置，确保幼虫尸体的内表面朝上。用擦拭纸吸去多余的PBST溶液，然后小心地滴加一滴抗荧光淬灭封片剂。接下来，将盖玻片缓慢轻柔地覆盖在载玻片上已解剖的幼虫样本上，避免产生气泡。用指甲油涂抹盖玻片边缘以固定其位置。将载玻片置于避光处保存，以尽量减少荧光衰减，便于后续成像。使用63倍油镜的激光扫描共聚焦显微镜。然后根据实验需求调整波长和激光功率。用于识别神经肌肉接头并采集第三体节肌肉四的图像。选择488纳米激光以激活α微管蛋白或FUCH，选择546纳米激光以激活HRP成像通道，调整参数以获得1024×1024像素的帧尺寸、1.0的数字放大倍数以及0.8微米的成像间隔。为观察肌肉中的微管结构，应采集肌肉二在体节三至五区段的图像，因其气管分支较少。使用488纳米激光激活α微管蛋白，使用633纳米激光激活T3605成像通道。将成像参数调整为1024×1024像素的帧尺寸、2.0的数字放大倍数以及0.4微米的成像间隔。神经肌肉接头的突触前和突触后微管结构均用抗α-微管蛋白抗体进行标记。FUCH染色反映了突触前神经元中稳定微管的丰度。当在突触前神经元中过表达微管剪切蛋白katanin 60时，抗FUCH信号强度降低。轴突主干的染色强度强于其分支。Katanin 60 的突变导致微管环数量增加。Katanin 60 的过表达则引起终钮内出现较短的微管片段。α微管蛋白染色显示，在细胞核周围存在清晰的微管网络。肌肉细胞的核周微管强度显著增加，并表现出更强的束状结构。在Katanin 60突变体中，过表达导致微管纤维发生断裂。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络

本实验方案演示了如何解剖黑腹果蝇（Drosophila）幼虫，以制备用于神经肌肉接头的免疫组织化学和/或成像分析样本。...

果蝇幼虫神经肌肉接头解剖

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Drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

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果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

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体内成像完整果蝇幼虫的亚细胞分辨率研究

Drosophila melanogaster 的神经肌肉接头（NMJ）是研究正常突触功能以及某些神经系统疾病中突触功能异常的重要模型系统。本文介绍了一种用于解剖 Drosophila 幼虫运动系统的实验方案，以及对 NMJ...

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感觉神经元树突、气管及肌肉中微管的免疫组织化学标记 果蝇 幼虫体壁

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体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

本报告提供了一种用于可视化神经肌肉接头的新样本制备方法 果蝇 幼虫。与传统方法相比，该方法在防止样品卷曲方面更为有效，尤其适用于 果蝇...

优化神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备流程 果蝇 幼虫

学习利用黑腹果蝇幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络的技术。该方法结合遗传工具，可研究神经系统中微管调控蛋白，为神经发育和疾病机制提供重要见解。

使用果蝇幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

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