活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

本研究的目标是利用细胞分选仪在不进行基因修饰的情况下，纯化由人诱导性多能干细胞衍生的肝细胞。我们旨在解决人iP细胞分化后残存的未分化细胞所导致的致瘤性风险问题。当前实验面临的一个挑战是，由于分选过程中的机械应力，细胞存活率较低。

我们正在开发一种新的纯化方法，该方法利用肝细胞独特的代谢特性进行大规模纯化。一种用于肝前体细胞的非细胞分选方法无法获得纯的肝细胞；另一种用于成熟肝细胞的方法由于标志蛋白表达有限，只能处理少量肝细胞。

相比之下，我们的方法能够获得不同成熟阶段的肝细胞，且具有更高的效率。人iP细胞来源的肝细胞极为不成熟，在纯化后表现出更显著的肝细胞标志物表达降低。我们未来的目标是利用类器官技术增强肝细胞的功能调控，并将这些进展应用于推动再生医学和药物发现的发展。首先，用一毫升基底膜基质对六孔板的每个孔进行包被，并在37摄氏度下孵育一小时。

从培养板中移除包被的基质，加入用含有10 µM ROCK抑制剂的AK02N培养基制备的人诱导性多能干细胞。将细胞在37°C和5% CO₂条件下培养三天。启动肝向分化第零天，即培养三天后，用RPMI 1640培养基洗涤细胞一次。

接下来，为启动内胚层分化，在培养板中加入添加了3至6微摩尔CHIR-99021和100纳克/毫升激活素A的RPMI B-27 GlutaMAX培养基。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。第1天，将原有培养基更换为添加了50纳克/毫升激活素A的RPMI B-27 GlutaMAX培养基。

将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养24小时。第二天，为诱导肝祖细胞分化，将现有培养基更换为添加了1%二甲基亚砜的RPMI B-27 GlutaMAX培养基，并继续培养最多五天。第七天，为启动肝细胞成熟，更换为肝细胞成熟培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养20天。

第27天，人诱导性多能干细胞呈现出多边形的细胞形态和圆形的细胞核，具有肝细胞的特征。在启动人诱导性多能干细胞肝向分化后的第27天，用每孔2毫升的PBS洗涤细胞。使用指定组分在ADS缓冲液中配制酶溶液。

每孔加入一毫升溶液至六孔板中。将六孔板置于37摄氏度的旋转摇床上约两小时，以使细胞从板上脱落。在显微镜下确认细胞脱落情况。

然后用移液器吹打细胞悬液，使其分散成单个细胞，并收集到含有肝细胞成熟培养基的50毫升离心管中。在18摄氏度下以200×g离心5分钟。使用吸管吸除上清液。

为了染色细胞中的线粒体，将沉淀重悬于5毫升含有100纳摩尔TMRM的肝细胞成熟培养基中。在37摄氏度避光孵育细胞30分钟。再次离心细胞悬液，并将沉淀重悬于1至5毫升含2% FBS的冷ADS缓冲液中。

细胞计数后，取500,000个细胞分装至1.5毫升离心管中，并标记为无一抗对照。将剩余的细胞悬液在4摄氏度下以200G离心5分钟，弃去上清液。每一百万个细胞加入100微升稀释后的一抗溶液。

将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，冰上孵育50分钟。孵育结束后，离心细胞悬液，并用含2% FBS的冷ADS缓冲液洗涤细胞两次。随后，向每一百万个经一抗染色或未染色的细胞中加入100微升稀释的二抗，冰上孵育30分钟。

再次离心细胞悬液，并用含2% FBS的冷ADS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于ADS缓冲液后，通过带卡扣盖的细胞滤网过滤，然后将试管置于冰上。首先，按照制造商的说明设置荧光激活细胞分选（即FACS）仪器，以进行细胞分选。

将样本管置于流式细胞分选仪上并加载。在 P1 区域圈选 TMRM 高表达且 ALCAM 阴性的细胞群，以分选非肝细胞；随后在 P2 区域圈选 TMRM 高表达且 LCAM 阳性的细胞群，以分选肝细胞。

将分选后的细胞收集到含有肝细胞成熟培养基的15毫升收集管中。分选完成后，从流式细胞分选仪上取下收集管。在18摄氏度下，以200×g离心分选后的细胞悬液5分钟。

吸去上清液，将沉淀重悬于含有10 µM ROCK抑制剂和20 nM环孢素A的2毫升肝细胞成熟培养基中。将细胞接种至经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞上，使用肝细胞成熟培养基置于6孔板中培养。在37°C二氧化碳培养箱中培养5天后，进行免疫染色以检测肝细胞纯度。肝细胞分化第27天的流式细胞术分析显示，TMRM高表达且ALCAM阳性的细胞群体。

图中显示了分选后在小鼠胚胎成纤维细胞上培养的 P1 和 P2 细胞的免疫组织化学染色结果。通过计数白蛋白阳性细胞进行纯度检测，结果显示 P1 中白蛋白阳性细胞占 0%，P2 中约 97% 的细胞为肝细胞样细胞。