Name: 两性多发性硬化症建模:MOG35-55 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解使用MOG 35-55肽诱导C57BL/6J小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的方法，该模型用于研究多发性硬化症的神经炎症机制并评估两性差异。

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本工作得到了意大利教育、大学与研究部（Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR）卓越部门项目（Dipartimenti di Eccellenza）2018-2022年和2023-2027年对Rita Levi Montalcini神经科学系的资助，以及意大利奥尔巴萨诺Cavalieri-Ottolenghi基金会的支持。BB获得了皮埃蒙特大区INFRA-P项目（编号378-35）（2022-2023年）和PRIN 2020项目（编号20203AMKTW）的资助。我们感谢意大利非营利生物医学研究基金会（Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus, FORB）提供的支持。本文出版费用由国际扶轮社2031地区扶青社（Distretto Rotaract 2031）以及特别支持的都灵东北扶青社（Rotaract Club Torino Nord-Est）的慷慨捐助承担。我们感谢Elaine Miller对本文稿的校对工作。

本研究中的动物护理和操作均按照2010年9月22日欧洲联盟理事会指令2010/63/EU的规定进行。nd 2010年9月（2010/63/UE）；本研究中报告的所有操作程序均获得意大利卫生部（407/2018-PR）和都灵大学伦理委员会（项目编号&#176; 360384）。我们建议实验设计应遵循 Kilkenny 等人于 2010 年首次发布的 ARRIVE 指南。20开始之前，请确保已备齐所需材料（参见 材料表）。用于制备MOG的所有玻璃器皿和器具均需灭菌35-55 在高压灭菌器中乳化。实验步骤的概要如下所示： 图1.
1. MOG35-55 乳剂的制备
注意：为制备乳剂，需将 MOG35-55不完全弗氏佐剂（IFA） 结核分枝杆菌 H37Ra 菌株（MT）和生理溶液是必需的（参见 材料表).
注意：热灭活的分枝杆菌（MT）可刺激先天免疫反应。操作时应使用适当的个人防护装备，并在通风橱内将MT置于密闭的精密天平上称量，避免吸入、食入以及与皮肤和眼睛接触。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>成分</td>
			<td>注意事项</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mg/mL MOG35-55 肽&#160;溶液</td>
			<td>将冻干的MOG35-55肽溶于生理溶液中，配制成浓度为2 mg/mL的溶液&#160;</td>
			<td>已稀释的溶液应保存于-80 °C。&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 µg/mL PT溶液&#160;</td>
			<td>将冻干的PT溶于生理溶液中，配制成浓度为5 µg/mL的溶液。  </td>
			<td>已稀释的溶液应保存于-80 °C。&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乳剂</td>
			<td>每只待免疫小鼠所需乳剂的总体积为300 µL，具体组分如下：&#160;</td>
			<td>为避免成分变化或污染，应在免疫当天配制乳剂。&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>每只小鼠200 µg MOG35-55 ，即100 µL的MOG35-55&#160; 2 mg/mL溶液。&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 µL生理溶液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>150 µL IFA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 mg/mL MT，即每只小鼠1.2 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生理溶液</td>
			<td>0.9%氯化钠溶于蒸馏水中。&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫程序中所用溶液的组成。
<ol>
	<li>在玻璃烧杯中配制溶液，先加入液体成分，最后加入MT。 
	注意：每只待免疫小鼠所需的乳剂总体积为300 µL，具体分配如表1所示。乳剂黏稠度较高，在配制和注射过程中可能会有损耗，尤其是在为少量小鼠配制时。建议将需免疫小鼠数量至少按1.5–2倍估算，以计算所需乳剂的最终体积。</li>
	<li>将烧杯置于冰上，使用带有18 G针头的玻璃注射器开始乳化溶液。 
	注意：乳剂也可采用其他方法制备，例如通过三通旋塞连接两个无气泡的玻璃注射器，并反复推动活塞混合溶液21,22。</li>
	<li>乳化时间至少15分钟；通常30分钟的乳化已足够。为检测乳剂质量，可将一滴乳剂滴入盛有水的透明容器中：若液滴保持结构完整不散开，则表明乳剂已制备成功。</li>
	<li>将乳剂直接装入用于免疫的1 mL注射器中，并于+4 °C保存至使用，以维持乳剂的黏稠度，避免发生性状改变或污染。</li>
</ol>
2. 动物选择与免疫
<ol>
	<li>动物选择
	<ol>
		<li>选择8至10周龄、体重约20 g的成年C57BL/6J小鼠，雌雄均可。务必为不同实验组选择年龄和性别相匹配的小鼠，因为疾病易感性可能随年龄和性别而异。 
		注意：小鼠在免疫当天的体重应相近，因为本实验方案已针对特定体重范围（17–25 g）进行了优化。</li>
		<li>将同性别的动物以每笼4-5只（n = 4-5/笼）分组饲养，置于45 cm × 25 cm × 15 cm的聚丙烯小鼠笼中，在22 ℃标准条件下饲养，以避免社会隔离。 &#177; 2 &#176;C，12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为08:00）。提供食物和水 随意. 
		注意：为了进一步限制免疫动物疾病进程的潜在变异性，我们还建议设置数量足够多的实验组。此外也有一些研究8,23 描述免疫时间作为决定EAE结果差异的一个条件。因此，我们建议在所有动物中尽量在同一时间进行免疫，最好在每日明暗循环的光照时段内进行23为减少应激，建议在免疫前对动物进行操作适应，并通过耳缘打孔或耳标等方式标记，以便于每日观察时快速识别。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫接种程序 
	注意：为尽量减少动物应激并优化免疫效果，该操作应由经验丰富的研究人员执行。在开始免疫前，应根据机构动物护理与伦理委员会的指南选择麻醉方法。本实验室采用异氟烷进行短时麻醉。
	<ol>
		<li>麻醉小鼠：使用4%异氟烷进行麻醉诱导，1.5–2%异氟烷维持麻醉。等待麻醉起效后，通过后肢和前肢脚趾夹捏反应评估麻醉深度。为防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩，使用兽医批准的眼用软膏。</li>
		<li>PT 经尾侧静脉注射：用乙醇溶液轻柔擦拭小鼠尾部，起到血管扩张作用以显露静脉。聚焦尾部两条侧静脉之一，使用装有 30 G 针头的 0.5 mL 注射器，注入 500 ng PT（即 100 &#181;L 的 PT 用生理溶液稀释至浓度为 5 &#181;g/mL</li>
		<li>皮下注射 MOG35-55 乳化液：使用带26 G针头的1 mL注射器，将先前制备的乳化液进行三次皮下注射：两次注射于侧腹部前部，一次注射于尾根部。每个注射部位的乳化液体积为100 μL。 &#181;L，总体积为300 &#181;每只小鼠注射 L 的乳剂。 
		&#8203;注意：免疫当天记为免疫后第0天（dpi）；48小时后（即在2 dpi时，需进行第二次静脉注射PT，剂量与前次相同。该注射可在不使用麻醉的情况下通过小鼠固定器完成。此处所述方案旨在免疫过程中对小鼠实施并维持麻醉，以避免动物产生不适或移动，同时降低小鼠与实验人员的潜在风险。因此，本实验不涉及任何手术操作。然而，为优化实验流程，须在操作过程中保持适当的无菌条件，并在操作后密切监测小鼠的健康状况。</li>
		<li>为确认小鼠已从注射中恢复，操作后将其放入清洁的笼具中，等待其恢复足够意识以维持胸卧位。待小鼠完全恢复后，将其放回饲养笼中与其它动物同笼。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EAE 随访
<ol>
	<li>体重与食物摄入量
	<ol>
		<li>使用电子精密天平每日监测动物的体重（BW），因为体重下降是疾病进展的一个指标。 
		注意：根据机构和伦理委员会关于动物护理的指导原则，体重下降不应超过某一特定百分比。通常情况下，若动物体重丢失超过初始体重的20%（即0 dpi时记录的体重），则应实施人道终点并予以安乐死。安乐死方法包括使用吸入性深度不可逆麻醉（例如5%异氟烷）后进行断头术。</li>
		<li>监测食物摄入量（FI）——即动物每日摄食的食物量（g∙day-1∙animal-1），至少每周一次称量特定容器中的食物总量，并将两次连续测量之间所消耗的食物总量除以间隔天数及笼内动物数量，以计算平均摄入量。 
		&#8203;注意：该测量可用于估算平均食物摄入量。由于临床疾病症状的出现和累积（包括肢体瘫痪），当动物无法稳定站立于后肢并触及食物容器或水瓶时，建议将湿润的食物放置于笼底。为尽可能精确地评估随访期间的食物摄入量，我们在将食物润湿前也测量了其干重。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EAE期间动情周期的评估
	<ol>
		<li>至少连续观察两个动情周期，通过阴道细胞学涂片评估动情周期，方法参照McLean等人的描述24。根据阴道涂片样本中三种主要细胞类型——有核上皮细胞、角化鳞状上皮细胞和白细胞——的存在情况，对动情周期各阶段进行分类：
		<ol>
			<li>若涂片中几乎 exclusively 存在成簇的圆形、形态完整的有核上皮细胞，则判定为动情前期（proestrus）。</li>
			<li>若涂片中主要为紧密排列的角化鳞状上皮细胞簇，则判定为动情期（estrus）。</li>
			<li>若涂片中主要为体积小、染色深的白细胞，并伴有少量角化鳞状上皮细胞，则判定为动情后期（metestrus）。</li>
			<li>若涂片中绝大多数为体积小、染色深的白细胞，偶见角化鳞状上皮细胞，并可能出现有核上皮细胞，则判定为动情间期（diestrus）。 
			注意：在评估两性动物疾病表现时，需注意雌性个体因动情周期带来的变异性。我们建议特别关注免疫后第一至第二周（即EAE急性期）的动情周期评估。已有研究表明，免疫程序在此阶段对动情周期造成最显著的干扰25。此外需注意，当动物达到较高临床评分（特别是&gt;3分）时，由于后肢轻瘫及肌张力缺失，进行涂片操作较为困难。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>临床评分
	<ol>
		<li>由一位盲法研究人员每日对动物进行临床评分。根据Racke所述方法7，对每只动物按0至5分的等级进行评分（见表2），以评估疾病进程26。 
		注意：与体重下降类似，根据机构和伦理委员会关于动物护理的指导原则，临床评分升高也需设定人道终点。通常情况下，若动物无法自主进食（此情况通常出现在动物评分达到至少4分时，依据本研究使用的评分标准），则应实施人道终点并予以安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过转棒试验评估运动功能 
	注意：EAE进展的评估通常通过每日临床评分完成，该操作应由经过充分培训的盲法研究人员执行。然而，结合一种更为定量和客观的评估方法可能更有助于全面评价疾病进展。在先前的一项研究中26，采用转棒试验来测量免疫动物的运动能力。根据van den Berg等人的描述27，为获得更定量且精确的临床评估结果，转棒试验对运动功能的评估可作为临床评分的补充。详细操作请参见van den Berg等人的研究27。
	<ol>
		<li>从1 dpi开始至动物处死（即28 dpi）期间，每日让小鼠进行一次转棒试验。每次试验持续300秒，期间转棒速度需从4 rpm线性增加至40 rpm。</li>
		<li>记录动物得分。当小鼠失去平衡从装置上跌落并接触地面时，会触发传感器，系统自动记录跌落时间（秒）。因此，运动表现以“跌落潜伏期（秒）”进行评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>等级</td>
			<td colspan="2">临床体征</td>
			<td colspan="3">描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">健康</td>
			<td colspan="3">无可见临床体征。动物尾部张力和运动正常，行走时不绊倒。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td colspan="2">步态异常</td>
			<td colspan="3">动物在网格上行走时出现绊倒现象。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">尾部无力</td>
			<td colspan="3">当动物被尾根部提起时，尾部下垂（软瘫尾）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td colspan="2">尾部无力和步态异常</td>
			<td colspan="3">动物表现出软瘫尾，并在网格上行走时绊倒。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">共济失调</td>
			<td colspan="3">动物仰卧后难以自行站立。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td colspan="2">共济失调和后肢轻瘫</td>
			<td colspan="3">动物仰卧后无法站立，且一侧后肢张力丧失。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">后肢瘫痪</td>
			<td colspan="3">动物双侧后肢张力完全丧失。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5</td>
			<td colspan="2">后肢瘫痪和/或前肢轻瘫</td>
			<td colspan="3">动物双侧后肢张力完全丧失，前肢张力部分丧失，表现为前肢抓握力量减弱。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">四肢轻瘫</td>
			<td colspan="3">动物四肢张力完全丧失。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5</td>
			<td colspan="2">四肢轻瘫和体温降低</td>
			<td colspan="3">动物四肢张力完全丧失，并出现体温下降（体表发凉）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">濒死或死亡</td>
			<td colspan="3">动物处于濒死状态（对任何刺激均无反应）或已经死亡。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于评估EAE进展的临床评分系统。
4. 脊髓水平实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导的组织病理学征象评估
注意：此处简要报告处死动物并采集脊髓以进行组织病理学分析的操作步骤；如需详细描述，&#160;请参见以下参考文献10,26,28,29。
<ol>
	<li>固定与组织取样 
	注意：详细描述请参见以下参考文献10,26。
	<ol>
		<li>在疾病慢性期的28 dpi处死动物。
		<ol>
			<li>通过深度不可逆麻醉（腹腔注射唑拉西泮和替来他明80 mg/kg / 赛拉嗪10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
			<li>先用生理盐水，再用4%多聚甲醛（PFA）溶液对小鼠进行经心灌注。 
			注意：使用PFA时需格外小心：因其具有毒性，应避免吸入、摄入以及与皮肤和眼睛接触，操作时须佩戴适当的个人防护装备。称量粉末、配制溶液及灌注过程均应在通风橱内进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从脊柱中取出脊髓30。</li>
		<li>将脊髓置于4% PFA溶液中固定24小时。</li>
		<li>用0.01 M磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）进行多次漂洗。</li>
		<li>将脊髓包埋于石蜡块中30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织学操作 
	注意：详细描述请参见Montarolo等人的研究10。
	<ol>
		<li>使用切片机切割厚度为10 µm的脊髓横切面，并将其收集在明胶包被的载玻片上。调整切片方向，使其与小鼠脊髓图谱31中对应的横切面示意图一致。</li>
		<li>对切片进行脱蜡处理32。</li>
		<li>使用苏木精和伊红对切片进行染色32。</li>
		<li>对切片进行脱水处理32。</li>
		<li>用封片剂覆盖切片，并在通风橱内室温下干燥。 
		注意：苏木精-伊红染色可用于检测血管周围炎性浸润（PvIIs）的存在26，其被视为疾病的一个标志28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓切片的定量分析
	<ol>
		<li>使用连接数字相机的光学显微镜（物镜20x）获取染色切片的图像29。</li>
		<li>分析所获取的图像，计算PvIIs的数量，以每mm2内的浸润灶数量表示。 
		注意：图像分析过程中建议使用图像分析软件。本研究中呈现的神经病理学结果基于每只小鼠（n = 8/组）代表性覆盖全脊髓水平的10个完整横截面进行量化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Induction and Evaluation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mouse

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所有作者均声明在本论文的研究、撰写和/或发表方面不存在任何利益冲突。

我们所描述的MOG35-55诱导EAE方案导致C57BL/6J小鼠出现慢性形式的多发性硬化症7,8,13。在这些代表性结果中，我们报告指出，接受免疫程序的两种性别的动物均发展为慢性疾病形式（即发病后无法完全恢复，神经功能缺损持续累积，并在慢性期至少维持1.5的临床评分）。
尽管许多研究报道在此模型中雄性和雌性之间无差异14，但仅有少数研究同时纳入了两种性别。然而，鉴于多发性硬化症（MS）中存在显著的性二型性2，研究两种性别中的疾病结局应具有首要重要性。得益于近期更多同时包含两种性别的研究，已在MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中描述了某些性二型性的存在35。我们主要注意到，在雌性中，MO...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65778">Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis</a>. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65778">Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。其特征包括血管周围炎性细胞浸润、脱髓鞘、轴突丢失和胶质增生1。该病的病因尚不明确，其临床表现、影像学及病理特征提示疾病具有显著的异质性2。
由于病因未明且疾病复杂，目前尚无动物模型能够完全重现人类多发性硬化症（MS）的所有临床和影像学特征3,4。然而，已有多种动物模型被用于研究MS的不同方面3,4。在这些模型中，疾病诱导通常具有高度人为性，且临床症状出现的时间框架在人类与小鼠之间存在差异。例如，在人类中，疾病的病理生理过程在临床症状出现前数年均难以察觉；而在动物模型中，实验者可在诱导MS后数周甚至数天内即观察到症状4。
三种基本的动物模型可产生多发性硬化症（MS）特征性的脱髓鞘表现：病毒诱导型（例如，Theiler小鼠脑脊髓炎病毒）、毒性物质诱导型（例如，铜唑酮、溶血卵磷脂）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的不同变体5。每种模型有助于研究该疾病的某些特定方面，但均无法完全复制MS的所有特征6。因此，根据具体的实验需求和拟解决的科学问题，选择合适的模型至关重要。
通过针对髓鞘来源抗原的免疫程序，可在易感小鼠中诱导EAE，即触发针对中枢神经系统（CNS）组分的自身免疫反应。多种免疫病理学和神经病理学机制相互作用，导致免疫小鼠出现多发性硬化症（MS）的主要病理特征（即炎症、脱髓鞘、轴突丢失和胶质增生）7,8。小鼠通常在免疫后第二周左右开始出现临床症状，表现为从尾部向后肢及前肢发展的上升性麻痹。临床评分（即疾病相关功能缺损累积程度的量化）通常采用5分制进行评估7。
通过使用蛋白质、多肽进行主动免疫，或通过转移致脑炎性T细胞进行被动免疫，可在不同遗传背景的小鼠（例如SJL/J、C57BL/6和非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠）中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）、髓鞘碱性蛋白（MBP）和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）是常用于制备免疫原的自身中枢神经系统蛋白的实例。特别是，用PLP优势表位（PLP139−151）免疫的SJL/J小鼠会发展出复发-缓解型（RR）疾病过程，而用优势表位MOG35-55多肽免疫的C57BL/6J小鼠则表现出慢性EAE1。尽管存在一些局限性，例如对多发性硬化症（MS）进展、B细胞在疾病中的作用、由内向外的机制或脱髓鞘后重新髓鞘化研究方面的信息提供有限，EAE模型仍极大地促进了对自身免疫和神经炎症过程的理解，增进了对MS领域的认识，从而推动了该疾病新型治疗策略的发展4,6。
在本研究中，我们关注一种特定形式的主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），即髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）诱导型9,10,11,12。MOG35-55诱导的EAE模拟了多发性硬化症（MS）的一种慢性形式。小鼠在免疫后经历一个无症状期，通常持续免疫后的第一周；随后疾病通常在免疫后的第二周开始出现；而在免疫后的第三至第四周之间，疾病转为慢性，已无法完全恢复先前累积的神经功能缺损7,8,13。有趣的是，在现有文献的大多数研究中，雄性和雌性小鼠在疾病发病率、发病时间、病程或进展方面均未观察到显著差异14，尽管直接比较雄性和雌性间疾病表现的研究仍相对较少。
相比之下，在人类中，这些参数表现出显著的性二型性2。多发性硬化症（MS）在女性中的发病率高于男性；然而，男性通常会发展出更为严重的疾病形式2。这些证据表明性腺激素具有重要且复杂的作用15；然而，性激素在疾病病理过程中的具体作用及其作用机制仍不明确。此外，动物模型的研究数据支持雌激素和雄激素均以性别特异性的方式对病理过程的不同方面产生积极作用的观点16,17。
一些研究还表明孕酮具有神经保护、促髓鞘形成和抗炎作用18 尽管在多发性硬化症患者中的证据尚不充分18，神经活性类固醇（即 从头合成 由神经系统合成的类固醇（如孕烯醇酮、四氢孕酮和二氢孕酮）也可能影响疾病的病理进程19总体而言，这些数据支持以下观点：由外周和中枢神经系统内产生的性激素在疾病的发生和进展中具有重要且性别特异性的作用。因此，在本研究中，我们强调应对雄性和雌性动物分别收集数据。
从组织病理学角度来看，脊髓的白质是该模型中中枢神经系统损伤的主要部位，其特征为多灶性、融合性的单核细胞炎症浸润区域以及脱髓鞘8。因此，在描述C57BL/6J小鼠中MOG35-55诱导EAE的建模方案时，我们将考虑两种性别的疾病表现，并提供有关脊髓的组织病理学分析。

<table><tbody><tr><td>18 G × 1 &amp;frac12;&amp;ldquo; 用于玻璃注射器的1.2 x 40 mm针头&amp;nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-HYP-18G-112-PIN</td><td></td></tr><tr><td>与光学显微镜连接的数码相机</td><td>尼康 DS-U1 数码相机</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子精密天平</td><td>默克</td><td>Mod. Kern-440-47N，分辨率 0.1 g</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110216</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器移液管 &amp;ldquo;超无菌&amp;rdquo; 10 ml</td><td>Sacco System&amp;nbsp;</td><td>L003465</td><td></td></tr><tr><td>玻璃器皿（例如，用于制备乳剂的烧杯）</td><td>VWR</td><td>213-1170, 213-1172</td><td></td></tr><tr><td>苏木精（Mayer）&amp;rsquo;s)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS32</td><td>使用前过滤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂&amp;rsquo;不完全佐剂（IFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5506</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>威洛娜制药</td><td></td><td>该药物用作吸入性麻醉剂。</td></tr><tr><td>雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室，恩维戈</td><td></td><td>8至10周龄，最佳体重约为20 g。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica HistoCore BIOCUT R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封片剂&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>小鼠转棒实验</td><td>Ugo Basile&amp;nbsp;</td><td>#47600</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;分枝杆菌属 &lt;/em&gt;结核分枝杆菌（MT），H37Ra 菌株&amp;nbsp;</td><td>Difco Laboratories Inc.&amp;nbsp;</td><td>231141</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt;)</td><td>Espikem</td><td>EPK1</td><td>-80°C 保存 &amp;deg;C 在生理盐水中稀释（2 mg/mL）；应在免疫当天配制，以尽可能避免发生变性或污染。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>尼康 Eclipse 90i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C 在磷酸盐缓冲液中稀释至4%。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>百日咳毒素（PT）</td><td>Duotech&amp;nbsp;</td><td>PT.181</td><td>-80°C 保存&amp;deg;C稀释（浓度5 &amp;micro;g/mL）生理溶液中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生理盐水（0.9%氯化钠溶液）</td><td>B. Eurospital</td><td>A 032182038</td><td>4°C 保存 &amp;deg;一旦打开。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J61196.AP</td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>&amp;nbsp;NIS-Element AR 2.10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 0.5 mL 注射器，配 30 G × 5/16 针头&amp;rdquo; （0.30 × 8 mm）固定针头</td><td>&amp;nbsp;Nipro</td><td>SYMS-0.5U100-3008B-EC</td><td></td></tr><tr><td>U-100 1 mL 注射器，带 26G 针头 &amp;frac12;&amp;rdquo; （0.45 × 12.7 mm）针头</td><td>PIC</td><td>20,71,26,03,00,354</td><td></td></tr><tr><td>兽用眼膏</td><td>Lacrilube，Lacrigel Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Rompun</td><td></td><td>这种药物混合物用作注射用麻醉剂和镇静剂。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>唑拉西泮和替来他明</td><td>Zoletil&amp;nbsp; 100</td><td></td><td>该药物用作注射用麻醉剂、镇静剂、肌肉松弛剂和镇痛剂</td></tr></tbody></table>

在两种性别中建模多发性硬化症：mog35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。该病在性别间具有不同的发病率，女性患者多于男性，但疾病转归存在差异，男性通常表现为更严重的疾病形式。此外，MS在临床表现、影像学特征及病理学特征方面具有高度异质性。因此，有必要利用实验性动物模型，以尽可能全面地研究该疾病的多个方面。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是小鼠中最常用的MS模型之一，可模拟从免疫系统激活到中枢神经系统损伤等多种疾病特征。本文介绍了一种使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫诱导雌性和雄性C57BL/6J小鼠产生慢性EAE的实验方案。我们还报告了免疫后28天内（28 dpi）小鼠每日临床评分及运动功能的评估结果。最后，我们展示了在中枢神经系统水平进行的一些基本组织学分析，重点关注脊髓——疾病所致损伤的主要部位。

免疫后EAE的随访 
按以下所述进行评估。
体重与食物摄入 
双因素方差分析（ANOVA）（以性别和时间为自变量）显示，两种性别的EAE动物体重（BW）均下降，尤其在诱导后的第二周内尤为明显（F(1,57) = 4.952，p &lt; 0.001；图2A）。然而，体重的性别二态性始终得以维持（图2A）。就体重百分比变化而言（F(1,57) = 23.935，p &lt; 0.001；图2B），雄性和雌性动物在诱导后第12天至第17天期间均出现显著的体重下降（p &lt; 0.001），与初始体重相比，但总体体重损失从未超过20%（图2B</strong...

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。其特征为多种……

我们的研究聚焦于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，该模型可显著增进对外周免疫介导机制的理解，并用于评估神经炎症及部分脱髓鞘过程。该模型还被广泛用于开发和测试多种治疗药物。由于多发性硬化症的病因未明且具有复杂性，目前尚无任何动物模型能够完全重现人类所表现出的全部临床和影像学特征。因此，研究人员要为特定的实验问题选择最合适的动物模型具有相当大的挑战性。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种广泛应用的模型。然而，由于存在诸多问题，仅有少数研究纳入了两种性别，该模型也仅在部分研究中被考虑用于两性比较。通过本方案，我们旨在使该模型的研究能够同时纳入雌雄两性。具体而言，本方案提出了一种基于两种方法的临床评估，即临床评分评估和转棒实验，从而实现对疾病进程更定量、更客观且更精确的临床评价。尽管该模型不能完全再现多发性硬化症的性别差异，但仍具有潜在优势。将诱导因素与其他可能的危险因素（尤其是环境因素）相结合，有助于理解这些因素的特定作用，并明确其在疾病某些性别二态性特征中的具体角色。首先，在玻璃烧杯中配制髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35至55（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide at 35 to 55），即MOG 35-55溶液。操作时，先将液体成分加入烧杯，随后加入适量的结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）菌株。将盛有溶液的玻璃烧杯放入冰浴中。使用带有18号针头的玻璃注射器开始乳化过程，并持续乳化溶液至少15分钟。为评估乳液的质量，取一滴乳液滴入装有水的透明容器中。如果乳剂保持其结构且完整无损，则视为已制备完成。将乳剂直接转移至指定用于免疫的一毫升注射器中。将装有乳剂的注射器储存于4°C，直至准备使用。通过向小鼠的侧尾静脉进行百日咳毒素（PT）静脉注射，开始免疫程序。操作时，先用乙醇溶液轻轻擦拭已适当麻醉的小鼠尾巴，乙醇作为血管扩张剂可使静脉更清晰可见。然后，选择尾部两条侧静脉中的一条，使用装有30号针头的0.5毫升注射器，注入500纳克的PT。接下来，使用先前制备好的一毫升注射器，对小鼠进行MOG 35-55乳剂的皮下注射。使用带有26号针头的注射器，在小鼠两侧前部 flank 区域皮下分别注射 100 µL，共进行两次注射。然后在尾根部进行一次 0.1 mL 的皮下注射。诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎后，由一位盲法研究人员每日对动物进行临床评分评估。使用0到5的评分标准对每只动物进行评分，以评估疾病进展。为评估运动功能，从小鼠感染后第一天（DPI）开始，每天进行转棒实验，持续至研究所需时间。每次实验持续300秒，在此期间将转棒的转速从每分钟4转线性增加至每分钟40转。当动物失去平衡从转棒仪上跌落时，会落到地面，触发传感器记录时间。记录动物的表现，并将其评分记为跌落潜伏期。在雄性和雌性小鼠中均观察到临床评分（CS）随时间显著升高，从感染后第10天（10 DPI）开始直至实验终点。女性的临床评分（CS）高于男性，但差异无统计学意义。与男性相比，女性还表现出疾病发病更早的趋势。此外，女性的累积临床评分显著高于男性。在雄性和雌性小鼠中均观察到转棒实验表现随时间显著下降。特别是，雄性小鼠在感染后16天（16 DPI）表现最差，而雌性小鼠在17 DPI时表现最差。雄性小鼠的表现优于雌性小鼠，尤其是在疾病的慢性阶段，这可能是由于较低的临床评分（CS）所致。

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两性多发性硬化症建模:MOG35-55 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。...

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

我们介绍一种仅使用常规实验室设备的简单方案，用于大量制备和纯化含有小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的融合蛋白。该蛋白可用于诱导由T细胞和B细胞共同介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。...

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

矢状面运动学步态分析可提供关于运动执行方式的高度精确信息。本文描述了这些技术在识别经受自身免疫介导脱髓鞘小鼠步态缺陷中的应用。这些方法也可用于表征其他具有运动功能障碍的小鼠模型的步态缺陷。...

C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

了解使用MOG 35-55肽诱导C57BL/6J小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的方法，该模型用于研究多发性硬化症的神经炎症机制并评估两性差异。

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG_35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

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