利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

本研究采用乳杆菌科（Lactobacillaceae）物种作为模型，以展示成像流式细胞术在研究微生物自聚集特性方面的有效性。重点在于分析乳杆菌科物种的自聚集行为对饮食中简单碳水化合物的响应。目前测量自聚集最常用的方法包括分光光度法，该方法通过测定微生物悬液的浊度或光密度；以及传统显微镜技术，如明场、相差和荧光显微镜技术。

在讨论高通量成像时，一个主要的实验挑战是单个事件的分割，此处指单个聚集体。成像流式细胞术巧妙地解决了这一挑战，为研究人员提供了研究自发聚集的强大工具。

取一环乳杆菌科菌株的单菌落，接种于5 mL乳杆菌MRS肉汤中，37°C静置培养过夜。将菌液按1:100的比例接种于3 mL含50%补充成分的胰蛋白胨大豆肉汤中进行稀释。

涡旋混匀培养物并进行孵育。转移样品前，将试管颠倒混匀以使细胞充分悬浮于培养基中，然后取200至300微升样品加入1.5毫升微量离心管中。开始流式细胞术分析时，首先将785纳米激光器功率设置为5毫瓦，用于暗场测量。

使用数值孔径为0.9的60倍物镜，然后选择高灵敏度设置并将速度设为低速。为确保校准微珠的稳定性，按下流体控制框中的播放按钮并检查微珠图像，图像应清晰锐利。在工作区框中选择“新建散点图”以生成新的散点图。

然后，选择明场通道中与SSC通道信号强度相对应的区域，并排除样本中同时运行的校准微球。接着，按下加载按钮，将含有乳杆菌科样本的试管放入样品架中。在采集设置框中，输入样本名称并指定数据存储位置。

设置采集事件的数量，通常在 10,000 到 20,000 个事件之间。现在，点击采集框中的 Record 按钮开始采集过程。当达到指定数量的事件后，该过程将自动停止。

按照弹出窗口中的提示，按下返回按钮以卸载试管并将其从支架中取出。对所有样品重复此步骤后，保存模板以保持数据采集的一致性。进行数据分析时，如需将原始文件载入分析软件，请单击“文件”并打开 rif 文件。

在打开的窗口中，选择使用采集分析，然后点击“确定”。接下来，要创建梯度均方根的直方图，请点击“新建直方图”按钮，并选择用于分析的采集样本中的群体。在 X 轴参数下，选择明场通道的梯度均方根（Gradient RMS）。接着，在分析区域中点击“创建线形区域”按钮，设置门控以排除失焦事件。

单击分析区域中的“新建散点图”按钮，创建面积与长宽比的散点图。在“新建散点图”窗口中选择聚焦的群体，然后选择明场通道的面积作为 X 轴特征，选择长宽比作为 Y 轴特征。

根据聚集体事件群体的面积值，使用“创建矩形”按钮在散点图上绘制一个门控区域。类似地，为单细胞及小聚集体群体绘制另一个门控区域。通过点击“文件”选项卡并选择“另存为模板”，将您的数据分析保存为模板。

然后在相同模板下打开下一个样本文件以创建数据分析文件。为测量聚集体大小分布，首先绘制聚集体事件群体面积的直方图。通过点击文件选项卡并选择“另存为模板”选项来保存数据分析结果。

保存后，在同一模板下打开下一个样本文件以进行数据分析。在LGG和L.paracasei中观察到单细胞、小聚集体、大聚集体和链状结构。但无法区分链状结构与较大的聚集体。

不同乳酸菌菌株在可发酵或不可发酵糖存在下，其聚集特性表现出显著差异。