Name: Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株和中和抗体快速定量中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 了解Ha-CoV-2假病毒技术在SARS-CoV-2变异株感染性定量及中和抗体敏感性评估中的应用。该方法利用HEK293T细胞和荧光素酶检测，为病毒学研究提供安全高效的实验平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

这项工作得到了乔治·梅森大学内部研究基金的支持。

1. 病毒与病毒颗粒组装
<ol>
	<li>载体：商业购买用于SARS-CoV-2 M、E或N以及SARS-CoV-2 S（野生型，Wt）、Delta（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529）的表达载体。 
	注：表达载体的蛋白序列见补充文件1。这些表达载体的供应商也可在材料表中找到。</li>
	<li>细胞与细胞培养：在含10%热灭活胎牛血清（FBS）、50单位/mL青霉素和50 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞。 
	&#8203;注：所有细胞培养操作均需在层流生物安全柜中进行。聚乙烯亚胺（PEI）转染通常需要5-6小时孵育。开始时间需提前仔细规划。</li>
	<li>病毒组装及基于PEI的共转染：通过共转染HEK293T细胞组装Ha-CoV-2颗粒。在共转染前一天，将细胞以每皿4-5 × 106个细胞的密度接种于含10 mL完全DMEM培养基的10 cm细胞培养培养皿中。本研究中，使用三个培养皿分别接种用于组装Ha-CoV-2野生型、Delta和Omicron的细胞。</li>
	<li>将培养皿在37 °C、CO2培养箱中过夜孵育。次日早晨检查培养皿，确保细胞融合度达到80%。弃去完全培养基，更换为9 mL无血清DMEM培养基。</li>
	<li>对每个培养皿，配制共转染混合物，包含每种SARS-CoV-2结构蛋白表达载体（N、E、M）各2.5 µg，pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ（HaCoV2基因组）10 µg，S蛋白表达载体2.5 µg（Delta或Omicron S变异体），以及45 µL基于PEI的转染试剂。将共转染混合物于室温孵育13分钟以形成复合物（孵育时间不得超过30分钟）。</li>
	<li>孵育后，将共转染混合物缓慢逐滴加入各培养皿中。将培养皿置于37 °C、CO2培养箱中孵育6小时。6小时后，弃去无血清DMEM，更换为完全DMEM培养基。在共转染后48-60小时收集病毒。</li>
	<li>病毒收集与保存：在共转染后48小时收集病毒颗粒。通过反复吹打单层细胞表面使细胞脱落，收集各培养皿中的细胞，转移至15 mL离心管中，以400 × g离心5分钟。收集上清液，并通过0.22 µm滤器过滤。将Ha-CoV-2假病毒储存于-80 °C。</li>
</ol>
2. 病毒感染性检测
<ol>
	<li>细胞与细胞培养：在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、50单位/毫升青霉素和50 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。</li>
	<li>接种HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞：在进行病毒感染性检测的前一天，将HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞以每孔50 µL完全DMEM培养基接种于96孔板中。每块96孔板的每个孔接种2.5 × 104个细胞，每块板共需2.5 × 106个细胞。将96孔板置于37 °C的CO2培养箱中过夜培养。</li>
	<li>感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞：使用Ha-CoV-2变异株颗粒感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。在感染当天上午，从预先接种的96孔板中移除每孔50 µL的DMEM培养基，并替换为50 µL的Ha-CoV-2野生型、Delta或Omicron病毒颗粒，在37 °C下继续孵育18小时。 
	注意：本实验流程可在此处暂停，直至感染完成18小时孵育，随后即可通过荧光素酶检测分析该96孔板。感染是否成功取决于感染细胞中表达的荧光素酶报告基因所产生的信号强度，因此信号越强，表明Ha-CoV-2变异株的感染效率越高。</li>
	<li>荧光素酶检测：孵育18小时后，直接向每孔加入7.5 µL细胞裂解液，并通过轨道振荡混合2分钟。在室温下用裂解液裂解细胞至少5分钟。</li>
	<li>配制萤火虫荧光素酶检测溶液：将D-荧光素溶液与萤火虫荧光素酶检测溶液按1:50的比例混合。对于整块96孔板，将3 mL荧光素酶底物溶液（由60 µL D-荧光素溶液与2940 µL萤火虫荧光素酶缓冲液混合而成）进行配制。</li>
	<li>向每孔细胞裂解液中加入25 μL萤火虫荧光素酶检测溶液，并通过轨道振荡混合1分钟。使用商用荧光素酶微孔板检测仪分析荧光素酶活性。</li>
</ol>
3. 哈冠状病毒2型（Ha-CoV-2）的RNA提取及定量逆转录PCR（RT-qPCR）
<ol>
	<li>病毒RNA提取：使用商用病毒RNA提取试剂盒，按照制造商说明书从Ha-CoV-2野生型以及Ha-CoV-2 Delta和Omicron变异株颗粒中提取病毒RNA。提取的病毒RNA可储存于-80 °C，或立即用于RT-qPCR检测。</li>
	<li>RT-qPCR：使用一步法预混液对病毒RNA进行RT-qPCR扩增，并在商用PCR仪上运行反应。请注意，扩增靶标为Ha-CoV-2的基因组RNA。使用Ha-CoV-2载体DNA作为标准品构建标准曲线，以计算各变异株的RNA拷贝数。</li>
</ol>
4. 中和抗体检测
<ol>
	<li>接种 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞：在实验前一天，将 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞以每孔 50 µL 完全 DMEM 培养基接种于 96 孔板中。HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞为商业购买获得。</li>
	<li>细胞计数时，从含有 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞的 T75 培养瓶中取出 20 µL 细胞悬液，与 20 µL 台盼蓝溶液混合。取 20 µL 该混合液加入细胞计数板，计算每毫升的细胞数量。为进行感染实验，每孔接种 2.5 × 104 个细胞，共需 2.5&#160; × 106 个细胞。将 96 孔板置于 37 °C、CO2 培养箱中过夜培养。</li>
	<li>中和抗体实验：在无菌聚丙烯 96 孔板中配制标准 27BV 中和抗体与 Ha-CoV-2 病毒的混合液。向孔中加入 8 µL 的 27BV（45 mg/mL），然后用 6 µL 无血清 DMEM 对抗体进行系列稀释。 
	注：在不同孔之间转移液体时务必更换移液枪头，并确保抗体与无血清培养基充分混匀，以获得准确结果。</li>
	<li>向系列稀释的抗体中加入 54 µL 的 Ha-CoV-2 病毒颗粒，混匀病毒与抗体。将 Ha-CoV-2 颗粒与系列稀释的 27BV 在 37 °C、5% CO2 条件下预孵育 1 小时。孵育结束后，取 50 µL 抗体与病毒混合液加入前一天接种了 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞（每孔 2.5 × 104 个细胞）的 96 孔板中。</li>
	<li>设置对照组时，至少保留三个仅含 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞的孔，并向这些孔中加入 50 µL 完全培养基，作为未感染对照，用于确定荧光素酶检测读数的背景信号。 
	&#8203;注：本实验流程可在此暂停，待感染后在 37 °C 继续孵育 18 小时，之后即可通过荧光素酶检测进行分析。</li>
	<li>荧光素酶检测：孵育 18 小时后，直接向每孔加入 7.5 µL 裂解缓冲液，并以轨道振荡方式混匀 2 分钟。在室温下用裂解缓冲液裂解细胞至少 5 分钟。</li>
	<li>通过将 D-荧光素溶液与荧光素酶检测试剂按 1:50 的比例混合，配制萤火虫荧光素酶检测试剂。对于整块 96 孔板，将 3 mL 荧光素酶底物溶液（含 60 µL D-荧光素溶液）与 2940 µL 萤火虫荧光素酶缓冲液混合。</li>
	<li>向细胞裂解物中加入 25 μL 萤火虫荧光素酶检测试剂，以轨道振荡方式混匀 1 分钟。使用商用荧光素酶微孔板检测仪分析荧光素酶活性。</li>
</ol>
5. 定量与统计分析
<ol>
	<li>数据收集：按照所示方法进行感染实验和荧光素酶检测，每组设三个重复（图1）。通过荧光素酶检测试剂读取荧光素酶表达水平。均值为三次荧光素酶检测读数的平均值。从该均值中减去未感染孔的背景信号读数。标准差（SD）由荧光素酶检测读数的平均值计算得出。</li>
	<li>数据分析：绘制抗体中和活性曲线，并使用商业绘图软件计算 ID50（50% 抑制剂量）值。ID50 值定义为在荧光素酶检测读数基础上，使 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞感染率降低 50% 时对应的抗体抑制性稀释度。</li>
</ol>

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Weekly+epidemiological+update+on+COVID-19%22">Weekly epidemiological update on COVID-19</a>. 143, 1(2023).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+emerging+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2%3A+Impacts%2C+challenges+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies.</a> Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+Disease+2019-COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coronavirus Disease 2019-COVID-19.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).</li>
<li>El-Shabasy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+waves+changes%2C+new+variant+strains%2C+and+vaccination+effect+against+COVID-19+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Interim+laboratory+biosafety+guidelines+for+handling+and+processing+specimens+associated+with+coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29%22">Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19)</a>. , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).</li>
<li>Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+biosafety+measures+involving+SARS-CoV-2+and+the+classification+as+a+Risk+Group+3+biological+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent.</a> Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).</li>
<li>Vanderheiden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Rapid+Focus+Reduction+Neutralization+Test+Assay+for+Measuring+SARS-CoV-2+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116(2020).</li>
<li>Dieterle, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Replication-Competent+Vesicular+Stomatitis+Virus+for+Studies+of+SARS-CoV-2+Spike-Mediated+Cell+Entry+and+Its+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition.</a> Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+a+pseudovirus+neutralization+assay+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.</a> Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+effectiveness+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+system+as+determined+by+neutralizing+efficiency+and+entry+inhibition+test+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosafety+and+Health%22%5BJournal%5D)">Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro.</a> Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).</li>
<li>Hetrick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+hybrid+alphavirus-SARS-CoV-2+pseudovirion+for+rapid+quantification+of+neutralization+antibodies+and+antiviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+methods%22%5BJournal%5D)">Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs.</a> Cell reports methods. 2 (3), 100181(2022).</li>
<li>Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).</li>
<li>Jackson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA+Vaccine+against+SARS-CoV-2+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).</li>
<li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li>
<li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+evolution+of+coronavirus+spike+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins.</a> Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).</li>
<li>Donofrio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+SARS-CoV-2+Pseudovirus+Neutralization+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay.</a> Vaccines. 9 (4), 389(2021).</li>
<li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+and+Reagents+for+Pseudotyping+Lentiviral+Particles+with+SARS-CoV-2+Spike+Protein+for+Neutralization+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays.</a> Viruses. 12 (5), 513(2020).</li>
<li>Zettl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+SARS-CoV-2-Neutralizing+Antibodies+Using+Propagation-Defective+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes.</a> Vaccines. 8 (3), 386(2020).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963(2018).</li>
<li>Lundin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+firefly+luciferase+reaction+for+analytical+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).</li>
<li>Deshpande, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients.</a> The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+methods+for+detecting+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Analytical Biochemistry. 673, 115199(2023).</li>
<li>Manischewitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+vaccinia-neutralization+assay+based+on+reporter-gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).</li>
<li>Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omicron+Variant+%28B.1.1.529%29%3A+Infectivity%2C+Vaccine+Breakthrough%2C+and+Antibody+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).</li>
<li>Saxena, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+SARS-CoV-2+Omicron+%28B.1.1.529%29+variant+of+concern+and+its+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective.</a> Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).</li>
</ol>

乔治梅森大学已就该项专利申请并授权给Virongy Biosciences公司用于产品开发。Y.W.是Virongy Biosciences公司的创始人及顾问委员会成员。B. H 目前担任Virongy Biosciences公司的首席执行官兼首席科学官。作者无其他利益冲突。

Ha-CoV-2 平台提供了一种快速、稳健且简便的工作流程，用于定量病毒变异株和中和抗体。然而，有几个关键步骤需要特别注意。Ha-CoV-2 假病毒的制备应使用高活力的 HEK293T 细胞进行。共转染效率可在转染后 24 小时通过 Ha-CoV-2 基因组中的 GFP 报告基因进行监测。Ha-CoV-2 基因组可携带两个报告基因（GFP 和 Luc），GFP 可在共转染期间以及 Ha-CoV-2 感染靶细胞后表达12。感染产生的 GFP+ 细胞通常所占比例较低（1% 至 5%），但每个被感染细胞均表达强烈的 GFP 信号（图 3）。相较于 Luc 报告基因（其可定量所有被感染细胞群体），该较低的 GFP 阳性比例可能限制 GFP 作为抗体中和效应定量检测的稳健性。
进行中和实验时，必须在不同孔之间更换移液器吸头，并确保抗体与无血清培养基充分混匀，以获得准确的结果。此外，在进行荧光素酶检测实验时，细胞必须完全裂解至少3分钟，以确保细胞充分裂解并释放荧光素酶，从而保证检测结果的准确性。另外，一旦将萤火虫荧光素酶检测试剂加入光学白壁96孔板后，必须在10分钟内完成检测，因为初始光信号较强，但随着ATP逐渐耗尽，发光强度会随时间下降21。
随着更多SARS-CoV-2变异株持续演化，迫切需要Ha-CoV-2等平台快速筛查变异株的感染性及其对疫苗诱导中和抗体的敏感性。与现有的基于假病毒的中和试验相比，Ha-CoV-2平台具有更快的检测速度、更高的信噪比以及更简便的操作流程8,9,10,11Ha-CoV-2 平台的另一优势在于其可在 BSL-2 实验室中使用，无需依赖 BSL-3 设施，从而使 SARS-CoV-2 相关研究可在常规科研与临床实验室中开展。此外，与其他系统相比，Ha-CoV-2 平台能够快速获得结果。例如，针对具有感染性的 SARS-CoV-2 病毒的中和抗体研究通常采用蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test, PRINT）22尽管PRINT能够产生可靠的结果，但噬菌斑形成单位（PFUs）的手动计数过程耗时较长，且需要3-5天才能获得结果23,24其他假型系统，例如慢病毒假病毒，需要24-72小时才能产生&#160; 可检测的报告信号12相比之下，Ha-CoV-2中和实验可在18小时内获得结果。Ha-CoV-2为快速筛选和定量病毒变异株及中和抗体提供了便捷工具，可用于疫情监测。
监测SARS-CoV-2的感染性至关重要，因为不断有新的关注变异株（VOCs）出现。Ha-CoV-2的优势在于能够快速确定VOCs的感染性。以往的研究已采用基于人工智能（AI）的建模方法，对奥密克戎亚变异株及其他SARS-CoV-2变异株（如德尔塔变异株）的感染性进行定量分析25。这些研究表明，奥密克戎变异株比原始病毒更具传染性，且更易逃逸中和抗体的作用25。在这些研究中，使用Ha-CoV-2也观察到了类似的表型。此外，在抗体中和实验中，27BV中和奥密克戎变异株的效果比中和武汉株和德尔塔株低十倍。这些结果与已报道的奥密克戎变异株更高传播性的特征一致，该变异株在其受体结合域（RBD）上至少存在15个突变，可能增强了病毒与ACE2受体的结合亲和力，从而导致更高的传播能力和更强的免疫逃逸能力26。

截至2023年5月，全球已有超过7.66亿例COVID-19病例1。尽管全球已开展广泛的疫苗接种，SARS-CoV-2仍持续传播并感染人群，主要原因在于新变异株（如Delta（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529））的出现，这些变异株引发了新一轮感染潮2,3,4。鉴于SARS-CoV-2持续进化，开发能够准确测定新兴变异株感染能力以及疫苗诱导的中和抗体对这些变异株效力的快速检测方法显得尤为重要。此类检测对于疫情监测以及评估疫苗及其针对特定变异株的加强针的有效性至关重要。
由于SARS-CoV-2具有高度传染性，美国疾病控制与预防中心（CDC）要求对SARS-CoV-2及其变异株的研究必须在生物安全等级（BSL）3级设施中进行5,6这一BSL-3要求限制了在常规科研和临床实验室中使用活病毒来定量病毒变异株的感染性及其中和抗体。此外，传统的SARS-CoV-2中和实验（如基于噬斑形成或细胞病变效应的、依赖具有复制能力的活病毒的实验）耗时较长，且需要长时间的孵育过程。7已开发出多种携带刺突（S）蛋白的SARS-CoV-2假病毒，用于量化中和抗体的效果8,9,10,11,12在SARS-CoV-2中，S蛋白是介导病毒进入的主要蛋白13，是SARS-CoV-2疫苗中使用的主要抗原9,10,14,15,16假病毒颗粒（如水疱性口炎病毒（VSV-G）或慢病毒假病毒颗粒）已被用于中和抗体的定量检测17,18,19然而，基于慢病毒的假病毒通常需要 2 至 3 天的感染时间才能定量检测报告信号。基于 VSV 的假病毒系统常含有残留的 VSV 活病毒，可能导致较高的假阳性率，通常需要 24 小时的感染时间20.
Hetrick 等人最近开发了一种新型 SARS-CoV-2 假病毒系统，即杂合甲病毒-SARS-CoV-2 假病毒（Ha-CoV-2）12。Ha-CoV-2 为在常规 BSL-2 实验室中快速定量病毒感染性及病毒对中和抗体的敏感性提供了一种新工具。从结构上看，Ha-CoV-2 与 SARS-CoV-2 病毒颗粒相似，包含 SARS-CoV-2 的结构蛋白，即刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和包膜蛋白（E），不含其他病毒的结构蛋白。此外，Ha-CoV-2 颗粒携带一种来自甲病毒的快速表达 RNA 基因组，可在细胞中实现报告基因的快速表达。研究表明，Ha-CoV-2 可用于快速测定疫苗接种者和康复者血清中抗体的中和活性12。如 Hetrick 等人所示，在时间进程实验中，与基于慢病毒的 SARS-CoV-2 假病毒相比，Ha-CoV-2 在感染后 2–4 小时即可表达 Luc 报告基因，而慢病毒假病毒则在 24 小时后才表达 Luc12。此外，通过使用一种&#160;标准单克隆中和抗体 27BV（见补充图 1）12，进一步验证了 Ha-CoV-2 变体在定量中和抗体方面的潜在应用。本研究详细描述了利用 Ha-CoV-2 平台对 SARS-CoV-2 变体的感染性进行快速定量的方法，并以 Delta（B.1.617.2）和 Omicron（B.1.1.529）变体为例进行了说明。此外，通过使用标准单克隆中和抗体 27BV，进一步验证了 Ha-CoV-2 变体在定量中和抗体方面的潜在应用12。

<table><tbody><tr><td>27VB1 20 &amp;micro;g SARS-CoV-2 标准中和抗体</td><td>Virongy Biosciences</td><td>27VBI-01</td><td></td></tr><tr><td>500 mL - 美国来源FBS</td><td>神经组学</td><td>FBS001</td><td></td></tr><tr><td>AB混合板：Olympus 96孔PCR板，无裙边超薄壁，自然色，25板/单位&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>货号 24-300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>2043-30-1158</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（1×）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>GenClone 25-209，TC 处理培养瓶，250 ml，通气生长面积：75.0 cm²，每袖5个，每单位100个培养瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>GlowMax Discover 微孔板读板仪</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>GM3000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 E 载体&amp;nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_E</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 M 载体&amp;nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_M</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 N 载体&amp;nbsp;</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_N</td><td></td></tr><tr><td>Ha-CoV-2 WT S 载体</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2_WT S</td><td></td></tr><tr><td>Hek293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Illumination 萤光素酶增强检测试剂盒 1000 次检测</td><td>Gold Bio&amp;nbsp;</td><td>I-930-1000</td><td></td></tr><tr><td>感染板：96孔组织培养板，Greiner Bio-One（带盖， &amp;mu;透明白色扁圆形，烟囱状&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>货号 82050-758&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&amp;Psi; （Ha-CoV-2 基因组）载体&amp;nbsp;</td><td>内部</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基于PEI的转染试剂</td><td>Virongy Biosciences</td><td>Transfectin</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Pro 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>A43163</td><td></td></tr><tr><td>即用型（HEK293T）（ACE2/TMPRSS2）细胞</td><td>Virongy Biosciences</td><td>即用型细胞</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S&amp;nbsp; Omicron（B.1.1.529）载体</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2-B.1.1.529</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&amp;nbsp;载体</td><td>Virongy Biosciences</td><td>pCoV2- B.1.617.2</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，PES，0.22&amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4444432</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

ha-cov-2假病毒在sars-cov-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行凸显了快速检测方法的重要性，以准确评估新出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）变异株的感染能力，以及疫苗诱导的中和抗体对病毒变异株的有效性。此类检测对于大流行监测以及验证疫苗和针对特定变异株的加强针至关重要。本文展示了新型杂合阿尔法病毒-SARS-CoV-2假病毒（Ha-CoV-2）的应用，可用于快速定量SARS-CoV-2变异株的感染性及疫苗诱导的针对病毒变异株的中和抗体水平. Ha-CoV-2 是一种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）类病毒颗粒，由病毒结构蛋白（S、M、N 和 E）以及源自甲病毒——塞姆利基森林病毒（Semliki Forest Virus, SFV）的快速表达RNA基因组组成。Ha-CoV-2 还包含绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶报告基因，可用于快速定量病毒感染性。例如，本研究定量了 SARS-CoV-2 Delta（B.1.617.2）和 Omicron（B.1.1.529）变异株的感染性，并检测了它们对一种中和抗体（27VB）的敏感性。这些实例表明，Ha-CoV-2 作为一种高效平台，在快速定量 SARS-CoV-2 变异株及其对中和抗体的易感性方面具有巨大潜力。

利用五种不同的DNA载体在HEK293T细胞中组装Ha-CoV-2病毒颗粒，这些载体分别表达Ha-CoV-2的RNA基因组以及SARS-CoV-2的结构蛋白（M、N、E和S）。S蛋白载体根据S蛋白变异株的不同而有所差异。以原始Ha-CoV-2武汉株（野生型，Wt）的S蛋白作为阳性对照，并将其分别与另外两种变异株——Delta（B.1.617.2）或Omicron（B.1.1.529）——的S蛋白共同组装。所有变异株均使用相同的M、N、E蛋白。在共转染后48小时收集Ha-CoV-2（Wt）及变异株颗粒，并用于感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。感染后18小时通过检测荧光素酶的表达水平来测定感染能力。在此系统中，荧光素酶表达水平越高，表明Ha-CoV-2对细胞的感染能力越强。每种变异株的荧光素酶信号均通过RT-qPCR检测的基因组RNA拷贝数进行归一化处理。如图1所示，Ha-CoV-2 Omicron变异株产生的信号比原始Ha-CoV-2（Wt）高出4至10倍，提示其感染能力更强。
此外，还对27BV中和HaCoV-2（野生型）、Delta和Omicron变异株的能力进行了定量分析。27BV是一种针对SARS-CoV-2 S1蛋白受体结合域（RBD）开发的兔单克隆抗体。在中和实验中，将27BV在96孔板中进行系列稀释，与Ha-CoV-2预孵育后，加入HEK293T（ACE2/TMPRSS2）靶细胞。结果显示，27BV对所有测试的变异株均具有中和活性（图2）。有趣的是，27BV对Omicron变异株的ID50效价比对Ha-CoV-2（WT）和Ha-CoV-2（Delta）的ID50低约10倍；图2）。这些结果表明，Ha-CoV-2平台可作为快速定量新兴变异株疫苗诱导中和抗体的方法。
<img alt="使用 HEK293T 细胞进行 SARS-CoV-2 共转染的方法；荧光素酶信号结果的示意图与柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1．Ha-CoV-2 变异株的组装与定量。（A）Ha-CoV-2 及其变异株颗粒的组装示意图。表达 Ha-CoV-2 报告基因组和结构蛋白（M、S、N 和 E）的载体在 HEK293T 细胞中进行共转染。转染后 48 小时收集病毒颗粒（病毒颗粒与 HEK293T 细胞的图像由 Biorender.com 制作）。（B）Ha-CoV-2 变异株感染性的定量分析。通过各 Ha-CoV-2（Luc）变异株的基因组 RNA 拷贝数对两种变异株（Delta 和 Omicron）的相对感染性进行定量并归一化。野生型为 Ha-CoV-2（Wt），作为比较对照。感染实验与荧光素酶检测重复进行 3 次。RU，相对单位。图中显示均值与标准差（SD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="抗体中和曲线：相对感染活性 vs. Log10 浓度；WT、Delta、Omicron 变体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2．27BV 对 Ha-CoV-2(Luc) 变体中和活性的定量分析 在 HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 细胞感染后 18 小时分析 27BV 的中和活性。通过相对感染率（荧光素酶活性）与 27BV 浓度的关系计算 ID50。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Ha-CoV-2感染的细胞；明场与GFP荧光显微镜图像；病毒可视化方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3。Ha-CoV-2(GFP)对HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞的感染。 组装Ha-CoV-2(GFP)病毒颗粒并用于感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。感染后48小时通过荧光显微镜观察GFP的表达。左侧显示感染细胞的明场图像，右侧显示GFP荧光图像。白色标尺代表100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充图1. 图文摘要。 Ha-CoV-2假病毒的结构与应用。图片由Biorender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1. 蛋白质序列。 SARS-CoV-2 S、M、N 和 E 蛋白的序列列表。S 蛋白序列还包括 SARS-CoV-2 变体 Omicron (B.1.1.529) 和 Delta (B.1.617.2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种新型杂合阿尔法病毒-SARS-CoV-2假病毒（Ha-CoV-2）的应用，该平台可用于快速定量SARS-CoV-2变异株的感染性及其对中和抗体的敏感性。

Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行凸显了快速检测方法在准确评估新发SARS-CoV-2病毒传染性方面的重要需求……

本方案中，我们得出了两项主要发现。首先，我们的Ha-CoV-2平台表明，新出现的Omicron亚型变异株比原始的武汉毒株更具传染性。此外，Omicron亚型变异株对先前毒株诱导产生的中和抗体具有更强的抵抗能力。SARS-CoV-2 的研究需要 BSL-3 设施，这使得普通实验室难以监测 SARS-CoV-2 变异株并定量中和抗体。我们的 Ha-CoV-2 系统是一种假型病毒，可在普通实验室中使用，能够更快地定量病毒变异株及其对中和抗体的敏感性。Ha-CoV-2 是一种类病毒颗粒，包含 SARS-CoV-2 的所有结构蛋白，并且形态上类似于 SARS-CoV-2。此外，Ha-CoV-2 使用α型病毒载体以实现高效且快速的基因表达，从而获得快速的结果以及高信噪比，具有良好的可重复性。首先，在T75培养瓶中培养HEK293T细胞，使用含有热灭活胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的DMEM培养基。进行细胞计数时，将20微升细胞悬液与20微升台盼蓝溶液混合。向细胞计数室中加入20微升染料混合的细胞悬液，计数每毫升的细胞数量。在10厘米细胞培养培养皿中加入10毫升完全DMEM培养基接种HEK293T细胞。将细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育过夜。第二天，移除完全培养基，并替换为九毫升无血清 DMEM 培养基。利用病毒颗粒组装所需的指定化合物，制备共转染混合物。将该混合物缓慢加入培养皿中，在 37 摄氏度下孵育六小时。孵育后，将无血清DMEM更换为完全DMEM培养基，继续共转染孵育长达48小时。然后通过反复吹打单层细胞表面使细胞脱落，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在400 ×g离心5分钟。收集上清液，并通过0.22微米滤器过滤。将含有Ha-CoV-2假病毒的滤液在-80摄氏度下保存。首先，在T75培养瓶中使用含有热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基维持HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞。进行细胞计数时，取20微升细胞悬液与20微升台盼蓝溶液混合。将20微升染色后的细胞悬液加入细胞计数板中，计算每毫升的细胞数量。在96孔板的每个孔中加入50微升完全DMEM培养基，接种2.5 × 10⁴个HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞。将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，将50微升DMEM更换为50微升病毒悬液，并在37摄氏度下继续孵育18小时。孵育结束后，向每孔中加入7.5微升细胞裂解缓冲液，在摇床上混匀2分钟。细胞裂解后，加入新配制的萤光素酶检测试剂，并在旋转摇床上混匀1分钟。使用商用萤光素酶微孔板检测仪分析萤光素酶活性。对于中和抗体检测，将HEK293T细胞接种于50微升完全DMEM培养基中，操作如前所述。在96孔板中，加入8微升27 BV中和抗体，并用6微升无血清DMEM进行系列稀释。向系列稀释的抗体中加入54微升Ha-CoV2病毒颗粒，混匀悬浮液。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。然后向含有 HEK293T 细胞的孔中加入 50 微升病毒悬液。作为对照，向仅含有 HEK293T 细胞的孔中加入 50 微升完全 DMEM 培养基。将培养板置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 18 小时。裂解细胞后，加入新配制的萤光素酶检测试剂，通过轨道振荡混匀一分钟。使用商用萤光素酶酶标仪分析萤光素酶活性。Ha-CoV2 奥密克戎株及其变异株产生的信号比野生型 Ha-CoV2 高出四到十倍，提示其感染性更强。抗体 27 BV 对德尔塔和奥密克戎变异株均表现出中和活性。27种BV对Omicron的ID50效价约为对野生型和Delta毒株的ID50效价的十分之一。

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株和中和抗体快速定量中的应用

来源：Kelly Da Costa1, Diego Cantoni1,2, Martin Mayora-Neto1, Tobia Fantoni1,3, Nigel...

评估功能性SARS-CoV-2中和抗体

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。...

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

假病毒（PVs）是一类复制缺陷型病毒颗粒，可用于在比操作真实病毒更安全的条件下研究宿主与病毒之间的相互作用。本文展示了一项详细方案，说明如何利用SARS-CoV-2假病毒检测新冠疫苗接种后患者血清的中和能力。...

假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位...

基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

本文描述了分离和鉴定RNA病毒RNA聚合酶保真性变异体所需的步骤，以及如何利用突变频率数据在组织培养中确认保真性的改变。...

RNA病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

T淋巴细胞有丝分裂伴随着母细胞化转化，即细胞在分裂前体积增大。本文介绍一种利用能够测量细胞直径的自动细胞计数仪来定量T淋巴细胞母细胞化的方法。...

快速定量T淋巴细胞有丝分裂原诱导的母细胞化以鉴定免疫调节药物

我们描述了一种方法，用于鉴定人源或鼠源单克隆抗体结合甲型流感病毒血凝素所必需的关键残基。该方案可适用于其他病毒表面糖蛋白及其相应的中和抗体。...

中和流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的生成

通过双光子激光对细胞膜造成损伤是评估细胞膜修复能力的常用方法，可应用于多种细胞类型。本文介绍了一种实验方案 体外...

使用双光子激光显微镜的细胞膜修复检测方法

本文描述了抗原性脂质体纳米颗粒的制备方法及其在体外和体内刺激B细胞活化的应用。in vitro 和 in vivo...

用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体

了解Ha-CoV-2假病毒技术在SARS-CoV-2变异株感染性定量及中和抗体敏感性评估中的应用。该方法利用HEK293T细胞和荧光素酶检测，为病毒学研究提供安全高效的实验平台。

Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

探索更多视频