Name: TMEM200A作为泛癌生物标志物的多组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解TMEM200A在胃癌中的生物学功能，通过生物信息学预测与实验验证相结合的方法。该研究整合多组学分析技术，为识别胃癌治疗新靶点提供重要依据。

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本工作得到中国国家自然科学基金（82160550）的支持。

TMEM200A: A Novel Oncogene Regulating EMT and PI3K/AKT in Gastric Cancer

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作者声明不存在利益冲突。

TMEM200A 属于一个对癌细胞增殖至关重要的跨膜蛋白（TMEM）家族38。然而，TMEM200A 在不同恶性肿瘤中表达水平的差异尚未受到足够关注，且目前尚缺乏全面的泛癌研究。尽管如此，越来越多的证据表明，TMEM跨膜蛋白家族可能通过与多种蛋白质相互作用，在维持癌细胞恶性特征方面发挥重要作用。例如，ROCK1/moesin对TMEM16A钙激活氯离子通道（Ca2+-activated Cl- channels）的激活可促进BRCA的转移39。因此，在本研究中，我们重点分析了TMEM200A作为癌症治疗靶点和肿瘤诊断标志物的可行性。具体而言，我们利用UCSC Xena数据库中的RNA-seq数据，分析了TMEM200A在33种恶性肿瘤中的表达水平，并通过TIMER2.0数据库的结果成功验证了UCSC Xena数据库的分析结果。
随后，利用肿瘤免疫单细胞中心（Tumor Im...

癌症因其全球范围内较高的发病率和死亡率，已成为威胁人类健康的持续性公共卫生问题1，给社会带来了沉重的经济和医疗负担2。近年来，随着癌症标志物的发现3，癌症治疗取得了显著进展，研究人员已开发出多种新型诊断方法和抗癌药物。然而，由于药物耐药性、药物副作用以及化学敏感性等因素，部分癌症患者的预后仍然较差4。因此，迫切需要发现新的生物标志物，用于早期癌症的筛查和治疗5。
膜蛋白是指能够结合并整合到细胞和细胞器膜中的蛋白质6。根据其与膜结合的强度及所在位置，膜蛋白可分为三类：脂锚定蛋白、内在膜蛋白和外周膜蛋白7,8。跨膜蛋白（TMEM）是一种内在膜蛋白，至少包含一个跨膜区段9，该区段可完全或部分穿过生物膜。
尽管属于TMEM家族的蛋白质的作用机制尚未完全明确，但已知这些蛋白质与多种癌症相关10。多个TMEM蛋白与细胞迁移性、增殖性和侵袭性表型相关，其表达水平常与患者的预后相关11。因此，TMEM家族成员已成为研究的重要靶点。对现有TMEM相关研究的系统综述表明，它们主要参与细胞间和细胞内信号传导12、免疫相关疾病以及肿瘤发生过程10。许多TMEM蛋白还具有重要的生理功能，例如作为质膜上的离子通道、激活信号转导通路，以及介导细胞趋化、黏附、凋亡和自噬等过程10。因此，我们推测TMEM蛋白可能在肿瘤的检测与治疗中具有重要的预后标志物价值。
TMEM200A 在胃癌（GC）中表达显著升高。TMEM200A 位于染色体6q23.1，包含8个外显子，全长为77.536 kb，其高表达与胃癌患者总体生存期（OS）预后不良相关13。然而，其表达变化在肿瘤学研究中鲜有报道。本文利用多个公开可用的数据集，比较并分析了TMEM200A 作为治疗靶点及肿瘤诊断标志物在多种癌症研究中的应用价值。我们通过UCSC Xena和TCGA数据库的RNA-seq数据，结合实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（western blotting），评估了TMEM200A 作为泛癌诊断和预后生物标志物的有效性及其在多种人类癌症类型中的表达水平。
效应 TMEM200A 表达水平对突变率、调控过程、肿瘤诊断与预后、免疫浸润及免疫治疗的影响，进一步通过多种计算工具和数据集网站进行了研究。利用 CBioPortal 和癌症细胞体细胞突变目录（Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells, COSMIC）数据库分析了突变情况 TMEM200ASangerbox 和 TISIDB 网站被用于理解如何 TMEM200A 影响免疫浸润。利用肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）在线工具和CancerSEA数据库研究其功能 TMEM200A最后，为了评估 TMEM200A 在胃癌细胞恶性行为及肿瘤发育功能方面，进行了一项功能缺失实验 体外 检测。此外，通过蛋白质印迹法检测以评估如何 TMEM200A 敲低影响了胃癌中的PI3K/AKT信号通路及上皮-间质转化（EMT）。

<table><tbody><tr><td>抗AKT抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>60203-2-Ig</td><td></td></tr><tr><td>抗E-钙黏蛋白抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>20874-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗N-钙黏蛋白抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>22018-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗P-AKT抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>66444-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>抗Snai抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>13099-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗波形蛋白抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>10366-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep 多源总 RNA 小量提取试剂盒&lt;br/&gt; prep Kit</td><td>苏州优逸兰迪生物科技有限公司</td><td>UEL-UE-MN-MS-RNA-50G</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Epizyme Biotech</td><td>ZJ101L</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8试剂</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-K0301-500T</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛业生物（广州）有限公司</td><td>FBSSR-01021</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;GAPDH &lt;/em&gt;引物</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td>上游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;TGACATCAAGAAGGTG&lt;br/&gt; GTGAAGCAG；反向引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;）：GTGTCGCTGTTGAAG&lt;br/&gt; TCAGAGGAG</td></tr><tr><td>HighGene plus 转染试剂</td><td>ABclonal</td><td>RM09014P</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG（H+L）</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>人胃黏膜上皮 &lt;strong&gt;GES-1细胞&lt;/strong&gt;</td><td>广州赛莱克生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胃腺癌HGC-27细胞</td><td>普洛赛生命科学&amp;amp;Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胃腺癌SGC-7901细胞</td><td>普罗细胞生命科学&amp;amp;Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonAmp SYBR Green qPCR Mix（不含ROX）</td><td>Mona (苏州) 生物科技有限公司</td><td>MQ10101S</td><td></td></tr><tr><td>MonScript RTIII 一体化混合液（含 dsDNase）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Mona (苏州) 生物科技有限公司</td><td>MR05101M</td><td></td></tr><tr><td>Omni-ECL Femto 光化学发光试剂盒</td><td>Epizyme Biotech</td><td>SQ201</td><td></td></tr><tr><td>PAGE凝胶快速制备试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Epizyme Biotech</td><td>PG111</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen-Strep）</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;amp; 技术有限公司</td><td>P1400-100</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>默克股份公司</td><td>IPVH00010-1</td><td></td></tr><tr><td>无蛋白快速封闭缓冲液</td><td>Epizyme Biotech</td><td>PS108P</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解液</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;安普&科技有限公司</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640完全培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶</td><td>坎皮纳：Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBST缓冲液</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;安普&科技有限公司</td><td>T1082</td><td></td></tr><tr><td>蛋白上样缓冲液</td><td>Epizyme Biotech</td><td>LT101S</td><td></td></tr><tr><td>TMEM200A 沉默质粒</td><td>MiaoLing 质粒</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;TMEM200A &lt;/em&gt;引物</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td>上游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;）：AAGGCGGTGTGGTGGTTCG；下游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;TMEM200A &lt;/em&gt;SiRNA1</td><td>MiaoLing 质粒</td><td></td><td>上游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;）：ACA ACTGATGATAAGACCAG；反向引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;TGTTGACTACTATTCTGGTC</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;TMEM200A &lt;/em&gt;SiRNA2</td><td>MiaoLing 质粒</td><td></td><td>上游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;）：CGTGTGAATGTCAATGACTG；下游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;GCACACTTACAGTTACTGAC</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;TMEM200A &lt;/em&gt;SiRNA3</td><td>MiaoLing 质粒</td><td></td><td>上游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;）：ACAACCACAACATCTGCCCG；下游引物（5′&amp;rsquo;-3&amp;rsquo;TGTTGGTGTTGTAGACGGGC</td></tr><tr><td>跨膜蛋白200A抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>48081-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 细胞培养箱</td><td>海尔集团</td><td>PYXE-80IR</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光定量PCR仪</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>Berthold</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tmem200a 作为泛癌生物标志物的多组学分析

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

跨膜蛋白， TMEM200A，已知与人类癌症及免疫浸润相关。在此，我们评估了其功能 TMEM200A 通过多组学分析在常见癌症中的应用 体外 胃细胞的细胞培养以验证结果。表达的检测 TMEM200A 利用来自 UCSC Xena 数据库的 RNA-seq 数据评估了多种人类癌症类型中基因的表达情况。生物信息学分析揭示了其潜在作用 TMEM200A 作为诊断和预后生物标志物。 
培养正常胃细胞系和胃癌细胞系，并对 TMEM200A 进行基因敲低。采用定量实时聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测 TMEM200A 的表达水平。体外 功能缺失实验用于确定 TMEM200A 在胃癌（GC）细胞恶性行为及肿瘤形成中的作用。通过蛋白质印迹法评估基因敲低对胃癌细胞上皮-间质转化（EMT）及PI3K/AKT信号通路的影响。生物信息学分析显示，TMEM200A 在胃癌中呈高表达。
敲低TMEM200A可抑制胃癌细胞的增殖，同时降低波形蛋白（vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）和Snai蛋白的表达，并抑制AKT的磷酸化。PI3K/AKT信号通路似乎也参与了TMEM200A介导的胃癌发展调控过程。本文结果表明，TMEM200A通过影响上皮-间质转化（EMT）来调控肿瘤微环境。TMEM200A还可能通过PI3K/AKT信号通路影响EMT，从而改变肿瘤微环境。因此，在泛癌特别是胃癌中，TMEM200A可能是一种潜在的生物标志物和癌基因。

表达 TMEM200A 在多种癌症中 
如图所示 图1，我们首先分析了差异表达水平 TMEM200A 通过不同数据库在多种癌症中. TMEM200A 在胆管癌（CHOL）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肝细胞癌（LIHC）、胃腺癌（STAD）和甲状腺癌（THCA）中，基于TCGA数据，其表达水平相较于相邻正常组织有所升高。然而， TMEM200A 表达在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌（CESC）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、直肠腺癌（READ）以及子宫体子宫内膜癌（UCEC）中降低（图2A）。在 TIMER2.0 数据库中， TMEM200A 在CHOL、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC和...

本文介绍了一种整合多种生物信息学工具来研究 TMEM200A 在癌症中生物学功能的实验方案。此外，我们还通过实验验证了生物信息学预测的结果。

TMEM200A 作为泛癌生物标志物的多组学分析

跨膜蛋白TMEM200A已知与人类癌症及免疫细胞浸润相关。本文中，我们评估了TMEM200A在……中的功能

在癌症生物标志物的鉴定方面已取得显著进展。然而，与跨膜蛋白家族相关的肿瘤多功能性问题仍未明确。因此，我们关于TMEM200A在胃癌中作用的研究未能为相关靶点提供研究方向。在本研究中，我们采用了在线数据库预测与实验技术验证相结合的方法，这简化了大量研究时间，并降低了相关领域实验的成本。未来，我们实验室将致力于探索胃癌中肿瘤干性的确切机制，寻找与糖基化修饰及主要体细胞记录相关的关联，并寻找胃癌治疗的新靶点。首先，请进入 TIMER 2.0 数据库网站界面。选择癌症探索标签页，在搜索框中输入基因编号，然后点击提交，以生成 TMEM200A 在各种肿瘤类型中的差异表达图像。进行转染时，标记三个微量离心管分别为 siRNA-1、二和三，然后在每个管中依次加入转染试剂和基础培养基。向各对应管中加入四微克 siRNA，并充分混匀。现在，将混合物分配到含有腺癌细胞的六孔板的三个孔中。轻轻摇动培养板，以确保混合物均匀分布。将加入混合物的三个孔标记为 siRNA-1、siRNA-2 和 siRNA-3。将细胞孵育4至6小时后，用新鲜的完全培养基替换标记孔中一半的培养基。在用于定量RT-PCR和蛋白质印迹分析前，继续孵育细胞24至48小时。首先，用TMEM200A siRNA转染胃腺癌细胞，并孵育两天，随后弃去孔中的细胞培养基，用1毫升PBS轻柔洗涤细胞两次。使用RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA。测定RNA浓度，并按照制造商说明书，使用cDNA合成试剂盒以1微克RNA合成cDNA。随后，在10微升反应体系中，对cDNA进行10倍系列稀释，进行定量RT-PCR分析。使用实时荧光定量PCR检测系统，将引物加入定量PCR预混液中。采用此处所示的定量PCR反应条件，并利用双ΔCT法测定各基因的相对表达水平。与GES-1细胞系相比，HGC-27细胞系中TMEM200A蛋白及其mRNA转录本均显著高表达。在人胃癌细胞SGC-7901中，TMEM200A的mRNA差异表达水平高于GES-1细胞。首先，用TMEM200A siRNA转染胃腺癌细胞，并培养两天，随后弃去孔中的细胞培养基，用1毫升PBS轻轻洗涤细胞两次。将细胞置于冰上，加入150微升预冷的RIPA裂解缓冲液。使用塑料细胞刮棒，小心地将贴壁细胞从培养皿上刮下，并轻柔地将细胞悬液转移至预冷的微量离心管中。随后，在4°C条件下，以1.5 × 10⁴ × g离心10分钟，将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。使用BCA蛋白定量试剂盒，按照制造商说明书测定蛋白含量。将每个样品的30克蛋白质上样至10% SDS-PAGE凝胶中。先以80伏电压电泳0.5小时，随后以120伏电压继续电泳1.5小时。接着，将凝胶中的蛋白质在恒定电流300毫安条件下转移至45微米的PVDF膜上，转移时间为1至1.5小时。将PVDF膜置于摇床上，每次5分钟，共洗脱三次。洗脱后，向容器中加入TBST，使膜的蛋白面朝上。随后将膜放入封闭缓冲液中，在室温下封闭30分钟。用TBST洗涤膜，每次10分钟，共洗涤三次。将膜在4°C下与一抗孵育过夜。用TBST洗涤膜三次后，加入兔或小鼠二抗，在室温下孵育1小时。然后，向PVDF膜加入ECL底物反应30秒，并使用成像系统检测信号。与未转染的细胞相比，转染siRNA的胃癌细胞HGC-27中TMEM200A的表达效率显著降低。TMEM200A siRNA显著抑制了上皮-间质转化相关蛋白的表达，并影响了磷脂酰肌醇3-激酶信号通路中AKT的磷酸化。首先将处于良好生长状态的 HGC-27 细胞接种至 96 孔板中。将转染后的细胞接种至分为阴性对照组和 TMEM200A siRNA 组的 96 孔板中。于 37 摄氏度下培养细胞。在特定时间间隔后，向每个孔中加入CCK试剂，并在37摄氏度下孵育两小时。最后，使用多功能酶标仪在450纳米处测定吸光度。CCK-8实验结果显示，与阴性对照组相比，TMEM200A敲低组的细胞活力显著下降。

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