Name: 用于体外研究的豚鼠圆窗膜移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: 学习从豚鼠颞骨中分离圆窗膜的方法，用于体外药物转运研究。该技术保留组织完整性，为内耳疾病药物递送策略的开发提供可靠的实验模型。

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本工作部分由NIDCD资助项目No. 1K08DC020780和5T32DC000027-33以及Rubenstein听力研究基金支持。

所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准（GP18M226）。本研究使用了哈特利白化豚鼠（雌雄皆有，体重500-700 g）。
1. 实验步骤的设置与准备
<ol>
	<li>实验开始前，使用环氧乙烷对所有器械进行灭菌。</li>
	<li>根据机构批准的方案实施动物安乐死。 
	注：本研究中采用非预充气室，从商用气瓶释放100%二氧化碳（CO2）。使用管路限流器调节气体流速，使其维持在每分钟30%至70%的容器体积范围内，符合2020年美国兽医医学会（AVMA）指南11。</li>
	<li>将动物放入容器中，通入二氧化碳5分钟。在呼吸停止后继续维持CO2气流1分钟。</li>
	<li>在呼吸停止后实施断头术，以确保动物安乐死。</li>
</ol>
2. 手术入路与移除术
<ol>
	<li>以常规方法从豚鼠颅骨中取出颞骨12。使用咬骨钳去除多余的软组织。辨认外耳道、颞骨鼓部和面神经管13（图1）。</li>
	<li>使用6 mm金刚砂钻头（见材料表）磨除外耳鼓室腹侧部分，完整暴露中耳腔和外耳道周缘。</li>
	<li>使用咬骨钳轻柔地去除外耳道和鼓环，同时分离锤砧关节。辨认砧骨、砧镫关节、耳蜗、水平半规管和面神经管13（图2A）。</li>
	<li>分离砧镫关节，并用镊子取出砧骨。辨认圆窗的骨性隐窝。</li>
	<li>使用6 mm金刚砂钻头磨除连接耳蜗与鼓室内侧壁朝向鼓膜张肌管方向的骨板。小心减压鼓膜张肌的骨性通道，并使用28 G针头去除鼓膜张肌。 
	注意：鼓膜张肌窝的内侧壁直接与圆窗膜（RWM）周围的耳蜗骨相连，操作时需避免造成可能延伸至圆窗的骨折。</li>
	<li>磨除连接耳蜗与鼓室下壁的骨板，直至耳蜗旁残留约1 mm宽的骨 ledge（图2B）。</li>
	<li>使用2 mm金刚砂钻头（见材料表），在耳蜗基回处造耳蜗开窗术，保留距圆窗约2 mm的骨质。沿与圆窗膜平行的平面继续向下扩大耳蜗开窗，以分离耳蜗基部与顶部。</li>
	<li>将耳蜗开窗切口延伸穿过密度更高的颅底骨质，从而获得耳蜗基回的横截面视图。 
	注意：将钻头方向对准内听道口，可使骨质去除最大化，同时避免过于靠近圆窗。</li>
	<li>从颅底侧观察标本，若尚未完成，需辨认内听道并钻至耳蜗开口处，使用28 G针头去除耳蜗神经。</li>
	<li>从耳蜗内部侧观察标本。用镊子或28 G针头辨认并去除基回的骨螺旋板及残余的蜗轴。</li>
	<li>充分冲洗鼓阶-前庭阶连通腔以清除碎屑。从耳蜗切除面应能清晰看到圆窗，无任何覆盖碎屑（图2C）。</li>
	<li>接下来从中耳侧观察标本。将外半规管和面神经管钻至卵圆窗水平。用镊子轻柔取出镫骨，暴露卵圆窗隐窝。值得注意的是，镫骨两支之间存在一条骨桥，称为镫骨肌嵴（crista stapedis）。</li>
	<li>使用1 mm金刚砂钻头（见材料表），沿圆窗面方向延伸卵圆窗，进一步开放前庭，注意保留1–2 mm与圆窗隐窝相邻的耳蜗骨质（图2D）。</li>
	<li>通过将卵圆窗切口与圆窗两侧的耳蜗切除切口连接，完成颞骨的切割。 
	注意：由于耳蜗骨质脆弱，保留标本中的鼓膜张肌窝并避免在其区域进行切割，有助于防止延伸至圆窗膜（RWM）的骨折，从而维持其完整性。</li>
	<li>在靠近内听道的颅底致密骨上完成最终修整，并轻柔打磨，最终获得一个完整切除的圆窗膜（RWM）标本（图3A）。</li>
</ol>

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
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<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

作者无任何披露事项。

在耳部局部给药中，圆窗膜（RWM）是治疗药物进入内耳的主要通路。为了更好地理解药物通过新型递送载体的转运机制和通透性，并推动药物研发，需要建立一种准确且可靠的台式模型。本研究证明，豚鼠圆窗膜离体移植是一种可行且可靠的实验方法，可用于系统研究药物与膜之间的相互作用。Lundman 等人和 Kelso 等人此前曾描述过类似的圆窗膜通透性模型2,16；然而，手术取出的具体步骤此前一直未被详细阐述，而耳蜗骨的脆弱性及复杂的解剖结构也给完整、成块地稳定获取完整的圆窗膜带来了挑战。
豚鼠的圆窗膜（RWM）位于耳蜗鼓阶的末端，周围被一层薄的耳蜗骨包围。在取材过程中，若该骨性结构发生骨折，可能导致标本无法使用，因为一旦周围的耳蜗骨不完整，RWM 容易被撕脱。本研究团队注意到，骨折最常发生在钻孔接近致密的颅底骨与脆性的耳蜗交界处时，由于骨密度的突变，增加了裂纹向圆窗区域扩展的风险。因此，建议在靠近圆窗处保留附着于耳蜗的鼓膜张肌窝较致密的骨质，这将提高标本获取的成功率，尤其是在老年动物中更为重要。在清除耳蜗内容物的过程中也可能造成骨结构的破坏；操作时必须小心，轻柔地去除骨螺旋板，同时尽量减少对周围耳蜗骨的扰动。
使用该模型时需要考虑的一个重要细节是圆窗膜（RWM）在取出后的存活能力。先前的研究组曾提出，哺乳动物的圆窗膜在取出后24至48小时内仍保持活性17。本研究的结果与这些发现一致；持续的转运实验和组织学分析均显示细胞结构完整（图2A），支持实验进行时豚鼠圆窗膜仍具有活性。为保持取出样本的整体健康状态，圆窗膜在安乐死后3小时内完成取出并嵌入处理。
在药物经RWM药代动力学研究中 体内，目前在测定外淋巴液的分布和浓度方面仍存在较大的技术难度1中耳给药方法及给药剂量的变化导致了不同的治疗效果。这些困难进一步受到迷路内复杂流体动力学以及注射物质通过咽鼓管不规则排出的影响。所述的离体实验方法可实现对圆窗膜（RWM）及其通透性影响因素的独立研究 离体 模型。此外，该外植体还允许直接探究和可视化当前用于提高RWM通透性的各种方法，例如超声微泡18 化学诱导的连接调节19未来针对药物递送中涉及的特定内吞机制的研究也将受益于该台式模型。

治疗感音神经性听力损失的新类型疗法已经出现。这些疗法向临床应用的转化受到内耳给药途径安全性与有效性的限制。目前的给药方法 体内 动物实验中的给药依赖于耳蜗内开窗或通过圆窗膜（RWM）扩散，后者为分隔中耳腔与耳蜗的非骨性屏障1.
手术开窗和耳内显微注射均为侵入性操作，可能对残余的内耳功能造成风险2。因此，圆窗膜（RWM）是局部药物递送的重要途径，而豚鼠是研究药物经圆窗膜及在内耳中局部药代动力学的主要临床前动物模型，广泛应用于药物研发3,4。尽管豚鼠的圆窗膜比人类的更薄，但其具有相同的三层结构。其直径约为1 mm，厚度为15–25 µm，由两层上皮细胞夹着一层结缔组织构成5。面向中耳的上皮层细胞排列紧密，并通过紧密连接相互连接；而面向内耳和鼓阶的上皮层结构较为疏松，细胞间缺乏明显的黏附连接。
目前，针对豚鼠圆窗膜药物通透性的临床前研究主要依赖于 体内 中耳注射后采集内耳的外淋巴液，该方法无法特异性研究圆窗膜转运6,7RWM外植体的碎片已用于临床前研究，但由于其脆弱且尺寸较小，难以在RWM上形成严密的密封，因此不适用于需要密封条件的药物和载体转运的系统性微流控研究。2其他研究团队已采用 体外 使用培养的人类上皮细胞模型来模拟RWM8,9,10然而，大多数这些构建物仅关注外层上皮，未能体现 native 组织结构的复杂性。为了更深入地理解跨 RWM 的转运机制，需要有针对性的 离体 需要开展研究。
本研究展示了从豚鼠中取出带有周围骨性支撑的圆窗膜（RWM），以保持其膜的完整性，并阐述了如何在实验模型中利用该组织，专门用于研究药物递送载体通过RWM的转运过程。

<table><tbody><tr><td>1 毫米金刚石球钻头</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 毫米金刚石球钻头</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 毫米金刚石球钻头</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus 系统</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>任何骨切割钻孔系统均可使用</td></tr><tr><td>BD Eclipse 针头 27 G × 1/2 英寸，配可拆卸 1 mL BD Luer-Lok 注射器</td><td>Becton, Dickinson, and Co.&amp;nbsp;</td><td>382903057894</td><td>任何 27–28 G 针头</td></tr><tr><td>Gorilla 环氧树脂胶</td><td>Gorilla</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

豚鼠圆窗膜外植体获取用于离体研究

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

向内耳高效且微创地递送药物是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）作为进入内耳的少数通道之一，已成为研究的关键焦点。然而，由于分离RWM的复杂性，我们对其药代动力学的理解仍然有限。RWM由三层不同的结构组成：外层上皮、中间结缔组织层和内层上皮层，每一层可能具有独特的药物递送特性。
目前研究药物通过圆窗膜（RWM）转运的模型主要采用活体动物模型或离体RWM模型，后者依赖于细胞培养或膜碎片。豚鼠是研究药物在内耳中药代动力学的已验证的临床前模型，也是向耳蜗递送载体进行转化研究的重要动物模型。在本研究中，我们描述了一种从豚鼠中完整剥离圆窗膜及其周围耳蜗骨组织的方法，用于台式药物递送实验。该方法可保持圆窗膜的天然结构完整性，相较于现有的台式模型，可能更真实地模拟药物转运过程中的屏障特性。

如图3A所示，该方法可将完整豚鼠圆窗膜连同周围一圈坚硬骨环一并取出。圆窗膜应与骨性环状结构在全周范围内完全连接，且耳蜗骨质不应出现骨折。与人类圆窗标本相比，豚鼠圆窗膜表面无假膜覆盖。此外，与人类不同的是，豚鼠镫骨的前后弓之间存在骨性桥连接，因此在取出镫骨上部结构前，需先将其折断并去除。代表性圆窗膜的组织学分析（图3B）显示其具有清晰的三层上皮结构，并邻接完整的圆窗隐窝。
从技术角度来看，有两个关键步骤。首先，在步骤 2.7 进行耳蜗切除时，重要的是使用钻头的赤道部位而非尖端进行切割，因为钻头尖端的抖动可能导致耳蜗骨的创伤性骨折，进而延伸至圆窗膜。其次，必须彻底磨除内听道，这有助于完全移除耳蜗神经，并更方便地解剖骨螺旋板，从而在耳蜗内侧形成一个统一的腔体，便于实验取样(图 2C)。
在成功提取圆窗膜（RWM）后，本课题组采用改良的尤辛室（Ussing chamber）评估该膜的药代动力学特性。其他研究团队已在鼓膜、圆窗膜以及视网膜组织中验证了这种改良尤辛室，用于评估上皮膜的转运特性14,15。该3D打印装置采用Poly-Jet Vero材料制成，包含两个三角形底座部件，每个底座均设有400 µL的液体腔室（图3）。将圆窗膜的骨性边缘用双组分环氧树脂胶（Gorilla，参见材料表）固定于底座上，随后使用硅酮密封剂（参见材料表）确保密封处完全防水（图4）。操作过程中需格外小心，避免环氧树脂或密封剂接触膜组织。当圆窗膜被稳妥夹置于中间后，两个底座再用环氧树脂粘合在一起。在转运实验期间，加载侧（朝向中耳的一侧）腔室中加入含有递送载体（或任何目标分子）的磷酸盐缓冲液（PBS），而取样腔室（朝向鼓阶的一侧）则仅填充PBS。在固定的时间间隔，从取样腔室中完全吸出液体，并更换为新鲜的PBS。
每次实验过程中均采取质量控制措施，以确保装置内样本周围形成严密的防水密封，同时膜保持完整无微孔。以下显示了使用棕色含铁核纳米颗粒溶液的代表性结果。通过在每次取样间隔期间抽吸取样室的全部体积，可定量验证防水密封的完整性；若取样室发生液体泄漏，则抽吸体积将少于完整体积。每次实验结束时，装载室中的液体体积也应保持不变。此外，由于目标液体呈棕色，在发生泄漏时可直观观察到。
为确保膜内无泄漏，采取了多种措施。首先，本研究中使用的所有圆窗膜（RWM）标本均为立即提取，且光学显微镜、共聚焦显微镜和电子显微镜图像均证实细胞和膜结构完整，无微穿孔（图3A，B）。其次，在部分RWM标本中人为制造微穿孔，以比较其对纳米颗粒递送的影响。取样和加载室吸出液的肉眼观察可进一步验证标本的完整性及密封的防水性。在有穿孔的RWM中，加载室与取样室之间会迅速达到平衡，可通过明显的颜色变化观察到这一现象（补充图1）。此外，研究发现微穿孔RWM中的物质转运量高于完整膜中观察到的最大变异值（补充图2）。上述方法共同构成了针对标本周围防水密封性以及RWM本身完整性的质量控制机制。
<img alt="颞骨解剖图，突出显示鼓泡和外耳道。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：豚鼠颞骨的术前影像。 本图显示了豚鼠颞骨术前影像中的鼓泡、外耳道及面神经管（*）。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="解剖后的耳蜗及颅底骨，带标签，展示听觉解剖结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：术中图像。 术中图像展示了圆窗膜与砧骨（*）、耳蜗（**）、镫骨（†）以及减压后的内听道（‡）之间的关系。阴影区域表示将被去除的标本部分。（A）去除鼓膜和面神经后（步骤 2.3）的豚鼠中耳腔。（B）张肌咽鼓管减压后（步骤 2.6）的中耳腔。（C）耳蜗造口并去除内耳内容物后（步骤 2.11）的圆窗膜基底面观。（D）去除镫骨并识别前庭后（步骤 2.13）的圆窗膜观。比例尺 = A,B（1 cm）；C,D（5 mm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的组织学样本及切片；组织学检查与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：最终的圆窗膜标本及组织学结果。（A）带有骨性环的豚鼠圆窗膜大体标本。比例尺 = 1 cm。（B）移植后豚鼠圆窗膜的组织学图像显示完整的三层结构。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中耳示意图及用于听觉研究设置和实验分析的3D打印模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：用于跨膜转运实验的微流控装置。（A）用于跨膜转运实验的微流控装置示意图。（B、C）用于实验的打印微流控装置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：5小时铁核纳米颗粒递送实验中加载室和取样室的内容物变化。 （A）完整圆窗膜的加载室显示颜色强度逐渐减弱，表明纳米颗粒浓度逐渐降低。（B）完整圆窗膜的取样室随时间推移颜色保持稳定，与纳米颗粒递送水平较低一致。（C）穿孔圆窗膜的加载室显示颜色强度迅速下降，表明内容物与取样室快速达到平衡。（D）穿孔圆窗膜的取样室随时间推移颜色逐渐加深，与高水平的纳米颗粒递送一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：纳米颗粒递送的代表性转运结果 代表性运输结果展示了纳米颗粒（Fe3O4 聚乙烯醇涂层核心，平均半径为77 nm）穿过完整及穿孔的豚鼠圆窗膜的渗透情况（均值±标准差，n ≥ 3 次圆窗膜实验）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本方案概述了一种从豚鼠颞骨中分离耳蜗圆窗膜的方法，为相关研究提供了有价值的资源 离体 研究。

将药物高效且微创地递送至内耳是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）作为少数几个可通向内耳的途径之一……

本研究团队正在探索用于治疗内耳疾病（如听力损失）的药物及药物递送载体。圆窗膜是阻止局部应用药物进入耳蜗的关键屏障，目前我们正致力于研究如何设计纳米粒子递送载体以穿透这一屏障。深入了解圆窗膜在药物转运方面的作用机制，对于开发有效的耳部药物递送策略至关重要。豚鼠是研究药物递送至耳部的重要临床前动物模型。然而，分离这种仅17微米厚的脆弱膜结构以进行药物转运研究仍是一项重大挑战。本文介绍了一种提取豚鼠圆窗膜的方法，可实现高效的台面药物转运研究。目前对药物递送至内耳的研究主要依赖于体内实验模型，随后进行前庭淋巴液取样，但这些方法无法对圆窗膜的转运机制进行特异性和靶向性研究。在本研究中，我们展示了提取带有周围骨性支撑结构的豚鼠圆窗膜的方法。该方法可保持组织原有结构的完整性，从而实现对药物通过圆窗膜递送过程的精确且靶向性的研究。首先，取一只经适当安乐死的豚鼠颅骨中分离出的颞骨，并去除多余的软组织。接着，使用6毫米金刚砂钻头磨除颞骨鼓室的腹侧部分，完全暴露中耳腔和外耳道。在咬骨钳的辅助下，轻柔地移除外耳道及鼓环。同时分离锤砧关节。使用镊子分离砧镫关节并移除砧骨，以识别圆窗的骨性隐窝。然后使用直径为6毫米的金刚砂钻头，磨除连接耳蜗与鼓室内侧壁至鼓张肌管方向的骨性板层。仔细减压鼓膜张肌的骨性通道，并用镊子去除鼓膜张肌。接着磨除连接耳蜗与鼓室下壁的骨板，直至耳蜗旁残留约一毫米的骨性边缘。使用直径为2 mm的金刚砂钻头，在耳蜗基回处造耳蜗开窗术，保留距圆窗约2 mm的骨质。沿与圆窗膜平行的平面继续向下扩大耳蜗造口，以分离耳蜗的基底部分与顶端部分。将耳蜗造口切口延伸穿过密度更高的颅底骨质，从而获得耳蜗基转的横截面视图。从颅底侧观察标本，并辨认内听道。钻至耳蜗孔。使用28号针头去除耳蜗神经。从眼内侧检查标本。使用28号针头或镊子，辨认并去除基底回的骨螺旋板及残余的蜗轴。大量冲洗统一的鼓阶与前庭阶腔体，以清除碎屑。从鼓室侧检查标本，磨开外半规管和面神经管，直至卵圆窗水平。使用28号针头轻柔地移除镫骨，暴露卵圆窗隐窝。使用1毫米金刚砂钻头，沿圆窗面方向扩展卵圆窗，进一步开放前庭。注意保留1至2毫米的耳蜗骨壁，紧邻圆窗隐窝。通过将卵圆窗切口与蜗窗两侧的切除切口连接，完成颞骨的切割。磨除内听道附近颅底骨的最后附着部分，并轻轻修整，最终获得一个被切除的蜗窗膜标本。该方法成功获取了带有周围一圈坚硬骨环的完整豚鼠蜗窗膜。 标本的组织学分析显示，上皮结构呈清晰的三层，且邻近的圆窗隐窝完整。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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关键词：支气管组织, 猪肺, 组织提取, 解剖, 实验动物模型, 呼吸道生物学

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豚鼠圆窗膜外植体获取用于离体研究

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