探究唾液腺中的细胞间相互作用 通过离体实验 活细胞成像

我的研究深入探讨免疫系统在再生与修复过程中的作用。我主要关注在唾液腺辐射损伤过程中，巨噬细胞如何与上皮呈递细胞相互作用，以及这种相互作用如何影响修复过程。在免疫学与再生医学领域，爱丁堡大学开展的近期临床试验表明，将巨噬细胞作为肝硬化治疗手段，能够有效减少肝脏瘢痕，是一种可行的肝功能衰竭治疗方法。

利用离体精确切割组织切片培养模型，结合荧光标记细胞的活体成像，可使我们在接近体内组织状态的条件下实时观察细胞间的相互作用。了解损伤后巨噬细胞的定位，有助于揭示巨噬细胞在损伤后优先与哪些细胞类型发生相互作用。这最终使我们能够结合其他方法（例如单细胞RNA测序分析），尝试解析这些相互作用的分子基础，从而为未来的治疗策略提供依据。

我们将探讨巨噬细胞与上皮细胞之间的双向信号传导，并检测通过外源性补充这些缺失的信号是否能够恢复唾液腺的稳态。首先，使用镊子去除安乐死小鼠下颌下唾液腺组织中残留的脂肪和结缔组织。然后，将腺体置于含有冰冻HBSS溶液的收集管中。

接下来，使用镊子将腺体切成一厘米见方的小块。将4%琼脂糖加热至50摄氏度，倒入35毫米的培养皿中。取少量琼脂糖溶液倒入另一个培养皿中，并将腺体小块放入其中。

然后将组织块在多余的琼脂糖中轻轻旋转，使其均匀包裹。接着，将四到六个腺体组织块平放于第一皿含有琼脂糖的培养皿中。盖上皿盖，并将其转移至冰盒中，用冰覆盖培养皿以冷却并凝固。

为了切分腺体组织，首先使用解剖刀小心地切割包含腺体的琼脂糖凝胶块周围。接着，在琼脂糖凝胶块上滴加一滴超级胶水，并将其固定在振动切片机的载物台上。然后，向振动切片机的样品槽中加入含1%青霉素-链霉素的冰冻PBS溶液。

使用解剖刀切除多余的琼脂糖，并在每块腺体之间创建5毫米的间隙。将振动切片机刀片与琼脂糖块对齐，设定切片的起始点和终止点。以低速和高振动频率将组织块切成150微米厚的切片。

切片完成后，使用画笔拾取切片并将其放入含有抗生素的预热RPMI培养基的培养皿中。培养下颌下腺切片时，首先向6孔板的每个孔中加入1.5毫升RPMI培养基，然后将0.4微米滤膜放入孔中。

接下来，借助画笔，将一至六片小心地转移至每个滤膜上。然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。对部分实验培养板进行伽马辐射以诱导损伤后，将培养板放回培养箱中。

接下来，向24孔板的各孔中加入500 µL培养基。用毛笔将切片从滤膜上轻轻提起，并缓慢浸入各孔中。将切片在相应的细胞核染料中孵育。

然后在37摄氏度下，于轻柔振荡条件下将切片与抗体共同孵育2小时。用培养基将切片浸洗三次，每次在室温下于轻柔振荡条件下在洗涤液中孵育10分钟。

接下来，使用镊子从双面成像间隔片上取下胶带。将间隔片粘附到玻璃底六孔板的底部。然后，用移液器向间隔片中心的空隙中加入 50 微升培养基。

将切片放入培养基中，确保其平放。然后用移液器小心地从间隙中移除 20 µL 培养基。用镊子小心地从隔片顶部移除胶带，并在其上方放置一个 25 mm 的圆形盖玻片。

按压垫片边缘，确保盖玻片牢固贴合。将组织切片置于共聚焦显微镜下成像。培养七天的未辐照下颌下腺切片保留了其线粒体信号及上皮结构。

然而，在照射后三天，观察到腺泡细胞和导管细胞萎缩。照射后四天可见caspase阳性细胞。在照射的组织切片中观察到γH2AX水平升高，提示体内DNA损伤。

活体成像技术证实了巨噬细胞在组织切片培养模型中对上皮细胞的吞噬作用。可对单个细胞进行检测和分割，以进一步分析细胞行为，例如迁移。