Name: 通过离体活细胞成像询问唾液腺中的细胞间相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: 探索小鼠下颌腺精准切片培养模型中的活细胞成像技术，实时观察巨噬细胞与上皮细胞的动态相互作用。该方法为再生医学和免疫学研究提供了重要的组织修复机制见解。

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SE 由惠康信托基金（Wellcome Trust）资助项目 108906/Z/15/Z 支持；EE 由英国研究与创新署/医学研究理事会（UKRI/MRC）资助项目 MR/S005544/1 以及爱丁堡大学校长研究员计划资助。图 1A 使用 BioRender.com 制作。

所有实验程序均获得英国国内事务部批准，并在许可号为 PB5FC9BD2 和 PP0330540 的项目许可下进行。所有实验均符合 ARRIVE 指南以及爱丁堡大学的相关规定。
野生型小鼠购自商业来源（见材料表）。Krt14CreER; R26mTmG 小鼠通过将Krt14CreER/+ 小鼠31与&#160;R26mTmG/ mTmG小鼠32杂交在本实验室繁育获得。所有实验均使用8至10周龄的雌性小鼠。
1. 收集和包埋下颌下腺
<ol>
	<li>通过暴露于逐渐升高的二氧化碳（CO2）浓度处死小鼠。随后，用70%乙醇（EtOH）喷洒切口区域，并使用剪刀和镊子小心地从周围组织中分离下颌下腺（SMG）（图1A）。用镊子去除脂肪和结缔组织，将腺体置于含有冰上预冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS，参见材料表）的收集管中。</li>
	<li>使用镊子将腺体分割成每块约1 cm2大小的组织块。</li>
	<li>将4%琼脂糖加热至50 °C，然后直接倒入35 mm培养皿中。</li>
	<li>将少量熔化的50 °C琼脂糖倒入另一个培养皿中，通过在过量琼脂糖中移动腺体进行彻底冲洗。 
	注意：此步骤用于去除腺体表面多余的液体。液体过多会影响腺体与琼脂糖的正常粘附。</li>
	<li>将4–6块腺体组织放入琼脂糖中，确保它们平放且处于同一平面（图1A）。 
	注意：确保腺体不接触琼脂糖表面或培养皿底部。</li>
	<li>盖上35 mm培养皿的盖子，并将其转移至冰盒中，用冰覆盖培养皿。</li>
	<li>静置5–10分钟，等待琼脂糖完全凝固。</li>
</ol>
2. 切片
<ol>
	<li>使用解剖刀小心地在含有腺体的琼脂糖块周围切割，将包含组织的琼脂糖块从培养皿中取出，保留约 5 mm 的边缘。</li>
	<li>将琼脂糖块固定在振动切片机（见材料表）的载物台上，滴加一滴超级胶水，确保琼脂糖块的整个底面均与胶水接触。</li>
	<li>让超级胶水固化约 5 分钟。然后，用冰冷的含 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）充满振动切片机的切片腔。</li>
	<li>在振动切片机切片腔的侧面和底部均加入冰块。 
	注意：保持极低温环境，并根据需要及时更换冰块。</li>
	<li>用解剖刀进行切口，修去多余的琼脂糖，并在每块腺体之间制造约 5 mm 的间隙，从而获得独立的组织片。</li>
	<li>将振动切片机的刀片与琼脂糖块的切面对其，并设定切片的起始点和终止点，以获得所需的切片厚度。</li>
	<li>在开始切片前，确保刀片未与琼脂糖块接触。此预防措施可避免意外切下大块琼脂糖而导致样本部分丢失。</li>
	<li>以低速和高振动频率切割厚度为 150 µm 的切片（例如，速度设为 3，振动频率设为 8–10，参数范围均为 1–10）（图 1A）。</li>
	<li>当切下的组织片释放到周围的 PBS 中后，使用画笔收集切片，并将其转移至含有预热的含 P/S 的 RPMI 培养基（Roswell Park Memorial Institute 培养基）的培养皿中。</li>
</ol>
3. 下颌下腺组织切片的培养与染色
<ol>
	<li>培养
	<ol>
		<li>向含有0.4 µm滤膜的6孔板的每个孔中加入1.5 mL RPMI培养基。确保滤膜下方无气泡残留。</li>
		<li>使用画笔将1–6个组织切片转移至滤膜上，注意避免切片破损。 
		注意：确保切片未浸没于培养基中，而是漂浮在滤膜表面。若完全浸没，切片在培养过程中可能因缺氧而死亡。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育，每3天更换一次培养基（图1A）。</li>
		<li>使用商用辐照仪对实验组培养板进行单次10 Gy伽马射线辐照（参见材料表），随后将培养板放回孵育箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像染色
	<ol>
		<li>使用画笔轻轻将切片从滤膜上取下，放入含有500 µL培养基的24孔板中，使切片完全浸没于培养基内。</li>
		<li>向培养基中加入相应浓度的偶联抗体和核染料（参见材料表）27。</li>
		<li>在37 °C条件下，以轻柔振荡方式孵育切片2小时。</li>
		<li>将切片浸入培养基中，在37 °C下以轻柔振荡方式进行洗涤，共洗涤3轮，每轮10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 封片与活体成像
<ol>
	<li>使用镊子从双面成像垫片的一侧取下胶带，并将粘性面朝下贴附到玻璃底六孔板的底部。</li>
	<li>用移液器将 50 µL 培养基加入垫片中央的空隙中。</li>
	<li>使用画笔将组织切片放入培养基中，确保切片平展且无气泡滞留。</li>
	<li>使用移液器小心地从空隙中移除 20 µL 培养基。</li>
	<li>用镊子取下垫片顶部的胶带，并将一片直径 25 mm 的圆形盖玻片置于其上。轻轻按压垫片边缘，确保盖玻片牢固粘附，注意避免用力过大而压碎盖玻片（图 1A）。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下对切片进行所需时间或时间间隔的成像（例如，使用 20 倍水镜每 15 分钟成像一次，持续 12 小时）。</li>
</ol>

Real-Time Live Imaging of Mouse Submandibular Gland Regeneration

作者声明无利益冲突。

培养唾液腺组织的能力 离体 为研究稳态和损伤反应背景下的细胞间相互作用提供了极佳的机会。尽管对小鼠下颌下腺进行活体成像具有可行性39,40，该技术依赖于使用荧光报告小鼠模型对目标细胞进行内源性标记，并且必须在终末麻醉条件下进行。此处介绍一种培养下颌下腺组织切片的方法 离体 描述了在保持细胞结构和细胞间相互作用的同时进行的方法。该方法优化了现有的活体成像技术，并为体内成像提供了替代方案。
利用该技术对组织进行长期维持依赖于在气液界面培养组织切片。以往的外植体模型26,41&#160;之所以可能仅成功维持培养数天，是因为这些模型将组织完全浸没于培养基中，实质上导致组织&#34;窒息&#34;。相比之下，采用气液界面培养系统可在较长时间内维持组织的健康状态和结构完整性，从而确保高质量成像。在成像前将下颌下腺（SMG）切片固定于载玻片上的方法，包括使用少量培养基并在空间受限的腔室内使切片保持平整，是该技术成功的关键环节。本实验中细胞的可视化依赖于内源性标记的报告基因小鼠或荧光标记的抗体。目前已有大量针对特定细胞类型及其亚群的转基因荧光报告小鼠模型和荧光偶联抗体，使得该方法适用于研究多种细胞特异性的相互作用。
虽然该方法为组织提供了一个良好的模型 原位 和 离体 辐射损伤导致腺泡和导管结构萎缩，类似于所发生的病变 体内13，某些元素无法重现 离体这些因素包括缺乏功能性血管系统和神经输入，以及炎性浸润细胞的缺失。鉴于血管和神经在唾液腺稳态与再生中已得到充分证实的作用26,42&#160;以及迁移性免疫细胞的重要性43，例如T细胞和B细胞，在唾液腺功能、损伤应答、感染以及干燥综合征（Sjögren's Syndrome, SS）发病机制中的作用（如综述所述）44），该检测方法可能会遗漏某些重要的细胞相互作用。此外，一些迁移速度极快的事件，例如自然杀伤（NK）细胞45 和树突状细胞（DC）46 运动，可能被每15分钟成像一次的方式遗漏。然而，可通过优化成像间隔以研究特定的细胞间相互作用，而利用z轴层扫进行三维成像的能力则允许评估细胞的三维运动。在成像过程中牢固固定组织对于定量分析（如细胞追踪测量）至关重要。此外，尽管本研究使用了小鼠组织，该方案仍为研究人类唾液腺中的细胞间相互作用提供了一种可行的方法，能够产生通过其他方法无法获得的重要转化信息。
尽管组织驻留型巨噬细胞在多种组织中的稳态维持与再生功能已得到证实2,10,11,12，但其在唾液腺中的作用在很大程度上仍未明确。尽管已知巨噬细胞在辐射损伤后上皮再生过程中至关重要13，这种效应的精确机制仍不清楚。对唾液腺组织切片进行活体成像，能够实时观察和分析复杂的组织动态过程，而这些过程常常在传统的共聚焦成像中被遗漏。此外，显而易见的是，巨噬细胞在执行不同功能时会发生显著的形态动态变化 体内47,48,49，且该方案相比固定组织中的典型静态观察，更能真实反映这些变化。未来的研究可利用此技术探究细胞间通讯在稳态、损伤及再生/修复过程中的动态改变。该方法将有助于阐明关键的信号通路和生物学事件，最终可能为治疗干预提供潜在益处。

研究表明，巨噬细胞在组织再生与修复过程中的作用日益重要，已超越其经典的免疫功能1,2。事实上，巨噬细胞参与了多种与再生相关的生物学过程，在修复的各个阶段、瘢痕形成以及纤维化过程中均发挥关键的调控作用3,4。组织驻留型巨噬细胞是一类高度异质性的细胞群体，其多样化的细胞表型由复杂的调控机制所驱动，在器官发育、功能维持及内环境稳态中发挥着不可或缺的作用（详见综述5）。组织驻留型巨噬细胞最初起源于卵黄囊和胎儿肝脏中的前体细胞，随后根据现有巨噬细胞的寿命及其所处组织或微环境的不同，以不同速率通过局部增殖或骨髓来源的血液单核细胞补充而得以更新6,7。
重要的是，组织驻留型巨噬细胞分布于所有组织中，并参与多种器官功能。它们的微环境对其进行了独特编程，使其执行特定生态位的功能。因此，巨噬细胞在组织内的定位可揭示其功能，例如在肺、乳腺、肠道、皮肤和肌肉中均观察到独特的巨噬细胞群体8,9,10。在乳腺发育过程中，导管相关巨噬细胞与导管树结构密切相关，其耗竭会导致分支显著减少11。此外，巨噬细胞在青春期形态发生以及妊娠期腺泡形成过程中是必需的，此时它们主动监测上皮组织。在肌肉损伤中，特定的巨噬细胞群体&#34;驻留于&#34;损伤部位，形成一个短暂的微环境，提供诱导干细胞增殖所需的信号。因此，这些巨噬细胞群体在调控修复过程中表现出特化功能2。在肺部，存在类似现象：间质巨噬细胞通过释放IL-1B，启动表达白细胞介素受体（IL-R1）的肺泡II型（AT2）细胞，促使其转化为损伤相关的瞬时前体细胞12。此外，近期研究表明，巨噬细胞对于小鼠下颌下唾液腺（SMG）在辐射损伤后的再生至关重要，若缺乏巨噬细胞，则上皮再生过程会受到破坏13。综上所述，这些数据强调了巨噬细胞在组织损伤后短暂炎症微环境中的活化与功能，同时也凸显了其在稳态维持中的重要作用。
巨噬细胞是具有活性的细胞，其功能涉及与多种不同类型细胞的相互作用，包括直接的细胞-细胞接触14,15，以及分泌可溶性因子等较为间接的方式2,16，后者对微环境调控至关重要。尽管传统的免疫荧光成像有助于初步解析这些相互作用，但其仅能呈现某一时间点的静态图像，因而遗漏了在高度动态的再生过程中诸多关键的时间节点17,18。随着对时间调控重要性的认识不断深入，以及再生过程中不同阶段相继出现的规律逐渐明晰，深入解析这些过程显得尤为必要。
放射治疗是许多癌症患者的重要救命疗法。尽管该疗法通常能有效缩小或消除肿瘤，但也会对辐射区域内的健康组织造成损伤，并引发免疫反应。辐射损伤可诱导巨噬细胞快速募集，并产生直接和间接的免疫调节反应19,20。在头颈部癌症治疗过程中，唾液腺常常被意外照射21,22，导致上皮损伤、细胞萎缩和纤维化23,24，进而引发口干症或慢性口干25。
唾液腺由多种细胞类型和结构组成，包括但不限于上皮细胞（既包含产生唾液的腺泡细胞，也包含输送唾液的导管细胞）、肌上皮细胞、上皮祖细胞、神经、血管、免疫细胞、成纤维细胞以及细胞外基质（ECM）。其中许多细胞类型在再生反应中的作用和响应此前已有描述26,27,28,29,30然而，这些不同细胞在稳态和再生过程中的相互作用，尤其是巨噬细胞等免疫细胞的行为，目前研究仍较少。本文描述了一种新建立的方法，用于研究活体状态下下颌下腺巨噬细胞与其他目标细胞之间的相互作用 离体 组织。下颌下腺在振动切片机上切片，对表面标志物进行染色后，可连续成像长达12小时。利用该方法，可观察巨噬细胞对周围细胞的吞噬作用，研究巨噬细胞的迁移动力学，并证实巨噬细胞与上皮细胞之间的直接细胞间相互作用。

<table><tbody><tr><td>0.4 &amp;micro;m 滤膜细胞培养小室（Nunc）</td><td>Avantor/VWR</td><td>734-2240</td><td>预装于6孔多孔培养板中的小室，尺寸为 20 mm &amp;times; 25 mm</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>111650</td><td>Deckglaser 盖玻片，直径 25 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>双面胶贴</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654004</td><td>SecureSeal 成像间隔垫 SS1 x 13，直径 13 mm，深度 0.12 mm，外径 25 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Scientific Laboratories Supplies</td><td>CHE1924</td><td>分析纯无水乙醇（EtOH），纯度 99.7%</td></tr><tr><td>F4/80 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>17-4801-82</td><td>F4/80 单克隆抗体 (BM8)，APC 标记，eBioscience</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>学生用精细直头宽柄镊</td></tr><tr><td>玻璃底 6 孔板</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>带高性能 #1.5 盖玻片的 6 孔玻璃底培养板</td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025050</td><td>含钙、含镁，不含酚红</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td>别名：bisBenzimide H 33342 三盐酸盐</td></tr><tr><td>冰盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>11339623</td><td>Azlon 聚氨酯带盖冰桶</td></tr><tr><td>成像与分析软件</td><td>Harmony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Merck</td><td>&amp;nbsp;A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td>水彩画笔，笔尖尺寸 10 mm x 2 mm</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>每毫升含青霉素 10,000 单位和链霉素 10 mg，经 0.1 &amp;mu;m 滤膜过滤</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td>一次性手术刀，11 号刀片</td></tr><tr><td>剪刀&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>超窄剪刀，长度 10.5 cm</td></tr><tr><td>Shepherd Mark-I-68A 137Cs 照射仪</td><td>JL Shepherd &amp;amp; Associates</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Bostik</td><td></td><td>多用途快干超强胶水</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica VT 1000 S</td></tr><tr><td>振动切片机刀片</td><td>Astra</td><td></td><td>Superior 铂金双刃刀片</td></tr><tr><td>野生型 (C57BL/BJ) 小鼠</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

探究唾液腺中的细胞间相互作用 通过离体实验 活细胞成像

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

唾液腺再生是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型之间的 intricate 相互作用。近期研究揭示了巨噬细胞在驱动再生反应中的关键作用。然而，我们对这一关键作用的理解主要依赖于从固定组织活检样本中获得的静态图像。为了克服这一局限性，并实时洞察这些细胞间的相互作用，本研究提出了一套完整的方案，用于唾液腺组织的 ex vivo 培养以及活细胞迁移过程的实时成像。
该方案包含多个关键步骤：首先，使用振动切片机小心地将小鼠下颌下唾液腺组织切成薄片，然后在气-液界面进行培养。这些组织切片可被有意损伤，例如通过辐射暴露，以诱导细胞损伤并触发再生反应。为了追踪特定的目标细胞，可对细胞进行内源性标记，例如利用从基因修饰小鼠中获取的唾液腺组织，其中某种特定蛋白已被绿色荧光蛋白（GFP）标记。 Alternatively，也可使用荧光标记的抗体对表达特定细胞表面标志物的细胞进行染色。制备完成后，将唾液腺切片置于高内涵共聚焦成像系统中进行活体成像，持续12小时，每15分钟采集一次图像。随后将获得的图像整合生成视频，进一步分析以提取有价值的细胞行为参数。这一创新方法为研究人员提供了强有力的工具，用于探究损伤后唾液腺内巨噬细胞的相互作用，从而增进对该动态生物学背景下再生过程的理解。

巨噬细胞对下颌下唾液腺损伤的反应尚不清楚，包括它们是否会定位于腺体内的特定结构并迁移至这些部位，以及其迁移的距离和速度。通过静态成像方法难以确定这些问题。
为解决这一问题，已开发出一种活体成像方法，用于实时研究巨噬细胞与上皮细胞之间的相互作用。该方法结合了切片的免疫荧光染色与内源性标记的谱系示踪小鼠模型（图1A 和 图2A）。在此模型中，切片接受10 Gy伽马射线照射以诱导辐射损伤，并在照射后（IR）2小时、3天和4天进行成像，未照射切片作为对照。数据从四个通道获取：Hoechst（使用425激光以最小化光毒性）、GFP（488）、dTomato（561）和Alexa 647（640）。进行z轴扫描，每2-3 µm采集一张图像，共收集30至40个层面，总成像高度为80-90 µm。
利用该技术分析膜结合型番茄荧光蛋白（mT）信号及Caspase3/7活性，结果表明，类器官切片在体外培养中保持了上皮结构，存活状态良好，且细胞死亡极少。数据显示，来自下颌下腺的未辐照切片 R26mTmG 小鼠32，培养7天后，仍保留其mT信号和上皮结构（图1B）。然而，在给药后3天 离体 照射后，腺泡和导管细胞萎缩明显（图1B；腺泡和导管结构分别由白色和绿色虚线标出），与 体内 辐射损伤13. 在未照射的切片中，细胞凋亡可忽略不计，但存在 Caspase 3/7 活化的迹象+ 照射后4天，照射切片中的细胞（图1C；绿色箭头），类似于 体内 损伤33,34此外，经辐照的脑片重现了 体内 DNA损伤34,35,36,37，如升高的γH2AX所示38 与非照射对照组相比（图1D，E因此，唾液腺类器官切片在培养中表现出良好的存活率，并对刺激产生类似的反应 体内 组织接受照射。
随后，研究了细胞间实时相互作用。在电离辐射后3天，对与GFP标记的上皮前体细胞（Krt14CreER-GFP）直接相互作用的巨噬细胞进行了为期12小时的观察（图2A 和 视频1）。值得注意的是，巨噬细胞在数小时内始终与上皮前体细胞保持紧密邻近，常常在整个12小时成像期间持续接触。此外，观察到巨噬细胞对上皮细胞的实时吞噬作用，证实了巨噬细胞在该组织切片培养模型中仍执行其传统功能（图2B、视频2 和 视频3）。该技术还发现，在稳态条件下以及辐射损伤后，巨噬细胞均相对静止，这可能与其在组织中的高密度有关。这是首次证明唾液腺巨噬细胞在稳态或辐射损伤后不会发生广泛的迁移。然而，尽管巨噬细胞未表现出显著迁移，但周围组织在辐射后表现出更高的动态性，多个巨噬细胞在标记的上皮细胞簇周围活跃地相互作用。此外，仅基于细胞核染色，该技术使我们能够随时间可视化切片内细胞的运动，常可见整个导管在组织内呈现“迁移”现象（视频4）。在培养过程中随着时间推移，切片逐渐从扁平形态转变为类球形结构，表明切片内部细胞的运动可能是由于细胞重排形成类似球形的结构，提示可能发生了一种潜在的组织重构事件。
最后，该实验生成的活体成像数据可用于定量测量细胞行为，例如迁移。可对单个细胞进行识别与分割（图3A），并使用市售的成像与分析软件测量迁移行为（参见材料表和视频5）。此外，可进行最近邻对象分析，以确定细胞（本例中为巨噬细胞）是否趋向于向其他目标细胞（本例中为Krt14CreER-GFP+细胞）迁移，以及这种动态关系随时间的变化情况（图3B）。
<img alt="小鼠腺体辐照实验；示意图；组织学分析；caspase 3/7、yH2AX 检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：在精确切割的唾液腺组织切片中重现体内反应。（A）实验方案示意图。（B）来自新鲜下颌下腺（SMG）组织、未经处理的 SMG 切片培养 7 天后，或 SMG 切片经单次 10 Gy γ 射线辐照后 3 天或 7 天的膜结合型 Tomato 的代表性图像。白色虚线表示典型的腺泡结构，绿色虚线表示典型的导管结构。比例尺 = 50 µm。（C）来自未经处理的 SMG 切片或 SMG 切片经单次 10 Gy γ 射线辐照后 2 小时或 4 天的 Caspase-3/7 表达的代表性图像。绿色箭头指示阳性细胞核。比例尺 = 50 µm。（D）来自未经处理的 SMG 切片或 SMG 切片经单次 10 Gy γ 射线辐照后 3 天的 γH2AX 表达的代表性图像。比例尺 = 20 µm。（E）来自未经处理的 SMG 切片或 SMG 切片经单次 10 Gy γ 射线辐照后 2 小时和 3 天的 EpCAM+ 上皮细胞中 γH2AX 的代表性表达。SSA = 侧向散射面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="Krt14CRE-ER-GFP 和 F4/80 细胞核的延时显微镜观察，细胞动态研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：巨噬细胞与上皮细胞相互作用及吞噬过程的活体成像。（A）照射后 KRT14+ 祖细胞及其子代（Krt14CreER-GFP+ 细胞）与巨噬细胞相互作用的连续静态图像。活细胞成像记录了90分钟内的细胞动态变化。比例尺 = 20 µm。相关视频为视频 1。（B）巨噬细胞吞噬上皮细胞的连续静态图像。活细胞成像展示了60分钟内的吞噬过程。白色箭头指示巨噬细胞，黄色箭头指示正在被吞噬细胞的细胞核。比例尺 = 50 µm。相关视频为视频 2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="单个细胞荧光图像及细胞研究中随时间变化的距离分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：细胞动态分析的活细胞成像。（A）图像展示单个细胞的识别与分割，用于分析细胞行为参数（如迁移，见视频5）。细胞及其轨迹以随机伪彩着色以便区分。比例尺 = 100 µm。（B）在10个时间点（每5分钟采集一次图像）上，距单个Krt14CreER-GFP+ 细胞最近物体的距离（µm）定量分析结果。数据以每孔的平均值表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
视频 1：活体成像显示照射后 KRT14+ 祖细胞/子代细胞与巨噬细胞之间的动态相互作用。组织切片在活体成像前接受单次 10 Gy 的γ射线照射。Krt14CreER-GFP+ 细胞以绿色表示，巨噬细胞（F4/80+）以红色表示，细胞核以青色表示。该视频包含一个单独的z轴层扫序列，覆盖12小时的培养过程，每15分钟采集一次图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%201.mp4" target="_blank">请点击此处下载视频。</a>
视频 2：活体成像捕捉巨噬细胞吞噬上皮细胞的过程。巨噬细胞（F4/80+）以红色显示，细胞核以青色显示。该视频由单个 z 轴层叠图像组成，涵盖 12 小时的培养过程，每 15 分钟采集一次图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%202.wmv" target="_blank">请点击此处下载视频。</a>
视频 3：最大投影活体成像显示巨噬细胞吞噬上皮细胞的过程。巨噬细胞（F4/80+）以红色显示，细胞核以青色显示。该视频展示了总厚度为 80 µm 的 z 轴层扫图像的最大投影（单个层面见于视频 2），成像持续 12 小时培养期，每 15 分钟采集一次图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%203.wmv" target="_blank">请点击此处下载视频。</a>
视频 4：活体成像展示唾液腺上皮在照射后培养过程中的动态行为。组织切片在活体成像前接受单次 10 Gy 的γ射线照射。巨噬细胞（F4/80+）以红色表示，细胞核以青色表示。该视频包含一个单独的z轴层叠序列，覆盖12小时的培养过程，每15分钟采集一次图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%204.wmv" target="_blank">请点击此处下载视频。</a>
视频 5：随时间变化的定量细胞迁移追踪。本视频展示了从活细胞成像视频中对单个细胞轨迹进行追踪的过程。箭头指示细胞的运动轨迹，每个细胞以不同的伪彩色标记。该视频包含单个 z 轴层叠图像，覆盖 1 小时的培养时间，每 15 分钟采集一次图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%205.wmv" target="_blank">请点击此处下载视频。</a>

免疫荧光成像受限于仅能通过单一时相的静态图像来观察复杂且具有时间依赖性的生物学过程。本研究介绍了一种在精密切割的小鼠下颌下腺组织切片上进行的活体成像方法。该方法可实现实时观察稳态期间的细胞间相互作用，以及再生与修复过程。

唾液腺再生是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型之间的 intricate 相互作用。近期研究揭示了其中关键的……

我的研究深入探讨免疫系统在再生与修复过程中的作用。我主要关注在唾液腺辐射损伤过程中，巨噬细胞如何与上皮呈递细胞相互作用，以及这种相互作用如何影响修复过程。在免疫学与再生医学领域，爱丁堡大学开展的近期临床试验表明，将巨噬细胞作为肝硬化治疗手段，能够有效减少肝脏瘢痕，是一种可行的肝功能衰竭治疗方法。利用离体精确切割组织切片培养模型，结合荧光标记细胞的活体成像，可使我们在接近体内组织状态的条件下实时观察细胞间的相互作用。了解损伤后巨噬细胞的定位，有助于揭示巨噬细胞在损伤后优先与哪些细胞类型发生相互作用。这最终使我们能够结合其他方法（例如单细胞RNA测序分析），尝试解析这些相互作用的分子基础，从而为未来的治疗策略提供依据。我们将探讨巨噬细胞与上皮细胞之间的双向信号传导，并检测通过外源性补充这些缺失的信号是否能够恢复唾液腺的稳态。首先，使用镊子去除安乐死小鼠下颌下唾液腺组织中残留的脂肪和结缔组织。然后，将腺体置于含有冰冻HBSS溶液的收集管中。接下来，使用镊子将腺体切成一厘米见方的小块。将4%琼脂糖加热至50摄氏度，倒入35毫米的培养皿中。取少量琼脂糖溶液倒入另一个培养皿中，并将腺体小块放入其中。然后将组织块在多余的琼脂糖中轻轻旋转，使其均匀包裹。接着，将四到六个腺体组织块平放于第一皿含有琼脂糖的培养皿中。盖上皿盖，并将其转移至冰盒中，用冰覆盖培养皿以冷却并凝固。为了切分腺体组织，首先使用解剖刀小心地切割包含腺体的琼脂糖凝胶块周围。接着，在琼脂糖凝胶块上滴加一滴超级胶水，并将其固定在振动切片机的载物台上。然后，向振动切片机的样品槽中加入含1%青霉素-链霉素的冰冻PBS溶液。使用解剖刀切除多余的琼脂糖，并在每块腺体之间创建5毫米的间隙。将振动切片机刀片与琼脂糖块对齐，设定切片的起始点和终止点。以低速和高振动频率将组织块切成150微米厚的切片。切片完成后，使用画笔拾取切片并将其放入含有抗生素的预热RPMI培养基的培养皿中。培养下颌下腺切片时，首先向6孔板的每个孔中加入1.5毫升RPMI培养基，然后将0.4微米滤膜放入孔中。接下来，借助画笔，将一至六片小心地转移至每个滤膜上。然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。对部分实验培养板进行伽马辐射以诱导损伤后，将培养板放回培养箱中。接下来，向24孔板的各孔中加入500 µL培养基。用毛笔将切片从滤膜上轻轻提起，并缓慢浸入各孔中。将切片在相应的细胞核染料中孵育。 然后在37摄氏度下，于轻柔振荡条件下将切片与抗体共同孵育2小时。用培养基将切片浸洗三次，每次在室温下于轻柔振荡条件下在洗涤液中孵育10分钟。接下来，使用镊子从双面成像间隔片上取下胶带。将间隔片粘附到玻璃底六孔板的底部。然后，用移液器向间隔片中心的空隙中加入 50 微升培养基。将切片放入培养基中，确保其平放。然后用移液器小心地从间隙中移除 20 µL 培养基。用镊子小心地从隔片顶部移除胶带，并在其上方放置一个 25 mm 的圆形盖玻片。按压垫片边缘，确保盖玻片牢固贴合。将组织切片置于共聚焦显微镜下成像。培养七天的未辐照下颌下腺切片保留了其线粒体信号及上皮结构。然而，在照射后三天，观察到腺泡细胞和导管细胞萎缩。照射后四天可见caspase阳性细胞。在照射的组织切片中观察到γH2AX水平升高，提示体内DNA损伤。活体成像技术证实了巨噬细胞在组织切片培养模型中对上皮细胞的吞噬作用。可对单个细胞进行检测和分割，以进一步分析细胞行为，例如迁移。

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Immunology and Infection

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