Name: 模仿丁氏滚动法治疗大鼠肌损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解模仿丁氏滚动法的自制推拿装置，用于标准化治疗大鼠骨骼肌损伤。该研究通过苏木精-伊红染色和酶联免疫吸附测定评估疗效，为推拿疗法的标准化研究提供可靠模型。

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本研究由国家自然科学基金（项目编号：82174521）和湖南中医药大学研究生创新项目（2022CX109）资助

涉及动物的实验程序已获得湖南中医药大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 滚轮按摩器的组装
<ol>
	<li>选择一种由橡胶滚轮、叉形支架、弹簧、限位挡板、调节夹板、螺钉和亚克力手柄组成的按摩器（图1）。确保橡胶滚轮长3 cm、直径1.6 cm，弹簧长3 cm、直径0.9 cm，限位挡板长3 cm、宽2 cm，手柄长12 cm、直径0.9 cm。</li>
	<li>力控设计：根据文献结果23，发现丁氏滚法的下压力约为体重的10%，因此在设计前滚动作时施加的压力约为大鼠体重的10%（0.2–0.3 N）。通过调节限位挡板的角度，在称重控制器上测试按摩器的最大压力约为0.3 N。该压力要求满足大鼠实验的需求。</li>
	<li>确保回滚时的最小压力约为0.08 N（图2）。确保压力精确符合丁氏滚法对前后作用力比值为3:1的要求。</li>
	<li>治疗前，要求操作者配合节拍器软件将滚动频率控制在140次/分钟，并在预实验中至少练习3次以上，以确保操作标准化。</li>
</ol>
2. 建立骨骼肌损伤的大鼠模型
<ol>
	<li>将24只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重200-250 g）随机分为三组，每组8只，分别为对照组（C）、notexin组（NTX）和notexin联合推拿组（NTX + 推拿），均给予标准饮食喂养。维持12小时光照/12小时黑暗循环，饲养环境温度为20-25 °C，相对湿度为50%-70%。</li>
	<li>通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，随后使用脱毛膏去除右侧下肢的毛发。脱毛后，用生理盐水擦拭残留的脱毛膏。通过夹趾反应确认麻醉效果充分。动物在麻醉期间使用眼膏润滑眼睛，防止干燥。整个操作过程中提供保温支持。</li>
	<li>注射前交替使用碘伏消毒液和75%酒精对右侧下肢皮肤进行消毒。先用蘸取碘伏消毒液的棉签从下肢皮肤中心开始，以同心圆方式向外擦拭；再用蘸有乙醇的棉签重复相同操作。</li>
	<li>参照文献方法建立骨骼肌损伤模型24。仅在一侧后肢注射notexin（避免双侧注射）。取1 mL注射器配30G针头，吸取200 µL notexin溶液（在15 mL离心管中将100 µg notexin溶于10 mL生理盐水中，配制成10 µg/mL的溶液），将notexin溶液经肌内注射注入腓肠肌以诱导肌肉损伤。</li>
	<li>缓慢注射notexin，拔针前停留3秒，确保完全注入。 
	注意：notexin为有毒化学品，若接触开放性伤口，需立即用大量清水冲洗，必要时及时就医。</li>
	<li>对照组大鼠注射200 µL生理盐水。将麻醉后的大鼠转移至铺有清洁垫料的空笼中，注意清除其口鼻周围的垫料，保持呼吸道通畅。注射结束后持续肉眼观察组织颜色及呼吸频率，直至大鼠意识基本恢复。</li>
	<li>将大鼠放回饲养笼，通常继续饲养24小时。</li>
</ol>
3. 推拿疗法
<ol>
	<li>将SD大鼠俯卧位放置于经75%酒精消毒的实验平台上，头部用黑色布料覆盖以暴露腓肠肌，但不要包裹过紧。</li>
	<li>对于NTX+推拿组使用推拿按摩器：手持按摩器，将滚轮置于大鼠腓肠肌上，向前滚动直至弹簧接触限位挡板，随后撤力使其回至初始位置，实现往复运动（图3）。</li>
	<li>以每分钟140次的频率滚动按摩器，每次操作持续3分钟。每日上午和下午各进行一次，连续3天。</li>
	<li>每次处理后将大鼠放回饲养笼，末次处理后禁食8小时。</li>
</ol>
4. 实验结束后采集大鼠的血液和组织
<ol>
	<li>根据相关动物实验伦理委员会的要求，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠。通过夹趾反应确认麻醉充分。采血后通过腹主动脉放血处死大鼠。</li>
	<li>注射前交替使用碘伏消毒液和75%酒精对皮肤进行消毒。用浸有聚维酮碘的棉签从腹部皮肤中央开始向外作环形涂抹。再用浸有乙醇的棉签重复操作。重复消毒3次。</li>
	<li>请助手使用两把止血钳提起腹部正中皮肤。术者使用手术刀从腹中线向耻骨联合方向切开腹壁皮肤和肌肉。</li>
	<li>打开腹腔后，用无菌棉球分离肠管，暴露腹膜后壁的腹主动脉。</li>
	<li>定位腹主动脉，采集5 mL大鼠血液至采血管中，静置1小时后以3000 × g 离心10分钟，分离血浆至1.5 mL离心管中。将血浆储存在-80 °C条件下。</li>
	<li>沿下腹部切口使用手术剪向右下肢外侧剪开皮肤，暴露下肢肌肉；用镊子仔细分离筋膜后，使用手术刀切断，完整取下腓肠肌。</li>
	<li>用无菌生理盐水清洗腓肠肌，去除附着的毛发和血液。</li>
	<li>将取出的腓肠肌放入含有4%多聚甲醛的15 mL离心管中。</li>
</ol>
5. 采用ELISA法检测血浆CK和FABP3水平
<ol>
	<li>计算并确定一次实验所需的预包被板数量。取出所需数量的包被板，放入96孔板架中，将剩余微孔板重新放回铝箔袋中密封，并储存于 4 °C.</li>
	<li>将试剂盒和样品在室温（25-28 °C）120 分钟，完全平衡至室温。 
	注意：试剂盒和样品的平衡至关重要，必须给予足够的时间进行平衡。</li>
	<li>设置标准品孔、样品孔和空白孔。加入 50 µL 向标准孔中加入不同浓度（100、50、25、12.5、6.25、0 ng/mL）的CK或FABP3标准品，每个标准品重复一次，共占用12个孔。</li>
	<li>向样品孔中加样 40 µL 样品稀释液（0.8 g NaCl，0.02 g KH2PO4，0.29 g Na2HPO412H2O，0.02 g KCl，0.01 g NaN3在100 mL双蒸水（pH 7.4）中，随后 10 µL 待测样本每个重复一次，共占用48个孔。</li>
	<li>除了位于最后一个样本孔后方两孔处的空白孔外，其余各孔均添加 100 µL 向各标准品孔和样品孔中加入 HRP 标记的抗人 CK 或 FABP3 抗体（酶标记抗体）。</li>
	<li>用封板膜密封各孔，并在以下条件下孵育 37 °C 水浴或恒温器中孵育60分钟</li>
	<li>弃去液体，用吸水纸拍干，每孔加入洗涤液，静置20秒，甩去洗涤液，用 blotting paper 拍干，重复洗涤5次（或使用洗板机）。</li>
	<li>添加 50 µL A显色液（20 mg四甲基联苯胺溶于10 mL乙醇，加至100 mL双蒸水中）及 50 µL 加入显色液B（0.1 M/L柠檬酸，0.2 M/L磷酸二氢钠缓冲液，pH 5.0–5.4）至各孔，避光孵育15分钟 37 °C.</li>
	<li>对于标准孔、样品孔和空白孔，加入 50 µL 向每孔加入终止液，15分钟内测定各孔在450 nm处的光密度值。</li>
</ol>
6. 大鼠胫前横纹肌注射蛇毒诱导损伤的组织学分析
<ol>
	<li>按照文献25所述方法，制备5 µm厚的石蜡切片，并用苏木精和伊红染色，用于光学显微镜观察。</li>
</ol>
7. 图像处理与数据分析
<ol>
	<li>使用分析软件读取并分析成像系统拍摄的图像。用鼠标将选定的图像视野移至屏幕中央，点击 40x，然后点击 Take Snapshot。</li>
	<li>在电子表格中记录 ELISA 的 OD 值，并利用标准曲线计算样品中大鼠 CK 和 FABP3 的水平。</li>
	<li>使用统计分析软件进行统计分析。测量结果以均值 ± 标准差（<img alt="均值 ± 标准差公式，统计学符号。" src="/files/ftp_upload/65820/65820eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1">）表示，组间比较采用单因素方差分析，当方差齐性时使用 LSD 检验，方差不齐时采用 Tamhane T2 方法。当 p 值小于 0.05 时，认为差异具有统计学意义。</li>
</ol>

A Massager Based on Ding's Roll Manipulation to Treat Muscle Injury in a Rat Model

<ol><li>Lempainen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+anterior+thigh+injuries+in+soccer+players%3A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sports+Science%2C+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Management of anterior thigh injuries in soccer players: practical guide.</a> BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 14 (1), 41(2022).</li>
<li>Bayer, M. L., Mackey, A., Magnusson, S. P., Krogsgaard, M. R., Kjær, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+acute+muscle+injuries+%28in+Danish%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ugeskrift+for+Laeger%22%5BJournal%5D)">Treatment of acute muscle injuries (in Danish).</a> Ugeskrift for Laeger. 181 (8), V11180753(2019).</li>
<li>Serner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Strength%2C+Flexibility%2C+and+Palpation+Pain+During+Rehabilitation+of+Athletes+with+Acute+Adductor+Injuries%3A+A+Prospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Orthopaedic+and+Sports+Physical+Therapy%22%5BJournal%5D)">Progression of Strength, Flexibility, and Palpation Pain During Rehabilitation of Athletes with Acute Adductor Injuries: A Prospective Cohort Study.</a> The Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy. 51 (3), 126-134 (2021).</li>
<li>Gozubuyuk, O. B., Koksal, C., Tasdemir, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehabilitation+of+a+patient+with+bilateral+rectus+abdominis+full+thickness+tear+sustained+in+recreational+strength+training%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Physiotherapy+Theory+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Rehabilitation of a patient with bilateral rectus abdominis full thickness tear sustained in recreational strength training: a case report.</a> Physiotherapy Theory and Practice. 38 (13), 3216-3225 (2022).</li>
<li>Hotfiel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Conservative+Treatment+and+Management+Strategies+of+Skeletal+Muscle+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Orthop%C3%A4die+und+Unfallchirurgie%22%5BJournal%5D)">Current Conservative Treatment and Management Strategies of Skeletal Muscle Injuries.</a> Zeitschrift für Orthopädie und Unfallchirurgie. 154 (3), 245-253 (2016).</li>
<li>de Sire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Treatment+for+Acute+Traumatic+Musculoskeletal+Pain+in+Athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Treatment for Acute Traumatic Musculoskeletal Pain in Athletes.</a> Medicina. 57 (11), 1208(2021).</li>
<li>Connor, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+exosomes+in+rotator+cuff+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of exosomes in rotator cuff tendon healing.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 37 (5), 759-767 (2019).</li>
<li>Martins, A. L. L., Giorno, L. P., Santos, A. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Applied+to+Skeletal+Muscle%3A+Strategies+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Applied to Skeletal Muscle: Strategies and Perspectives.</a> Bioengineering. 9 (12), 744(2022).</li>
<li>Horgan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clouds+across+the+new+dawn+for+clinical%2C+diagnostic+and+biological+data%3A+accelerating+the+development%2C+delivery+and+uptake+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Clouds across the new dawn for clinical, diagnostic and biological data: accelerating the development, delivery and uptake of personalized medicine.</a> Diagnosis. , (2023).</li>
<li>Urits, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Review+of+Alternative+Therapies+for+the+Management+of+Chronic+Pain+Patients%3A+Acupuncture%2C+Tai+Chi%2C+Osteopathic+Manipulative+Medicine%2C+and+Chiropractic+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Review of Alternative Therapies for the Management of Chronic Pain Patients: Acupuncture, Tai Chi, Osteopathic Manipulative Medicine, and Chiropractic Care.</a> Advances in Therapy. 38 (1), 76-89 (2021).</li>
<li>Lee, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chuna+%28or+Tuina%29+Manual+Therapy+for+Musculoskeletal+Disorders%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-based+Complementary+and+Alternative+Medicine%3A+eCAM%22%5BJournal%5D)">Chuna (or Tuina) Manual Therapy for Musculoskeletal Disorders: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Evidence-based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2017, 8218139(2017).</li>
<li>Xie, J., Deng, D. X., Chen, Y., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+intervention+of+massage+techniques+on+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hunan+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progress in the intervention of massage techniques on skeletal muscle injury.</a> Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 34 (04), 199-201 (2018).</li>
<li>Yuan, Y., Zhang, H., Zhang, G. H., Xue, X. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+microstructure+changes+and+rehabilitation+treatment+of+exercise-induced+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Massage+and+Rehabilitation+Medicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on microstructure changes and rehabilitation treatment of exercise-induced skeletal muscle injury.</a> Massage and Rehabilitation Medicine. 14 (6), 29-33 (2023).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Establishment+of+Famous+Tuina+Master+Ding+Jifeng+and+Wei+Fa+-+Commemorating+the+100th+Anniversary+of+Mr.+Ding+Jifeng%27s+Birthday%5BTitle%5D)+AND+%22Traditional+Chinese+Medicine+Culture%22%5BJournal%5D)">The Establishment of Famous Tuina Master Ding Jifeng and Wei Fa - Commemorating the 100th Anniversary of Mr. Ding Jifeng's Birthday.</a> Traditional Chinese Medicine Culture. 9 (6), 18-21 (2014).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Injury+Models+for+Studying+Muscle+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice.</a> PloS one. 11 (1), e0147198(2016).</li>
<li>Plant, D. R., Colarossi, F. E., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notexin+causes+greater+myotoxic+damage+and+slower+functional+repair+in+mouse+skeletal+muscles+than+bupivacaine%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Notexin causes greater myotoxic damage and slower functional repair in mouse skeletal muscles than bupivacaine.</a> Muscle & Nerve. 34 (5), 577-585 (2006).</li>
<li>Tierney, M. T., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+Evaluating+Skeletal+Muscle+Injury+by+Notexin+and+Barium+Chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducing and Evaluating Skeletal Muscle Injury by Notexin and Barium Chloride.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 53-60 (2016).</li>
<li>Torres-Ruiz, J., Alcalá-Carmona, B., Alejandre-Aguilar, R., Gómez-Martín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+myopathies+and+beyond%3A+The+dual+role+of+neutrophils+in+muscle+damage+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory myopathies and beyond: The dual role of neutrophils in muscle damage and regeneration.</a> Frontiers in Immunology. 14, 1113214(2023).</li>
<li>Tu, H., Li, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+balance+in+skeletal+muscle+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation balance in skeletal muscle damage and repair.</a> Frontiers in Immunology. 14, 1133355(2023).</li>
<li>Castro, C., Gourley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+inflammatory+myopathy%3A+issues+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Musculoskeletal+Disease%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of inflammatory myopathy: issues and management.</a> Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease. 4 (2), 111-120 (2012).</li>
<li>Dabby, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+or+minimally+symptomatic+hyperCKemia%3A+histopathologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Israel+Medical+Association+Journal%3A+IMAJ%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic or minimally symptomatic hyperCKemia: histopathologic correlates.</a> The Israel Medical Association Journal: IMAJ. 8 (2), 110-113 (2006).</li>
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<li>Dobek, G. L., Fulkerson, N. D., Nicholas, J., Schneider, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+muscle+crush+injury+of+the+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse model of muscle crush injury of the legs.</a> Comparative Medicine. 63 (3), 227-232 (2013).</li>
<li>Armstrong, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sildenafil+citrate+protects+skeletal+muscle+of+ischemia-reperfusion+injury%3A+immunohistochemical+study+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ciru%CC%81rgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Sildenafil citrate protects skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury: immunohistochemical study in rat model.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 28 (4), 282-287 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种针对大鼠骨骼肌损伤的推拿治疗方案，并在治疗后分析了骨骼肌损伤的程度，以验证该方法的有效性。值得注意的是，推拿可干预多种大鼠骨骼肌损伤模型，包括但不限于药物诱导（notexin、布比卡因）16、钝性挫伤26、挤压伤27以及缺血-再灌注损伤28。通过苏木精-伊红（HE）染色观察组织病理学变化，并采用ELISA检测骨骼肌损伤标志物，结果直观显示notexin可导致大鼠腓肠肌严重损伤，而模拟丁氏滚法的按摩器可减轻肌肉损伤。这些结果为推拿治疗骨骼肌损伤的有效性提供了有力证据。
在对模拟丁氏滚法的大鼠进行推拿时，需考虑若干必要步骤。治疗前，推拿操作者应预先接受培训，至少使用滚压按摩器练习3次，借助压力传感器调节挡板角度以实现适当的力度控制，并将推拿频率控制在140次/分钟。同时，用黑色头巾轻轻覆盖大鼠头部使其保持安静，注意不要过紧，以确保其能自由呼吸。若大鼠在推拿过程中突然挣扎活跃，应暂停操...

肌肉损伤是临床和日常生活中常见的创伤性损伤，可由外部撞击（挫伤）或肌肉纤维的慢性过度拉伸（拉伤）等原因引起，导致肌肉功能障碍和疼痛，甚至严重影响患者的生活质量1。在急性拉伤损伤后尽早开始康复治疗，是缩短重返运动时间2&#160;并减轻疼痛3,4的关键。现代西医中，肌肉损伤的临床急救遵循休息、冰敷、加压和抬高（RICE）原则，以控制肌肉组织内的出血5&#160;，并使用非甾体抗炎药物缓解疼痛6。近年来，外泌体7&#160;和组织工程8&#160;等新型疗法的发现，为骨骼肌疾病提供了潜在的治疗策略，弥补了既往药物治疗的不足。然而，这些疗法也可能增加患者的治疗成本，使其面临巨大的经济压力9。因此，建议采用替代性和补充性疗法治疗肌肉骨骼问题10。推拿作为中国传统医学方法，在中国临床广泛应用，因其疗效显著且副作用较少而深受患者欢迎。推拿治疗肌肉骨骼疾病可有效缓解疼痛并改善功能11,12,13。著名上海推拿医师丁季峰先生创立了丁氏滚法14，这是一种具有作用面积大、力度均匀柔和且渗透性强特点的独特滚动按压技术。
不同的动物模型基于不同的病因学机制。这些模型各有优缺点，正确且恰当地选择动物模型对基础实验具有重要意义，有助于理解骨骼肌损伤后再生与修复的细胞和分子信号通路，从而为开发治疗骨骼肌疾病的新疗法提供依据。化学诱导的肌肉损伤模型被广泛应用，通过向骨骼肌注射药物可导致肌纤维坏死，并在2周内有效形成再生区域15。notexin 和 bupivacaine 均可引起肌肉损伤，但 notexin 对骨骼肌造成的肌毒性损伤比 bupivacaine 更严重，且自然功能恢复相对较慢16。药物肌肉注射建模不仅耗时较短，而且能够控制骨骼肌损伤的效应和程度。这种可量化的控制使得成功建模更为容易15,17。
炎症反应是一种重要的生物学反应，在肌病研究中已被广泛探讨18,19。在骨骼肌损伤的早期阶段，肌纤维坏死会破坏局部肌肉稳态，大量炎性细胞浸润损伤部位，并分泌多种促炎性细胞因子19。肌酸激酶（CK）是评估骨骼肌损伤的传统血清生物标志物。然而，其缺乏组织特异性20&#160;和敏感性21，这限制了其在评估药物诱导的肌肉损伤程度以及间接反映损伤后肌肉恢复程度方面的能力。近年来，一些新型生物标志物（如脂肪酸结合蛋白3（FABP3））在骨骼肌损伤的啮齿类动物模型中表现出相对较高的组织特异性和敏感性。FABP3是一类主要在心肌和骨骼肌细胞中表达的结合蛋白家族，参与脂肪酸的代谢、转运和信号传导22。因此，我们选择联合使用CK和FABP3两种生物标志物，以评估notexin诱导的骨骼肌损伤程度及治疗后的恢复情况。
在啮齿类动物中，肌肉较浅，皮肤面积较小，这也决定了啮齿类动物按摩的各个参数将不同于人类。例如在动物治疗中，按摩治疗师应采用丁氏滚法并施加较小的力量，但由于损伤区域较小，可能不利于该技术的操作，最终导致按摩效果降低。因此，本实验采用自制的滚压式按摩装置，该装置符合丁氏滚法的特点，用于干预并评估蛇毒因子（notexin）诱导的大鼠骨骼肌损伤模型，有助于在实验动物研究中标准化推拿治疗的参数，从而深入探究推拿这一中医治疗方法对肌肉骨骼系统疾病的分子作用机制。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>JIANGXI FENGLIN</td><td>20220521</td><td></td></tr><tr><td>1.5 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>EP-150X-J</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Servicebio</td><td>EP-1501-J</td><td></td></tr><tr><td>30G 针头</td><td>CONPUVON</td><td>220318</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血液采集管</td><td>Servicebio</td><td>QX0023</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸手柄</td><td>广东广兴旺塑料材料有限公司</td><td>65643645</td><td></td></tr><tr><td>调节夹板</td><td>CREROMEM</td><td>20220729</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>INOHV</td><td>22080215</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Rayto</td><td>RT-6100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>INOHV</td><td>211106</td><td></td></tr><tr><td>叉形固定器</td><td>永康康哲健康科技有限公司</td><td>JL001</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet, 法国</td><td>LOTC190922002</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液套装</td><td>武汉谷歌生物科技有限公司</td><td>G1005</td><td></td></tr><tr><td>成像系统&amp;nbsp;</td><td>Nikon, 日本</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>碘伏消毒液</td><td>Hale&amp;Hearty</td><td>20221205</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon, 日本</td><td>Nikon Eclipse E100</td><td></td></tr><tr><td>限位挡板</td><td>CREROMEM</td><td>20220724</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan S.A.S.</td><td>L8104-100UG</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Merck KGaA</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>大鼠肌酸激酶（CK）ELISA 试剂盒</td><td>伦常硕生物科技</td><td>YD-35237</td><td></td></tr><tr><td>大鼠脂肪酸结合蛋白 3（FABP3）ELISA 试剂盒</td><td>伦常硕生物科技</td><td>YD-35730</td><td></td></tr><tr><td>橡胶滚轮</td><td>河北麦贵化学科技有限公司</td><td>202207</td><td></td></tr><tr><td>螺钉</td><td>伟燕五金</td><td>B05Z122</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley 大鼠</td><td>湖南斯莱克旺达实验动物有限公司</td><td>SYXK2019-0009</td><td></td></tr><tr><td>弹簧</td><td>炳彰五金</td><td>TH001</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Covetrus</td><td>#23</td><td></td></tr><tr><td>称重控制器</td><td>Iyoys</td><td>HY-XSQ</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟丁氏滚压法对竹叶青蛇毒诱导大鼠肌肉损伤的影响

Mimicking Ding's Roll Method on Notexin-Induced Muscle Injury in Rats

丁氏滚法是中医推拿（推拿）临床中最常用的推拿手法之一，也是当今中国最具影响力的传统推拿手法之一。该手法基于一指禅流派中常用的傳統滾法，並以“丁氏滾法”命名。由於具有抗炎和促進血液循環的作用，丁氏滾法對肌病具有良好的治療效果。然而，由於該手法作用於人體皮膚的接觸面積較大，因此在大鼠、兔子等皮膚面積較小的實驗動物身上操作極具挑戰性。此外，施加於人體的推拿力度與實驗動物所需的力度存在差異，實驗過程中容易出現力度過大或過小的情況，從而難以達到預期的治療效果。本實驗旨在根據丁氏滾法的操作參數（力度、頻率、推拿時間）設計一種適用於大鼠的簡易推拿儀器。該裝置可實現動物實驗中推拿操作的標準化，減少因主觀因素導致對不同動物施加推拿力度的差異。本研究建立了由notexin誘導的大鼠骨骼肌損傷模型，並採用血漿損傷標誌物肌酸激酶（CK）和脂肪酸結合蛋白3（FABP3）來評估推拿對骨骼肌損傷的治療效果。結果顯示，該推拿儀器能夠降低CK和FABP3的表達水平，減緩骨骼肌損傷程度。因此，本研究所描述的模擬丁氏滾法的推拿儀器，有助於在實驗研究中實現推拿手法的標準化，對後續探討推拿治療肌病的分子機制具有重要幫助。

为了观察大鼠骨骼肌损伤后的形态学特征，按照每组8只大鼠的实验方案，对腓肠肌进行苏木精-伊红染色，并使用分析软件读取染色图像。在采用竹叶毒素（NTX组）诱导腓肠肌损伤的大鼠中，大量肌细胞出现破裂、萎缩、坏死且排列不规则，且在病变区域周围有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润（图4B）。然而，在使用滚轮按摩器进行推拿治疗后（NTX+推拿组），肌细胞的病理状况得到改善，与NTX组相比，破裂、萎缩和坏死的细胞数量减少，且仅有少量炎性细胞浸润（图4C）。在对照组中，大鼠的肌细胞大小均匀、排列紧密，且无炎性细胞浸润（图4A）。
为了进一步验证使用丁氏滚轮按摩器进行推拿对大鼠腓肠肌损伤的治疗效果，我们采用ELISA检测了每组8只大鼠骨骼肌损伤标志物CK和FABP3的水平。与对照组相比，NTX组中CK和FABP3水平显著升高，而NTX+推拿组的CK和FABP3水平较NTX组明显降低（图5...

本方案描述了一种模拟丁氏滚压法的简易装置，用于建立大鼠骨骼肌损伤模型，并采用苏木精-伊红染色观察受损组织的病理变化，以及通过酶联免疫吸附测定检测血清损伤标志物的变化。

丁氏滚法是中医推拿（Tuina）临床中最常用的推拿手法之一，也是最具影响力的手法之一……

我们的研究范围是推拿治疗肌肉骨骼类疾病的生物学机制。在此，我们尝试使用自制的推拿装置，在实验动物上实现标准化且有效的推拿治疗。针对无法在大鼠身上实施丁氏滚法操作的问题，我们研制了一种可模拟丁氏滚法的传力装置，并在肌肉损伤的大鼠模型上验证该装置的有效性。我们的研究重点是，在未来标准化研究中，不同参数下滚轮按摩器对大鼠骨骼肌损伤的疗效如何。首先，选择一个由长度为3 cm、直径为1.6 cm的橡胶滚轮、叉形支架以及长度为3 cm、直径为0.9 cm的弹簧组成的按摩器。该滚轮还应包含一个长3 cm、宽2 cm的限位挡板。一个调整夹板、一颗螺钉和一个丙烯酸手柄，手柄长12厘米，直径0.9厘米。为控制丁氏滚压法中的力度，需在称重控制器上测试按摩头的最大压力，并通过调节限位挡板的角度，使作用力保持在约0.3牛顿。接下来，在回滚时确保最小压力约为 0.08 牛顿。治疗前，熟悉节拍器应用程序，将滚动频率控制在每分钟 140 次，并练习超过三次以标准化操作。首先将大鼠随机分为三组，每组八只，包括对照组、notexin 组以及 notexin联合推拿组。麻醉大鼠后，使用脱毛膏去除右侧后肢的毛发，然后用碘伏消毒液和75%酒精交替擦拭三遍，以环形向外的方式对皮肤进行消毒。为建立骨骼肌损伤模型，使用1毫升注射器配30号针头，将notexin溶液单侧注射至腓肠肌内。注射后等待三秒钟再拔出针头。向对照组大鼠注射 200 微升生理盐水。将麻醉后的大鼠转移至铺有清洁垫料的空笼中。在大鼠恢复足够意识之前，肉眼观察其组织颜色和呼吸频率。将大鼠放回饲养笼中，通常饲养24小时。通过苏木精-伊红染色观察大鼠骨骼肌损伤后的形态学特性。与对照组相比，经notexin注射损伤的腓肠肌显示出大量肌细胞破裂。细胞呈现萎缩、坏死，排列不规则，且在病变区域周围有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。首先，使用notexin诱导大鼠骨骼肌损伤。进行治疗时，将大鼠俯卧于实验平台上，用黑色布料覆盖其头部，以暴露腓肠肌。接下来，握住按摩器，将滚轮置于大鼠的腓肠肌上。向前滚动，直至弹簧接触限位挡板，然后撤回力量并返回初始位置，从而实现往复运动。以每分钟140次滚动的速度操作按摩器。连续三天，每天进行三次操作，每次持续三分钟。每次处理后将大鼠放回饲养笼，末次处理后禁食八小时。使用滚轮按摩器进行推拿治疗后，经竹节毒素注射损伤的腓肠肌肌细胞形态得到改善。通过苏木精-伊红染色观察发现，与损伤肌肉相比，萎缩、坏死的破裂细胞更少，且仅观察到少量炎性细胞。此外，采用ELISA法分析了骨骼肌损伤标志物CK和FABP3的水平。与notexin组相比，推拿组中这些标志物水平显著降低，提示推拿可减轻骨骼肌损伤。首先将麻醉后的动物置于手术台上。用碘伏消毒液和75%酒精交替擦拭皮肤三次进行消毒。使用两把止血钳在腹部中线处提起皮肤。使用手术刀从腹白线至耻骨联合处切开腹部皮肤和肌肉。打开腹腔后，用无菌棉球将肠管分离，暴露腹后壁的腹主动脉。定位腹主动脉，并采集5 mL大鼠血液至采血管中。将含有血液的试管静置1小时，然后在3,000G条件下离心10分钟以获取血浆。采集腓肠肌时，用手术剪沿下腹部切口向右侧下肢外侧方向剪开皮肤，暴露下肢肌肉。用镊子仔细分离筋膜后，使用手术刀切割，完整取出腓肠肌。用无菌生理盐水冲洗腓肠肌，以去除附着的毛发和血液，并将剥离的腓肠肌放入含有4%多聚甲醛的15毫升离心管中。

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医学

模仿丁氏滚动法治疗大鼠肌损伤

介绍了一种损伤的体内动物模型。该方法利用了腓神经的皮下位置。通过商用软件预先设定并同步运动速度、肌肉激活时机和运动弧度。损伤后的变化通过磁共振成像/波谱分析在体内进行监测。...

一个 在体内 啮齿类动物模型中的收缩性损伤及恢复过程的无创监测

本文描述了一种针对小鼠前 compartment 肌肉的神经肌肉电刺激（NMES）的啮齿类动物模型，该方法是一种安全且经济的临床手段。该模型的优势在于可对一种 readily available...

一种通过神经肌肉电刺激实现肌肉训练的小鼠模型

在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.

损伤诱导的衰老评估 在体 内 骨骼肌中的重编程

本方案描述了利用慢性收缩活动运动模型，观察大鼠后肢骨骼肌在刺激诱导下的适应性变化。...

应用慢性刺激研究收缩活动诱导的大鼠骨骼肌表型适应

我们介绍了一种体内方法，通过结合心脏毒素介导的骨骼肌损伤和自递送siRNA注射，研究卫星细胞中特定基因功能的丧失。...

通过心脏毒素损伤及体内自递送siRNA注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

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富氏皮下针刺法对坐骨神经痛疗效的研究：慢性缩窄性损伤大鼠模型中的行为学与电生理学变化

本研究建立了一种在大鼠模型中高效且可重复的推拿治疗冻结肩的方案。该方法将有助于研究推拿疗法治疗冻结肩的治疗方式。...

在冻结肩大鼠模型中应用推拿：一种高效且可重复的实验方案

本文介绍了一种采用推拿疗法治疗大鼠背根神经节慢性受压的方法，并提供了一种基于疼痛行为和组织病理学结果评估其疗效的方案。...

推拿对背根神经节受压痛大鼠模型镇痛作用的研究

我们介绍了一种利用推拿手法模拟器对轻度慢性缩窄性损伤大鼠实施“三法三穴”推拿治疗的实验方案，并通过行为学分析及酶联免疫吸附测定检测炎症因子表达的变化，以评估推拿在24小时内产生镇痛效果的有效时间点。...

一次推拿干预后24小时内神经损伤大鼠疼痛变化特征

本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。...

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

了解模仿丁氏滚动法的自制推拿装置，用于标准化治疗大鼠骨骼肌损伤。该研究通过苏木精-伊红染色和酶联免疫吸附测定评估疗效，为推拿疗法的标准化研究提供可靠模型。

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