SARS-CoV-2、流感病毒A/B型和MERS-CoV多重实时RT-qPCR检测方法的建立
2023年11月10日
我们提供了两种基于探针的自主研发一步法RT-qPCR试剂盒，用于检测常见呼吸道病毒。第一种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）、甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及乙型流感病毒。第二种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，靶标为UpE和ORF1a）。这些检测方法可在任何专业实验室中成功实施。
本实验的总体目标是采用一种多重检测方法，以同时检测常见流行性呼吸道病毒，如SARS-CoV-2、MERS、甲型流感病毒和乙型流感病毒。推动本领域技术进步的主流技术包括CRISPR、侧向层析氨基酸检测、基于纸张的生物分子传感器、单管式Sherlock检测、DNA适配体，以及与环介导等温扩增（LAMP）整合的多重RT-qPCR。然而，多重RT-qPCR是目前最敏感、最常用的技术，也是诊断多种病毒的金标准。当前的实验挑战在于建立一种能够检测低至10个拷贝RNA的实验方案。
我们使用了自制的 RT-qPCR 试剂盒进行检测，该方法具有省时且成本低的优点。首先，在无 DNA/RNA 的水中配制 2x RT-qPCR 缓冲液，并将缓冲液储存于负 20 摄氏度，待后续使用。接下来，在 1.5 毫升离心管中混合引物和探针。
用洗脱缓冲液定容，然后将离心管置于负20摄氏度保存。在冰上，于1.5毫升离心管中配制含有Taq DNA聚合酶和MMLV逆转录酶的酶混合液。用Taq DNA聚合酶保存缓冲液定容。
现在将病毒合成RNA分别用100微升Tris-EDTA缓冲液重悬于不同的离心管中，配制成每微升含10的6次方个RNA拷贝的储存液。为混合病毒储存液，取SARS-CoV-2、流感病毒A型和B型各5微升，加入50微升Tris-EDTA缓冲液中。同样地，将SARS-CoV-2与MERS-CoV混合，得到第二种病毒混合液。
将两种混合物均稀释十倍，以获得每微升10个RNA拷贝的最终稀释浓度。向96孔板的每个孔中加入2×缓冲液、引物、酶、无DNA/RNA水以及相应的RNA混合物。使用粘性板封膜密封该板。
然后将酶标板离心1分钟，使液体聚集于孔底。接下来，设置PCR仪以适配快速96孔板类型，并将实验类型设为标准曲线。将试剂设为TaqMan试剂，并选择标准运行参数。
确定基因靶标和报告染料。然后为每个待检测的反应定义样本名称，并将靶标和样本分配至板孔布局中。接下来，将循环程序输入仪器。
将培养板以正确的方向转移至实时荧光定量 PCR 仪中，按下运行按钮以启动循环程序。选择保存实验数据的文件位置，然后分析荧光定量 PCR 程序提供的扩增曲线图。
两种开发的试剂盒均能够成功同时扩增全部三种目标基因，每反应最低可检测到10个RNA拷贝。所有病毒滴度的扩增效率均高于99%。
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概述
本研究介绍了两种基于探针的一步法RT-qPCR试剂盒的开发，旨在同时检测常见的呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2、MERS以及多种流感病毒株。这些试剂盒通过经济高效且节省时间的方法，提升了专业实验室的诊断能力。
关键研究组成部分
研究领域
- 呼吸道病毒检测
- 逆转录定量聚合酶链式反应技术
- 多重检测方法开发
背景
- 呼吸道病毒快速且灵敏诊断的必要性。
- 现有检测技术的局限性。
- 采用多重检测方法实现同步检测的重要性。
使用的方法
- 自主研发的RT-qPCR试剂盒
- 病毒RNA检测
- 结合特异性探针的多重RT-qPCR
主要结果
- 成功检测到SARS-CoV-2和MERS，同时检测到甲型和乙型流感病毒。
- 在每反应低至10个RNA拷贝时仍实现扩增。
- 目标基因的扩增效率高达99%以上。
结论
- 所开发的RT-qPCR试剂盒可有效用于呼吸道病毒的多重检测。
- 本研究有助于改进病毒学研究中的诊断策略。
常见问题
行业重要性概述
针对SARS-CoV-2、甲型/乙型流感病毒和MERS-CoV的多重实时RT-qPCR检测方法，满足了在发现性研究和转化研究中快速、灵敏且特异性检测共同传播的呼吸道病毒的关键需求。这些检测方法能够高置信度地区分不同的病毒靶标，支持可靠的靶标验证，并减少早期诊断开发中的不确定性。其整合应用可提高针对传染病威胁的研发项目组合的预测准确性和运行效率。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在呼吸系统疾病模型中对病毒靶标进行精确的功能验证分析。
- 通过在复杂样本中区分密切相关的病毒病原体，支持生物学风险降低。
- 有助于提高诊断和治疗项目中靶标筛选与优先级排序的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为抗病毒化合物或诊断试剂的下游筛选制备经过验证的多重检测系统。
- 提供标准化、可重复且定量的检测结果，用于检测方法的基准建立与优化。
- 实现可扩展的高通量筛选准备，以快速评估候选干预措施。
转化与临床前研究
- 通过实现多种呼吸道病毒的同步检测，契合转化生物标志物研究策略。
- 提供可靠且定量的病毒检测，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过在与疾病相关的系统中确保病原体的准确鉴定，降低候选物推进过程中的风险。
流程与工作流整合
多重 RT-qPCR 检测适用于从发现到临床前研究的连续过程，支持传染病项目中的早期假设验证、检测方法开发及转化研究。
- 发现生物学：为基于假设的病毒靶标验证提供高灵敏度检测。
- 筛选：为检测标准化和化合物评估提供可重复的定量结果。
- 分析：提供可靠的扩增数据和特异性指标，用于比较分析。
- 转化研究：实现生物标志物在不同研究阶段之间的衔接与连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用且适应性强的平台，适用于多种研发环境中多重病毒检测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高病毒检测的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强诊断工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现对病原体的早期准确区分，提升“推进/中止”决策的准确性及资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的传染病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备分子病毒学和定量PCR检测设计方面的专业知识。
- 需要具备实时PCR仪器及分析软件基础设施的使用权限。
- 要求跨团队在检测建立、数据分析和质量控制方面实现标准化。
- 可能需要针对不同样本类型或新出现的病毒变异株进行方法调整。
- 检测性能依赖于引物/探针的特异性以及RNA质量，具体以原始文献支持为准。
