使用数字显微镜研究细胞死亡的启动

超敏反应型隐蔽抗性是由N抗性基因决定的一种有效防御反应，表现为接种叶片上形成细胞死亡区域。我们正在通过成像技术研究接种叶片在细胞死亡启动至细胞死亡显现之间的时间段内细胞死亡的启动速率。

我们建立了一种简单的方法，用于测定不同预设的超敏反应（HR）病理系统中细胞死亡起始速率，该方法不耗时、成本低且易于使用。本方案可对叶片中的目标区域进行连续观察，这意味着我们能够精确确定病斑形成的时间，从而将细胞死亡起始速率精确到分钟级别，而使用其他方法通常只能精确到小时级别。若将本方案应用于转基因植物，并针对其他假定参与细胞死亡起始过程的组分进行研究，则可进一步揭示相关分子机制。

该方案使用户能够确定所研究组分水平的降低是否会影响细胞死亡起始的速率，从而鉴定出参与细胞死亡起始过程的组分。首先培养健康的马铃薯植株，并准备含有茎节组织培养基的试管。

六到八周后，使用无菌镊子和解剖刀切取十段长约一厘米、带有节的X植株。将X植株转移至含有MS（Murashige和Skoog）培养基的塑料盒中，并在生长室的可控环境条件下培养。

两周后，将部分花盆装入土壤，以准备移栽植物。用手指在花盆中央的土壤中挖一个深约3至4厘米的孔洞。然后向孔洞中注水，使其充分渗入土壤。

接下来，将每株植物放入穴中，确保叶片保持在表面以上。小心用土壤覆盖根部。在受控环境的生长室中培育这些植物。

三到四周后，植物即可进行接种。首先，使用带滤网的提取袋采集六至八周龄的感染马铃薯病毒的Pentland马铃薯植株。每克组织加入四毫升磷酸盐缓冲液，并添加DIECA。

然后使用手动匀浆器将植物匀浆1至2分钟。接着，取三到四周龄的健康马铃薯植株，将其前三个完全展开的叶片轻轻涂上碳化硅粉，并用制备好的病毒接种液轻轻摩擦叶片。10分钟后，用自来水将叶片冲洗干净。

最后将植株转移至生长室，在28摄氏度的受控环境条件下培养三天。首先，将感染病毒的马铃薯植株转移至维持在22摄氏度的生长室中。选取一株植株进行观察，并使用胶带完全固定第二个接种叶片。

接下来，将数字显微镜连接到计算机并启动图像采集软件。将叶片置于显微镜下，然后使用旋钮对叶片表面进行聚焦。

要调整相机设置，请点击设置按钮。将亮度设置为 64，对比度设置为 14，色度设置为零。接下来，调整白平衡，然后将饱和度设置为 47，锐度设置为零，伽马值设置为 5。

单击图像采集图标，选择延时视频选项。接着，设置每15分钟采集一次图像，共持续24小时，然后按下开始按钮以启动图像采集。要保存采集的图像，请选择所有图像并单击保存图标。

现在选择导出选项，然后将每英寸点数设置为最大值。保存后，从程序中删除所有图像。要编辑图像，请启动图像编辑软件（如 Image J），点击“文件”然后选择“导入”，并选择“图像序列”以导入视野中单个区域的时间序列图像，粘贴已保存图片目录的路径，然后按“确定”以开始转换。

转换完成后，Image J 将自动启动内置视频播放器，显示生成的视频。点击文件，然后选择“另存为”，并选取 AVI 格式以导出视频文件。当一个小窗口弹出时，将帧率设置为 0.3 FPS，然后点击确定，将视频保存为 AVI 文件。

选用接种后三到四周、具有三至四片完全展开叶片的马铃薯植株进行数字显微分析。在接种叶片的相同区域，每隔15分钟观察一次，以确定病斑随时间的发生和扩展情况。观察14小时后，未见可见病斑。

约90分钟后，记录到可见的病灶。病灶在两小时后开始扩展，并在接下来的八个半小时内持续扩大。