Name: 小鼠肺静脉心肌套的显微解剖和免疫荧光染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习小鼠肺静脉显微解剖与免疫荧光染色技术，用于研究心房颤动机制。本方法通过分离肺静脉组织并检测cTnT和CX43蛋白，为心律失常研究提供可靠的实验基础。

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本工作由德国心血管研究中心（DZHK；H.V. 项目编号 81X3600221，S.C. 项目编号 81X2600255）、中国国家留学基金管理委员会（CSC201808130158 资助 R.X.）、德国研究基金会（DFG；血管医学临床科学家项目（PRIME），P. T. 项目编号 MA 2186/14-1）和科罗纳基金会（S. C. 项目编号 S199/10079/2019）资助。

动物饲养和所有实验操作均遵循慕尼黑路德维希-马克西米利安大学动物护理与伦理委员会的指导方针，所有涉及小鼠的操作均获得上巴伐利亚政府批准（ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215、ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46、ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86、ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178、ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170）。C57BL6/N 小鼠为商业购得。
1. 准备
<ol>
	<li>取3 mg琼脂糖与100 mL 1×Tris缓冲盐溶液，加入500 mL锥形瓶中，配制3%琼脂糖凝胶。将溶液置于微波炉中，600 W加热2–3分钟，直至凝胶完全均匀。</li>
	<li>将凝胶轻轻倒入直径为100 mm的培养皿中，制备解剖盘，使凝胶填充培养皿一半体积。清除凝胶中的气泡，确保其均匀一致。静置解剖盘，待凝胶完全凝固后冷却备用。</li>
	<li>根据表1提供的配方，配制所有所需缓冲液和溶液，包括固定液、通透液、封闭缓冲液和洗涤缓冲液。</li>
</ol>
2. 器官收获与组织制备
注意：有关小鼠麻醉及心脏采集的详细实验方案已有文献发表17,18。因此，本文仅对该部分内容作简要描述。实验使用12至16周龄的C57BL6小鼠（雄性六只，雌性四只）。雄性小鼠体重范围为26 g至28 g，雌性小鼠体重范围为19 g至22 g。以下步骤均在未预先进行全身肝素注射的情况下进行。
<ol>
	<li>使用异氟烷（5%，95% 氧气，流速：1 L/min）麻醉小鼠，并确保麻醉深度足够。</li>
	<li>将小鼠转移至手术台，使其呈仰卧位。通过麻醉面罩吸入异氟烷（2%，98% 氧气，流速：1 L/min）维持麻醉状态，并用胶带固定小鼠四肢。腹腔注射芬太尼进行镇痛（0.1 mg/25 g 体重）。</li>
	<li>提起剑突部位的毛发，做一条横向约 2 mm 的切口。使用钝性分离法（剪刀背面）将皮肤与皮下筋膜分离，并向头侧和两侧延长切口，暴露胸腔。</li>
	<li>在肋弓下方小心打开腹腔。轻轻提起剑突，从尾侧切开膈肌使肺塌陷。随后从左至右剪开膈肌，避免损伤任何器官，双侧打开胸腔以暴露心脏。</li>
	<li>在心脏仍在跳动时剪断下腔静脉（IVC）以放血，然后用 27 G 针头穿刺左心室，注入 10 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），进行心脏灌注。</li>
	<li>待小鼠心脏血液清除后，定位主动脉弓、上腔静脉（SVC）和气管。在距心脏基底部约 3 mm 处切断这些结构，连同相连的肺组织一起取出心脏。</li>
	<li>将取出的器官浸入含有 2 mL 无菌 30% 蔗糖溶液的 10 mL 圆底离心管中，于 4 °C 下静置 24 小时，使样本脱水。</li>
</ol>
3. 显微镜引导下的LA和PVs制备
<ol>
	<li>将脱水后的心脏和肺放入含有40–50 mL 1×PBS的解剖皿中。置于10倍放大倍数的明场显微镜下，调整照明条件。将心脏背侧朝下放置于解剖皿中。辨认心室壁与心房壁之间的交界区域，使用手术剪小心地将心室与心房分离。 
	注意：在心房下方约1 mm处剪切，以保留部分心室组织。后续在将心房固定于解剖皿时，需利用该心室组织，避免损伤心脏基底部结构。建议保留心室，因其可作为阳性对照样本。心室组织的包埋操作请参照第4节所述肺静脉（PVs）包埋的相同步骤进行。</li>
	<li>将分离出的左、右心房（见步骤3.1）置于解剖皿中，使心脏基底部朝上。调整心房方向，使肺叶位于后方，左心房（LA）及左心耳（LAA）位于右侧，右心房（RA）及右心耳（RAA）位于左侧。用大头针将残留的左心室组织固定于解剖皿上以稳定标本。轻柔展开肺叶，避免施加过大外力，并用大头针将其固定于解剖皿上图1A).</li>
	<li>了解心脏基底部的解剖学标志。
	<ol>
		<li>在心脏基底部中央找到带有主动脉弓的主动脉。</li>
		<li>在主动脉右侧直接检测肺动脉干（PT），并追踪其向后走行的路径，以辨认肺动脉（PAs）。通过追踪肺动脉至左肺叶以及右肺上叶/中叶，确认其位置，并找到相应的肺门（LH）。</li>
		<li>确定气管以及左、右主支气管（L Br, R Br）的位置，它们位于主动脉后方，并通过追踪其走向左侧肺（LH）的路径来验证其位置图1A).</li>
		<li>在主动脉左侧找到上腔静脉，并通过追踪其进入右心房（位于右心耳旁）的走行加以确认。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在保留上述所有已识别解剖标志的前提下，清除心脏基底部周围的结缔组织和脂肪组织。此外，切除主动脉弓和气管，以充分暴露心脏基底部视野。图1B).</li>
	<li>用精细镊子进行钝性分离，轻轻将肺动脉从心房上表面分离。随后在左心耳处将其切断，并翻转至一侧，以充分暴露左心房游离壁（LAFW）和肺静脉（PVs）。切断左心耳处的主支气管，并去除支气管组织。图1C). 
	注意：左肺门（LH）既是肺动脉（PAs）和支气管进入肺部的共同通道，也是肺静脉（PVs）的出口。每一步操作都至关重要，必须准确执行&#160;在左肝管（LH）处谨慎操作，以避免对门静脉（PVs）造成任何损伤。</li>
	<li>为了分离左心房/右心房（LA/RA）以及左、右心室（LV、RV），从残留的右心室前部开始，向上经三尖瓣（TV）切至上腔静脉（SVC）前侧，从前侧打开右心房。在房间隔旁切开右心房后壁游离缘（RAFW），以分离右心房与左心房。在室间隔旁切开右心室后壁，以完全分离左心室与右心室。 
	注意：此前已发表过一份详细描述右心房制备与分离步骤的全面实验方案19分离右心房有助于从左心房-肺静脉组织复合物中去除不需要的组织，并可用于收集组织以进行其他实验。</li>
	<li>通过切除部分基底肺组织，减小肺叶的尺寸，使剩余肺组织约为3-4 mm。 
	&#8203;注意：保留肺叶的肺尖，因其在后续包埋步骤中可起到浮标作用，有助于将PVs水平包埋于O.C.T. 化合物中。</li>
</ol>
4. 组织包埋
<ol>
	<li>将包括左心房（LA）和肺静脉（PVs）的组织样本转移至冷冻模具中，确保心脏基底部和肺尖朝上。将其摆放为生理状态下的自然位置——确保肺静脉无扭曲或翻转。</li>
	<li>用O.C.T.包埋剂填充冷冻模具，并用精细镊子轻轻按压肺静脉以排出残留空气。在整个过程中保持其生理构型不变。</li>
	<li>将含有组织的冷冻模具置于干冰上，使O.C.T.包埋剂迅速冷冻。随后将样本储存于-80 °C环境中以备后续使用。 
	&#8203;注意：必须保持肺静脉处于水平位置，以确保后续实验中可获得包含完整肺静脉长度的切片。</li>
</ol>
5. 冷冻组织切片的切割与收集
注意：切割组织块时，机器设置调整为样本温度 -18 °C，刀片温度 -25 °C。
<ol>
	<li>在组织块与样品架之间涂抹一层O.C.T.包埋剂，将组织块安装在样品架上。冷冻3-4分钟。</li>
	<li>锁定样品头，并通过关闭样品夹释放杆将带有组织块的样品架装入样品头。使用微调旋钮精细调节组织块的位置。</li>
	<li>从样品上取下冷冻模具。松开样品头及恒冷切片机的电制动装置。</li>
	<li>将恒冷切片机设置为修块模式，修块厚度设为30 µm至50 µm。修切组织样品，直至肺静脉（PVs）可见。</li>
	<li>切换至精细切片模式，并将切片厚度设为10 µm。开始收集包含肺静脉及其相连的肺组织和心房组织的切片。使用防卷板，或用冰冷的细毛刷将每张切片的自由端固定在刀架上并展平，以收集切片。</li>
	<li>将一张室温放置的载玻片置于切片旁。小心地将切片从毛刷上释放，使其自然贴附于载玻片上，因冷冻切片及O.C.T.包埋剂接触较暖的载玻片表面后会融化。 
	注意：切片过程中应保持稳定轻柔的操作，防止切片破裂或折叠。必要时更换为新刀片。</li>
	<li>每张载玻片上最多收集三张切片。标记载玻片并储存在-20 °C。 
	&#8203;注意：我们建议为每根肺静脉至少收集五张切片（相当于两张载玻片）。</li>
</ol>
6. PVs 冷冻切片的免疫荧光染色
<ol>
	<li>将冷冻切片放置在染色系统上，于室温下静置约 20 分钟，使组织切片解冻。 
	注意：在染色系统中加入水以保持样本湿润。组织干燥可能破坏抗原，导致染色过程中出现非特异性抗体结合和过度染色等假象。</li>
	<li>解冻 20 分钟后，向切片上滴加数滴固定液（4% 多聚甲醛 [PFA]，表 1），在室温下固定 10 分钟，以固定切片上的组织。</li>
	<li>固定完成后，将切片转移至垂直切片架中，并浸入盛有 1× PBS 的容器内。将容器置于低速摇床上，洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤两次，每次均使用新鲜的 1× PBS。</li>
	<li>洗涤后，使用含二甲苯的液体阻断笔在每张切片上的每个组织切片区周围画圈。将切片重新放置于染色系统上，用巴斯德移液管向每个样本滴加 1 至 2 滴通透化溶液（0.1% Triton X-100，表 1）。在室温下孵育 10 分钟，以通透细胞及细胞器膜。</li>
	<li>通透化处理后，按照步骤 6.3 所述方法，用 1× PBS 对切片进行洗涤，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，以去除 0.1% Triton X-100 溶液。</li>
	<li>洗涤后，将切片重新排列于染色系统上，并向每个切片区滴加 1 至 2 滴封闭缓冲液（表 1），确保切片完全被封闭缓冲液覆盖。在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>通过移液，将 5 µL 小鼠抗 cTNT 抗体（1:200 稀释）和 1 µL 兔抗 Cx43 抗体（1:1,000 稀释）加入装有 994 µL 封闭缓冲液的 1.5 mL 微离心管中，配制 1 mL 一抗混合液。上下吹打混匀，确保充分混合。 
	注意：根据切片大小调整所用一抗混合液体积，确保切片完全被覆盖。抗体的浓度、孵育时间及最佳孵育温度可能因抗体类型、抗体克隆及组织特性而异。建议针对每种抗体单独测试并优化染色条件。</li>
	<li>封闭步骤（步骤 6.6）完成后，吸除残留的封闭缓冲液，直接向每个切片区滴加 2 至 3 滴一抗混合液。将切片置于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>一抗孵育结束后，在轻柔振荡条件下，用洗涤缓冲液对切片洗涤 3 次，每次 5 分钟（表 1）。</li>
	<li>通过移液，将 1 µL AF488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:1,000 稀释）和 1 µL AF568 标记的山羊抗兔二抗（1:1,000 稀释）加入装有 998 µL 洗涤缓冲液的 1.5 mL 微离心管中，配制 1 mL 二抗混合液。上下吹打混匀，确保充分混合。</li>
	<li>洗涤步骤（步骤 6.9）后，将切片重新排列于染色系统中，用移液器向每个切片区滴加 2 至 3 滴二抗混合液。在室温下避光孵育 45 分钟，防止荧光淬灭。二抗孵育结束后，在轻柔振荡条件下，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟（表 1）。</li>
	<li>将切片重新排列于染色系统上。通过向每个切片区滴加 2 至 3 滴 Hoechst-33342 溶液（以 1× PBS 1:1,000 稀释），对切片进行 Hoechst-33342 复染。在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，在轻柔振荡条件下，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟&#160;（表 1）。向每张切片滴加 1 至 2 滴荧光封片剂，盖上盖玻片。 
	注意：放置盖玻片时应确保其平整。若存在气泡，可轻轻按压气泡边缘以去除。</li>
	<li>将封片后的切片置于切片盒中，于 4 °C 保存。 
	&#8203;注意：建议尽早进行成像。本方案不仅限于所述抗体使用，可根据具体实验需求或替代抗原检测策略更换或调整靶抗原和抗体。</li>
</ol>
7. 免疫荧光染色切片的成像
<ol>
	<li>设置显微镜。
	<ol>
		<li>根据制造商手册，启动配备激光光源、连接的计算机及配套软件的显微镜。</li>
		<li>进入配置菜单。点击选择适用于荧光成像的相机类型（例如 DFC365FX 单色相机）。</li>
		<li>进入采集&#160;菜单并创建三个通道。</li>
		<li>选择通道 FCr1用于检测Hoechst-33342，对其进行标记，并在选择部分中选择DAP 滤光片组。将曝光时间设为200 ms，电子增益设为2，光强设为17%。</li>
		<li>选择通道 FCr2用于检测cTNT（使用 AF488 标记的抗体染色），对其进行标记，并在选择部分中选择L5 滤光片组。将曝光时间设为200–300 ms，电子增益设为1.8，光强设为100%。</li>
		<li>选择通道 FCr3用于检测Cx43（使用 AF568 标记的抗体染色），对其进行标记，并在选择部分中选择TXR 滤光片组。将曝光时间设为150 ms，电子增益设为2，光强设为100%。 
		注：滤光片组的光谱特性列于表 2中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片放置于显微镜载物台上。</li>
	<li>以 10x 放大倍数进行概览成像：
	<ol>
		<li>选择10x 物镜，通过点击实时（Live）打开激光快门。在选定FCr1 通道后，使用导航器功能在载玻片上移动，直至检测到信号。粗略调焦样本，使细胞核可被分辨。</li>
		<li>启动螺旋扫描模式以获取样本的完整预览图像。再次点击按钮关闭实时（live）模式，以保护样本。识别左心房（LA）、肺静脉（PVs）和肺组织。</li>
		<li>定义后续拼接扫描的感兴趣区域；在该区域内选择多个焦点位置。在FCr1 通道中点击实时（Live），并对每个焦点位置调节焦距。保存相应的Z 位置，这些位置代表每个焦点的精确对焦位置。以10x放大倍数开始拼接扫描，以获取样本的完整概览图像。</li>
		<li>扫描完成后，打开拼接图像并合并各单幅图像。为增强单个通道的亮度和对比度，可在对象栏中选择相应通道，并根据需要使用滑块调节其信号范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以40x放大倍数获取放大图像：
	<ol>
		<li>选择40x 物镜。按如下设置调整各通道的曝光时间和增益：FCr1：DAP 滤光片组：曝光时间 50 ms，增益 1.5；FCr2：L5 滤光片组：曝光时间 80 ms，增益 1.8；FCr3：TXR 滤光片组：曝光时间 20 ms，增益 2。</li>
		<li>利用第 7.3 步的概览图像定位肺静脉口（PVO）以及肺外和肺内肺静脉（PVex、PVin）区域。定义待扫描的区域。</li>
		<li>打开子菜单图像，点击 z 以激活Z-Stack功能。
		<ol>
			<li>选择FCr1 通道并打开激光快门，以获得实时预览。</li>
			<li>进入Z-Stack子菜单，通过顺时针和逆时针旋转细调焦旋钮，确定 Z-Stack 的起始点和终止点，直至整体信号开始失焦。</li>
			<li>设定焦距范围后，选择系统优化的 Z-Stack 模式，并启用计算扩展景深图像（EDF）选项。根据组织的平整程度，预计约有 20 层，步进间隔约为 0.5 µm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>开始拼接扫描。扫描完成后，打开拼接图像并仅合并 EDF 图像。为增强单个通道的亮度和对比度，可在对象栏中选择相应通道，并根据需要使用滑块调节其信号范围（参见步骤 7.3.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成图像后，保存项目，并将每幅图像的合并版本和原始通道均导出为 TIFF 文件。 
	&#8203;注：将文件保存为 ImageJ 可读的 TIFF 格式，可使 ImageJ 导入原始拼接图像的微米（µm）尺寸而非像素尺寸。在不需要激光信号时，务必关闭激光快门，以防止二抗发生光漂白。</li>
</ol>
8. 使用 ImageJ 进行图像编辑
<ol>
	<li>在 ImageJ 中加载相应的原始通道文件。点击 图像 | 颜色 | 合并，并为每个通道选择所需的颜色。</li>
	<li>通过选择 分析 | 工具 | 比例尺 创建比例尺，并将其粘贴至右下角。根据图像需求进行后续处理和分析。完成时保存合并后的图像。</li>
</ol>

Revealing Murine Pulmonary Veins Myocardial Architecture

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

通过本实验方案，我们分享了一种区分并分离小鼠心脏肺静脉（PVs）的方法，并对其进行免疫荧光染色。器官收获后，将心脏和肺组织置于无菌蔗糖溶液中脱水，随后在显微镜引导下分离心室、心房及肺叶。接着制备心脏基底部以暴露肺静脉，然后在肺门处将其从肺组织上切下。后续的免疫荧光染色采用冷冻切片技术，即将组织包埋于O.C.T. 化合物中，使用冷冻切片机进行切片，并对心肌肌钙蛋白T（cTNT）和连接蛋白43（Cx43）进行免疫荧光染色。
分离肺静脉（PVs）有助于研究其在心房颤动（AF）心律失常发生中的作用。然而，小鼠肺静脉的分离具有挑战性。除了体积微小之外，肺静脉还隐藏在主支气管和心脏基底部显著的血管结构后方，极大地增加了检测难度。本方案提供了一种简单且清晰的方法来研究小鼠肺静脉，并以经济高效的方式详细分析其形态学特征。所提出的组织 harvesting 与制备方法可保持肺静脉、相应肺叶与左心房（LA）之间的解剖关系，便于对完整的左心房-肺静脉组织复合体进行研究。
心外膜下神经节丛（MS）具有异质性排列。在包括大鼠和人类在内的多个物种中，已描...

心房颤动（AF）是最常见的持续性心律失常1。随着发病率持续上升，预计到2060年欧洲将有约1790万例AF患者1。AF在临床上具有重要意义，因其是心肌梗死、心力衰竭和卒中发生的重要危险因素，给个体、社会及社会经济带来巨大负担1。尽管AF已被认识数十年，但其病理生理机制仍未完全阐明2。
早在20世纪90年代末，研究就已表明肺静脉（PVs）在房颤（AF）的启动和维持中具有重要作用，因为它们是触发房颤的异位搏动的主要来源3。研究表明，肺静脉在结构上与其他血管不同。典型的血管含有平滑肌细胞，而肺静脉的中膜层还包含心肌细胞4。在啮齿类动物中，这种心肌组织普遍存在于整个肺静脉，包括肺内和肺外部分以及开口区域5。在人类中，肺静脉也含有心肌细胞，这些细胞可见于左心房（LA）心肌的延伸部分——即所谓的心肌袖（MS）6,7。
肌袖（MS）在形态学上与心房心肌具有相似性8。心房和肺静脉（PV）心肌细胞的形状和大小彼此之间无显著差异，并表现出类似的电生理特性8。肺静脉内的电生理记录已证实肌袖存在电活动，血管造影成像也显示其收缩与心跳同步9,10。
缝隙连接是由六个连接蛋白亚基组成的孔道形成蛋白复合物，可允许离子和小分子通过11。缝隙连接存在于细胞间的紧密接触区域，连接相邻的心肌细胞，并实现心肌细胞之间的细胞间电耦合12,13。心脏中表达多种连接蛋白亚型，其中连接蛋白43（Cx43）是心脏所有区域中最常见的亚型14。既往研究已证实肺静脉心肌细胞中存在Cx43的表达15,16。
由于完整肺静脉（PVs）结构精细，尤其是在小型动物模型中，对其进行心肌病（MS）研究仍然具有挑战性。本文展示了如何在显微镜引导下通过显微解剖技术识别并分离小鼠的肺静脉（PVs）、左心房（LA）以及肺叶。此外，我们还展示了肺静脉（PVs）的免疫荧光（IF）染色方法，以可视化肺静脉内的心肌细胞及其相互连接结构。

<table><tbody><tr><td>黏附载玻片</td><td>Epredia</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>AF568 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>宿主：山羊，反应性：兔</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biozym LE</td><td>840104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 二抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4408S</td><td>宿主：山羊，反应性：小鼠</td></tr><tr><td>抗连接蛋白 43 /GJA1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>多克隆抗体，克隆号：GJA1，宿主：兔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗心肌肌钙蛋白 T 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-12960</td><td>单克隆抗体，克隆号：13-11，宿主：小鼠</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>刷子</td><td>Lukas&amp;nbsp;</td><td>5486</td><td>6 号</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Epredia</td><td></td><td>24 mm × 50 mm</td></tr><tr><td>Cryotome Cryo Star NX70</td><td>Epredia&amp;nbsp;</td><td></td><td>设置：样本温度：-18 &amp;deg;C，刀片温度：-25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DFC365FX 相机</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DM6 B 荧光显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）1× 浓缩液</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dumont #5FS 镊子</td><td>F.S.T.</td><td>91150-20</td><td>需 2 把</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>F.S.T.</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>细胞核复染剂</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI</td><td></td><td>图像分析与处理软件</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>Leica DM6 B 显微镜成像软件</td></tr><tr><td>切片机刀片 S35</td><td>Feather</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S26-M</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Pierce</td><td>28908</td><td>无甲醇</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>直径 100 mm</td></tr><tr><td>3D 数字摇床</td><td>IKA Sch&amp;uuml;ttler</td><td>00040010000</td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td>EasyDip</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>样本模具</td><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>4557</td><td>25 mm × 20 mm × 5 mm</td></tr><tr><td>StainTray M920 染色系统</td><td>StainTray</td><td>631-1923</td><td>适用于 20 张载玻片的染色系统</td></tr><tr><td>Sterican 针头</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>G 27 — 用于实验步骤（&lt;strong&gt;步骤 2&lt;/strong&gt;）中的注射以及（&lt;strong&gt;步骤 3 和 4&lt;/strong&gt;）中的固定</td></tr><tr><td>学生型 Vannas 弹簧剪</td><td>F.S.T.</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen 液体阻断笔</td><td>Super PAP Pen</td><td>N71310-N</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Roche</td><td>TRIS-RO</td><td>1× Tris 缓冲盐水（TBS）的组分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

肺静脉（PVs）是心房心律失常中异位搏动的主要来源，在心房颤动（AF）的发生和发展中起着关键作用。肺静脉含有由心肌细胞组成的心肌袖（MS）。由于心肌袖与心脏工作心肌具有相似性，包括产生异位电冲动的能力，因此参与了心房颤动的启动和维持。啮齿类动物被广泛使用，可能是研究肺静脉心肌的优良动物模型，因为其血管壁各处均广泛存在心肌细胞。然而，由于器官体积小且解剖结构复杂，小鼠肺静脉的精确显微解剖和制备具有挑战性。
我们展示了一种在显微镜引导下进行显微解剖的实验方案，用于分离小鼠左心房（LA）及其肺静脉（PVs）。通过使用心肌肌钙蛋白T（cTNT）和连接蛋白43（Cx43）抗体进行免疫荧光染色，完整地显示左心房和肺静脉的结构。在10倍和40倍放大倍数下成像，可全面观察肺静脉的结构，并深入揭示心肌组织的精细架构，尤其突出显示连接蛋白43在心肌袖（MS）中的存在。

我们对10只12至16周龄的小鼠进行了肺静脉（PV）的显微解剖、染色和成像。按照实验方案，我们在所有实验小鼠中成功地将肺静脉（PV）与左心房（LA）一同进行显微解剖，并在其中8只小鼠中获得了能够全面观察肺静脉结构的组织切片。使用10倍物镜拍摄整体图像，以识别左心房-肺静脉连接处的肺静脉口（PVO）区域、肺外肺静脉（PVex）（位于肺门与左心房-肺静脉连接处之间的肺静脉）以及肺内肺静脉（PVin）（被肺组织包绕的肺静脉）（图2）。对上述区域的放大图像则采用40倍物镜获取（图3）。
我们在PVO、PVex和PVin中均检测到具有典型肌源性条纹的特异性cTNT信号（图3）。Cx43在上述三个肺静脉区域均有发现，主要分布于相邻心肌细胞之间（图3和 </...

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。

肺静脉（PVs）是心房心律失常中异位搏动的主要来源，在心房...的发生和发展过程中起着关键作用

心房颤动是最常见的心律失常，但其复杂的病理生理机制尚未完全阐明。通过我们的研究，有助于更好地理解导致心房颤动发生和维持的机制。将医学研究从实验室推向临床应用是一个重大挑战。为解决这一问题，我们建立了一条从细胞模型到小鼠模型，再到大型动物和猪模型的转化研究路径，从而能够识别并验证新的治疗靶点。小鼠常被用于心律失常的研究，然而在小鼠中研究肺静脉具有较大挑战性。肺静脉是患者心房颤动的主要触发因素。我们的实验方案为识别和显微解剖肺静脉以开展进一步研究提供了有效的操作指南。首先，将从小鼠体内分离出的已脱水的心脏和肺组织置于含有40至50毫升PBS的解剖皿中。将样本置于10倍放大倍率的明场显微镜下，调整照明条件。然后将心脏的背侧面向上放置于解剖皿中。使用手术剪，在识别出心室壁与心房壁之间的过渡区域后，小心地将心室与心房分离。将分离的左、右心房置于解剖皿中，使心脏基底部朝上。调整心房方向，使肺叶位于后方，左心房及其耳突位于右侧，右心房及其耳突位于左侧。用大头针将残留的左心室组织固定于解剖皿上，以稳定标本。轻轻展开长叶，避免施加过大力量，并用大头针将其固定在解剖皿中。接着，在心脏基部中央找到带有主动脉弓的主动脉。清除心脏基部周围的结缔组织和脂肪组织，同时保留所有已识别的解剖标志。同时，去除主动脉弓以清晰暴露心脏基底部。在主动脉右侧直接辨认肺动脉干，并沿其走向后方的路径识别左、右肺动脉。为确认其位置，可追踪其起始部分至左肺叶以及右肺上叶或中叶，以精确定位肺门。确定主动脉后方左、右主支气管的位置。通过追踪其走向肺门的路径来确认其位置。然后识别位于主动脉左侧的上腔静脉，并追踪其进入右心房的路径，靠近右心耳处。使用精细镊子进行钝性分离，小心地将肺动脉从心房的上表面分离。然后在肺门处切断肺动脉并移开，以完全暴露左心房游离壁和肺静脉。从肺门处移除主支气管，并弃去支气管组织。检查肺门以辨认肺动脉开口和主支气管。为分离心房与心室，从残留右心室的前部开始切开，沿三尖瓣向上延伸至上腔静脉前侧，从前侧打开右心房。随后，沿房间隔附近切开右心房后部游离壁，以形成右心房与左心房之间的分界。在室间隔旁剪开右心室后壁，以完全分离左心室和右心室。去除部分基底肺组织，修整肺叶大小，保留三到四毫米的肺组织。首先，从鼠心分离出左心房和肺静脉（PVs）。将分离的组织放入冷冻模具中，使心脏基部和肺尖朝上。如果肺静脉（PVs）扭曲或缠绕，需将其解开。然后用OCT包埋剂填充冷冻模具。使用精细镊子对肺静脉施加轻柔压力，固定其位置以去除残留空气。将组织置于干冰上的OCT包埋剂中冷冻。进行免疫染色时，将冷冻的小鼠肺静脉切片在染色系统上解冻20分钟。然后在切片上滴加数滴4%多聚甲醛固定液，以将组织牢固附着于载玻片上。孵育后，将载玻片转移至垂直放置的支架中，并浸入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的容器内。将容器置于缓慢摇床上震荡5分钟，以清洗载玻片。使用含二甲苯的液体阻隔笔，在每张载玻片上的每个组织区域周围画圈，然后将载玻片重新放置到染色系统中。用巴氏吸管向每个样本滴加一至两滴通透液。随后用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟，以去除 Triton X-100 溶液。在染色系统上重新排列载玻片后，向每个样本区域加入一到两滴封闭缓冲液，确保完全覆盖。接着，配制一毫升含一抗和封闭缓冲液的一抗混合液。弃去载玻片上残留的封闭缓冲液。向每个切片加入两到三滴一抗混合液。孵育后，将玻片置于垂直架中，用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤五分钟。随后，制备一毫升二抗混合液，包含二抗和洗涤缓冲液。将玻片重新放置于染色仪上，使用移液器向每个组织切片滴加两到三滴二抗混合液。随后，在摇床上用洗涤缓冲液清洗玻片三次，每次五分钟。接着，将玻片置于染色仪上，向每个组织切片滴加两到三滴 Hoechst 33342 溶液。将切片置于垂直的染色架中，用洗涤缓冲液轻轻振荡冲洗5分钟。每张切片上加入一至两滴荧光封片剂，并用盖玻片封片。在10倍放大倍数下观察左心房与肺静脉连接处的肺静脉口区域、肺外静脉以及肺内静脉。在40倍放大下，观察到肺静脉口、肺外静脉和肺内静脉中出现具有典型肌源性条纹的特异性cTnT信号。CX43在上述三个肺静脉区域均有发现，主要分布于相邻心肌细胞之间。在心肌袖状结构的心肌细胞中，CX43相关信号可见于细胞的极性侧和侧向边缘。

microdissection-immunofluorescence-staining-myocardial-sleeves-murine

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

小鼠肺静脉心肌套的显微解剖和免疫荧光染色

在本方案中，w我们在小鼠和人类心脏中鉴定出一种新型的类黑色素细胞（亦称心脏黑色素细胞），这类细胞可诱发小鼠心房心律失常。...

从小鼠心脏中分离原代类似黑色素细胞的细胞

来源：Brown, A. O., 和 Orihuela, C. J. 肺炎链球菌在心脏微小病变中的可视化及其后续心脏重塑。J. Vis. Exp.

对小鼠心脏组织切片中充满细菌的微小病灶进行免疫染色以用于成像

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。...

心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

本文描述了一种在小鼠中建立心肌梗死的高可重复性模型，该模型仅需最少的侵入性操作。该模型易于实施，具有高重复性和高存活率。因此，该模型将减少实验所需的动物数量，符合3R原则（替代、优化和减少）的要求。...

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR...

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

超声心动图检查在小鼠中经常使用。为此已开发出昂贵的高分辨率超声设备。本方案描述了一种经济实惠的超声心动图操作流程，并结合组织学形态计量分析，以确定心脏形态。...

小鼠心脏形态的超声心动图与组织学检查

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用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

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小鼠心脏毛细血管、小动脉及周细胞的动态测量与成像

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量化小鼠不同肺小叶中的肺微血管密度

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中心脏损伤的三维（3D）重建可实现对相关疾病影响模式的精确量化与共定位。本文提供了一种可自动化的光片引导成像方法，用于同时测量心脏损伤、风险区域以及免疫细胞反应。...

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

学习小鼠肺静脉显微解剖与免疫荧光染色技术，用于研究心房颤动机制。本方法通过分离肺静脉组织并检测cTnT和CX43蛋白，为心律失常研究提供可靠的实验基础。

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

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