小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

心房颤动是最常见的心律失常，但其复杂的病理生理机制尚未完全阐明。通过我们的研究，有助于更好地理解导致心房颤动发生和维持的机制。将医学研究从实验室推向临床应用是一个重大挑战。

为解决这一问题，我们建立了一条从细胞模型到小鼠模型，再到大型动物和猪模型的转化研究路径，从而能够识别并验证新的治疗靶点。小鼠常被用于心律失常的研究，然而在小鼠中研究肺静脉具有较大挑战性。

肺静脉是患者心房颤动的主要触发因素。我们的实验方案为识别和显微解剖肺静脉以开展进一步研究提供了有效的操作指南。首先，将从小鼠体内分离出的已脱水的心脏和肺组织置于含有40至50毫升PBS的解剖皿中。

将样本置于10倍放大倍率的明场显微镜下，调整照明条件。然后将心脏的背侧面向上放置于解剖皿中。使用手术剪，在识别出心室壁与心房壁之间的过渡区域后，小心地将心室与心房分离。

将分离的左、右心房置于解剖皿中，使心脏基底部朝上。调整心房方向，使肺叶位于后方，左心房及其耳突位于右侧，右心房及其耳突位于左侧。用大头针将残留的左心室组织固定于解剖皿上，以稳定标本。

轻轻展开长叶，避免施加过大力量，并用大头针将其固定在解剖皿中。接着，在心脏基部中央找到带有主动脉弓的主动脉。清除心脏基部周围的结缔组织和脂肪组织，同时保留所有已识别的解剖标志。

同时，去除主动脉弓以清晰暴露心脏基底部。在主动脉右侧直接辨认肺动脉干，并沿其走向后方的路径识别左、右肺动脉。为确认其位置，可追踪其起始部分至左肺叶以及右肺上叶或中叶，以精确定位肺门。

确定主动脉后方左、右主支气管的位置。通过追踪其走向肺门的路径来确认其位置。然后识别位于主动脉左侧的上腔静脉，并追踪其进入右心房的路径，靠近右心耳处。

使用精细镊子进行钝性分离，小心地将肺动脉从心房的上表面分离。然后在肺门处切断肺动脉并移开，以完全暴露左心房游离壁和肺静脉。从肺门处移除主支气管，并弃去支气管组织。

检查肺门以辨认肺动脉开口和主支气管。为分离心房与心室，从残留右心室的前部开始切开，沿三尖瓣向上延伸至上腔静脉前侧，从前侧打开右心房。随后，沿房间隔附近切开右心房后部游离壁，以形成右心房与左心房之间的分界。

在室间隔旁剪开右心室后壁，以完全分离左心室和右心室。去除部分基底肺组织，修整肺叶大小，保留三到四毫米的肺组织。首先，从鼠心分离出左心房和肺静脉（PVs）。

将分离的组织放入冷冻模具中，使心脏基部和肺尖朝上。如果肺静脉（PVs）扭曲或缠绕，需将其解开。然后用OCT包埋剂填充冷冻模具。

使用精细镊子对肺静脉施加轻柔压力，固定其位置以去除残留空气。将组织置于干冰上的OCT包埋剂中冷冻。进行免疫染色时，将冷冻的小鼠肺静脉切片在染色系统上解冻20分钟。

然后在切片上滴加数滴4%多聚甲醛固定液，以将组织牢固附着于载玻片上。孵育后，将载玻片转移至垂直放置的支架中，并浸入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的容器内。将容器置于缓慢摇床上震荡5分钟，以清洗载玻片。

使用含二甲苯的液体阻隔笔，在每张载玻片上的每个组织区域周围画圈，然后将载玻片重新放置到染色系统中。用巴氏吸管向每个样本滴加一至两滴通透液。随后用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟，以去除 Triton X-100 溶液。

在染色系统上重新排列载玻片后，向每个样本区域加入一到两滴封闭缓冲液，确保完全覆盖。接着，配制一毫升含一抗和封闭缓冲液的一抗混合液。弃去载玻片上残留的封闭缓冲液。

向每个切片加入两到三滴一抗混合液。孵育后，将玻片置于垂直架中，用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤五分钟。随后，制备一毫升二抗混合液，包含二抗和洗涤缓冲液。

将玻片重新放置于染色仪上，使用移液器向每个组织切片滴加两到三滴二抗混合液。随后，在摇床上用洗涤缓冲液清洗玻片三次，每次五分钟。接着，将玻片置于染色仪上，向每个组织切片滴加两到三滴 Hoechst 33342 溶液。

将切片置于垂直的染色架中，用洗涤缓冲液轻轻振荡冲洗5分钟。每张切片上加入一至两滴荧光封片剂，并用盖玻片封片。在10倍放大倍数下观察左心房与肺静脉连接处的肺静脉口区域、肺外静脉以及肺内静脉。

在40倍放大下，观察到肺静脉口、肺外静脉和肺内静脉中出现具有典型肌源性条纹的特异性cTnT信号。CX43在上述三个肺静脉区域均有发现，主要分布于相邻心肌细胞之间。在心肌袖状结构的心肌细胞中，CX43相关信号可见于细胞的极性侧和侧向边缘。