诱导多能干细胞来源的诱导型肌腱细胞的生成 通过 联合Scleraxis过表达与二维单轴拉伸

肌腱损伤是美国最常见的肌肉骨骼问题之一，每年影响约3300万人。我们的研究致力于开发一种细胞与组织工程方法来修复肌腱，从而显著改善患者的治疗效果。目前推动肌腱研究的技术包括使用来自不同来源的干细胞（如诱导多能干细胞），并结合生物反应器、基因工程生物材料以及其他组织工程技术，以模拟肌腱发育所需的微环境信号。

我们对肌腱如何从其起源发育而来的理解仍然有限。目前已知有多个在肌腱成熟过程中高度表达的基因，但遗憾的是，这些基因并非肌腱组织所特有。

这使得研究人员难以标准化地评估肌腱分化的成功与否。我们的方案利用了诱导性多能细胞（IPC）显著的分化潜能以及目前关于肌腱发育的认知。我们的目标是开发一种同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗的应用。

我们的实验室致力于阐明与肌腱细胞命运相关的信号通路，以更深入地理解肌腱的发育过程。我们希望将这些知识与组织工程技术及生物材料相结合，开发出比传统肌腱修复方法更有效的替代方案。在对两块硅胶板进行高压灭菌后，于无菌条件下从灭菌袋中取出硅胶板，并将其放入150毫米的培养皿中。

向每个硅胶板的孔中加入 400 微升纤连蛋白溶液。接着，将表达Scleraxis的诱导间充质基质细胞重悬于间充质基质细胞培养基中，并使用自动细胞计数仪计数活细胞。计算每平方厘米接种 1.25 × 10⁴ 个细胞所需的细胞悬液体积。

从15毫升锥形管中移除该体积的MSC拉伸培养基，并加入所需体积的scleraxis阳性诱导间充质基质细胞悬液。轻轻颠倒混匀管内液体，使细胞悬液均匀。向每块硅胶板的每个孔中加入400微升细胞悬液。

将盖子重新盖回150毫米培养皿上，并在37摄氏度下孵育24小时。进行单轴拉伸时，先用双蒸水冲洗拉伸装置，随后用70%乙醇冲洗。擦拭装置表面，将其放入细胞培养超净台中，并暴露于紫外光下照射15分钟。

接下来，将一块培养板放入培养箱中作为静态对照。将第二块带孔的硅胶板放入拉伸装置中，使螺丝与硅胶板上的孔对齐。然后，盖上装置的盖子。

将带有固定硅胶板的装置连接至电子源，并置于37摄氏度的培养箱中。设置循环拉伸程序为4%正弦应变，频率0.5赫兹，每日拉伸2小时。通过按下启动按钮开始拉伸。

在对表达scleraxis的诱导型间充质基质细胞进行机械加载时，过高的接种密度会导致细胞过早收缩和早期死亡。经过数天的拉伸后，与静态培养组中细胞的随机排列相比，在拉伸培养的表达scleraxis的诱导型间充质基质细胞中观察到一定程度的细胞有序排列。对肌动蛋白丝进行鬼笔环肽染色显示，细胞沿垂直于拉伸方向生长，而静态培养组中的细胞则呈随机排列。

基因表达分析显示，在第3天和第7天，与第0天的iMSCs相比，腱系基因显著上调。在拉伸7天后，与其他所有组相比，scleraxis阳性诱导的间充质基质细胞拉伸组在培养基中的胶原沉积显著更高。