Name: 通过联合巩膜过表达和 2D 单轴张力产生诱导多能干细胞衍生的 iTenocytes (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 了解通过慢病毒载体过表达Scleraxis并结合二维生物反应器单轴拉伸技术，从诱导多能干细胞衍生间充质基质细胞生成肌腱细胞的方法。该技术可增强肌腱相关基因表达并改善细胞功能，为肌腱组织工程提供有前景的治疗策略。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）K01AR071512 项目以及加州再生医学研究所（CIRM）DISC0-14350 项目对 Dmitriy Sheyn 的资助。两种慢病毒包装质粒由西蒙·诺特（Simon Knott）实验室（加州大学洛杉矶分校西达赛奈医学中心生物医学科学系）惠赠。

Harnessing iPSC-Derived iTenocytes for Effective Cell-Based Therapy

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<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiate+into+functional+mesenchymal+stem+cells+and+repair+bone+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).</li>
<li>Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenogenic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+dictated+by+properties+of+braided+submicron+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).</li>
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<li>Shukunami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleraxis+is+a+transcriptional+activator+that+regulates+the+expression+of+Tenomodulin%2C+a+marker+of+mature+tenocytes+and+ligamentocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).</li>
<li>Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tendon+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tendon cell fate during development.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).</li>
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<li>Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+and+ligament+regeneration+and+repair%3A+clinical+relevance+and+developmental+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+loading+models+for+tendon+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro loading models for tendon mechanobiology.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).</li>
<li>Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cellular+strain+models+of+tendon+biology+and+tenogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).</li>
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<li>Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+behavior+using+biophysical+and+biochemical+cues%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).</li>
<li>Papalamprou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+iPSC+differentiation+into+iTenocytes+using+combined+scleraxis+overexpression+and+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).</li>
<li>Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+tendon+reporters%2C+ScxGFP+and+ScxAP%2C+using+regulatory+elements+of+the+scleraxis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-based+product+characterization+for+clinical+trials%3A+an+FDA+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).</li>
<li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal%2Fstem+cells%3A+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+%28IFATS%29+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li>
<li>Dunkman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tendon+injury+response+is+influenced+by+decorin+and+biglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+scleraxis+synergistically+promote+the+commitment+of+human+ES+cells+derived+MSCs+to+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes.</a> Scientific Reports. 2, 977(2012).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neo-genesis+of+tendon%2Fligament-like+tissue+by+combination+of+mohawk+and+a+three-dimensional+cyclic+mechanical+stretch+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突需要披露。

在本实验方案中，诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的生成分为三个主要步骤：（1）将诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导为诱导性间充质干细胞（iMSCs）；（2）利用慢病毒载体过表达SCX；（3）通过二维单轴张力促进细胞成熟。
我们课题组此前已描述过将iPSCs诱导分化为iMSCs的实验方案2。自该论文发表以来，已开发出多种新方案，包括已用于临床试验的iMSCs标准化分化方案21,22,23，以及商业化的分化试剂盒。iMSCs的三系分化潜能此前也已有综述报道2。尽管不同方法之间存在差异，但所有方案均强调在诱导分化后需对iMSCs进行多代扩增，以确保间充质干细胞表面标志物的稳定表达。在此阶段，当细胞融合度达到约70%时以1:3的比例传代，传代后4–6天即可获得相对融合的培养板。
在选择最佳转导滴度时，必须在细胞活力和转导效率之间取得平衡。尽管使用100%滴度转导的iMSCs可能表现出最高比例的SCX-GFP阳性细胞，但值得注意的是，这些细胞在转导后经过三次传代即停止分裂（图3C），可能是由于DNA诱导的细胞毒性所致。因此，建议使用低于100%的滴度。在接种硅胶培养板之前，建议通过流式细胞术重新评估SCX-GFP的表达水平。如果数据显示转导效率低于预期阈值，则建议在接种前对iMSCSCX+ 细胞进行分选，尤其是在进行体内实验时。
将 iMSCSCX+ 细胞接种至硅胶培养板后，必须在 37 °C 条件下孵育过夜，以确保细胞充分贴壁后再进行拉伸。硅胶培养板中所述的 1.25 × 104 个细胞/cm2 的细胞密度经过优化，可防止单层细胞过度生长，从而避免产生静态张力24。此外，研究表明，在不同刚度的基质上，汇合培养中细胞间的直接接触可能改变细胞行为24,25,26。在预实验中，观察到部分细胞从硅胶板上明显脱落，尤其是在较晚的时间点（图 4D）。这可能是由于过度汇合导致细胞外基质（ECM）细胞片形成所致24。因此，关键参数包括细胞密度和拉伸循环次数。在本研究方法中，细胞在第 3 天和第 7 天收集，通过基因表达分析评估其成腱潜能。然而，建议将细胞在二维生物反应器中至少拉伸三天，并持续监测拉伸组与静态对照组的培养板，以防止过度生长和细胞脱落。
经过多次拉伸后，可观察到一定程度的细胞排列与组织化现象（图4C1，E）。这与许多研究结果一致，即在体外条件下，细胞在单轴应变作用下会垂直于应变轴方向排列in vitro24，27。相比之下，静态培养皿中的细胞呈现随机分布的组织模式（图4C2，E）。
据我们所知，目前仅有少数研究探讨了SCX过表达与机械刺激协同作用对间充质干细胞（MSCs）向腱细胞或韧带细胞分化的效应24,28,29。Gaspar等人采用了一种与本文所述相似的二维生物反应器系统，但施加了更高的总应变（每天12小时，10%应变，1 Hz）。有趣的是，他们未能检测到骨髓来源的MSCs和人源腱细胞中SCX、TNMD和COL1a1表达的变化。然而，这可能归因于其研究中所使用的较高应变水平24。Chen等人利用慢病毒载体在多层片状结构的人胚胎干细胞来源的MSCs（hESC-MSCs）中过表达SCX，并施加单轴循环载荷（每天2小时，10%应变，1 Hz，持续最长21天），观察到COL1a1、COL1a2、COL14和TNMD表达上调，并伴有细胞外基质（ECM）沉积增加29。Nichols等人则将全长小鼠Scx cDNA瞬时转染至C3H10T1/2细胞，并将细胞培养于三维胶原水凝胶中，施加单轴循环应变（每天30分钟，1%应变，1 Hz，最长14天）。与我们的研究结果类似，该团队发现，在施加应变且SCX过表达的条件下，SCX和COL1A1表达升高，但在周期性拉伸刺激下，TNMD的表达未发生改变28。
此外，考虑过表达其他与肌腱相关的标志物（如 MKX）也可能具有重要意义。Tsutsumi 等人研究了在 C3H10T1/2 细胞中过表达 MKX 并结合三维系统中周期性机械拉伸的联合效应。他们证明了 SCX、COL1a1、DCN 和 COL3a1 的显著上调，同时观察到胶原原纤维束和肌动蛋白丝的有序排列30。
必须承认，这种生成iTenocytes的方法存在一定的局限性。尽管市面上可获得的二维生物反应器在概念验证工作中具有优势，但其尺寸限制了细胞产量。如果需要将这些细胞用于高通量检测，或作为现成的肌腱修复治疗细胞来源，则应考虑探索能够在更大规模上实现单轴拉伸的培养系统。此外，还需进一步研究以扩大iTenocytes的扩增能力，验证其成腱基因表达的稳定性，并评估其在肌腱修复中的贡献 在体 再生能力对于评估其成腱潜能至关重要。

为应对肌腱和韧带修复中的当代难题，需要寻找一种适用于细胞治疗的合适细胞候选物。在组织工程领域，肌腱修复的一个研究方向是探索骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）和脂肪组织来源的基质细胞（ASCs）作为潜在策略。这些细胞具有多向分化潜能、来源丰富且在体内具备再生潜力in vivo。此外，它们在动物模型中已显示出增强的愈合能力和改善的功能性结果1。然而，这些细胞存在自我更新能力有限、表型异质性以及尤为突出的肌腱形成能力不足等问题。诱导性多能干细胞（iPSC）技术因其卓越的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，为克服上述限制提供了可能。本研究团队及其他研究者已成功将iPSC定向分化为类似间充质基质细胞的细胞（iMSCs）2,3。因此，iMSCs有望成为异体来源的肌腱细胞治疗应用的新选择。
Scleraxis（SCX）是一种对肌腱发育至关重要的转录因子，被认为是可检测到的最早期分化肌腱细胞标志物。此外，SCX 可激活下游的肌腱分化标志物，包括I型胶原α1链（COL1a1）、Mohawk（MKX）和Tenomodulin（TNMD）等4,5,6。在肌腱成熟过程中表达的其他基因还包括微管聚合促进蛋白家族成员3（TPPP3）和血小板源性生长因子受体α（PDGFRa）7。尽管这些基因对肌腱的发育和成熟至关重要，但遗憾的是它们并非肌腱组织所特有，也在骨或软骨等其他肌肉骨骼组织中表达5,7。
除了肌腱发育过程中标志物的表达外，机械刺激也是胚胎期肌腱发育和修复的关键因素4,5,6。肌腱具有力学响应性，其生长模式会随环境变化而改变。在分子层面，生物力学信号影响腱细胞的发育、成熟、维持及修复反应8。已有多种生物反应器系统被用于模拟生理负荷和生物力学信号。这些模型系统包括离体（ex vivo）组织加载、应用于细胞的二维（2D）双向或单向拉伸加载系统，以及利用支架和水凝胶的三维（3D）系统9,10。在研究机械刺激对腱特异性基因表达或细胞形态（在细胞命运背景下）的影响时，2D系统具有优势；而3D系统则能更准确地模拟细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用9,10。
在二维加载系统中，细胞与培养基质之间的应变是均匀的，这意味着可以完全控制施加在细胞骨架上的载荷。与双轴加载相比，单轴加载更具生理相关性，因为腱细胞在体内主要受到来自胶原纤维束的单轴加载in vivo9。研究发现，在日常活动中，肌腱所承受的单轴拉伸载荷可高达6%的应变11。具体而言，先前的研究表明，在4%–5%的生理应变范围内加载可促进成腱分化，表现为维持腱相关标志物（如SCX和TNMD）的表达以及增加胶原蛋白的生成9,10。超过10%的应变可能具有创伤相关性，但不具生理相关性12,13。
在此，我们介绍一种方案，该方案考虑了机械刺激与生物刺激的协同效应，这种协同效应可能对肌腱细胞的生成至关重要。我们首先描述了一种可重复的方法，用于将诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导为诱导性间充质干细胞（iMSCs） 通过 短时间暴露类胚体于生长因子，通过流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物加以验证。随后，我们详细描述了一种慢病毒转导方法，用于构建稳定过表达SCX的iMSC（诱导性间充质干细胞）SCX+）。为进一步促进细胞成熟，iMSCSCX+ 接种于纤维连接蛋白包被的硅胶培养板中，并使用CellScale MCFX生物反应器进行优化的单轴拉伸处理。通过检测早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原沉积，验证了其向肌腱分化的潜能。14该方法生成诱导性肌腱细胞是一种概念验证，可能为肌腱细胞治疗应用提供一种无限、即用型、同种异体的细胞来源。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Thermofisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD105</td><td>Ancell</td><td>326-050</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的小鼠抗人CD44抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>APC标记的小鼠IgG2K同型对照抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark胎牛血清</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>双糖链蛋白聚糖（Biglycan）</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00959143_m1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3733</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原人α1链TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00164004_m1</td><td></td></tr><tr><td>III型胶原人α1链TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺，无酚红</td><td>Thermofisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>伊格尔最低必需培养基（EMEM）</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的小鼠抗人CD90抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG1-PE</td><td>Bio-Rad</td><td>STAR117</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T/17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>IMDM，无酚红</td><td>Thermofisher</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>iPSCs: 83i-cntr-33n1</td><td>Cedars-Sinai iPSC核心设施</td><td>N/A</td><td>https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/</td></tr><tr><td>同型对照抗体，小鼠IgG2a-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-271</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>Thermofisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermofisher</td><td>2503081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>MechanoCulture FX</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td>拉伸装置</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液</td><td>Thermofisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mohawk人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00543190_m1</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>血小板源性生长因子受体A人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00998018_m1</td><td></td></tr><tr><td>聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene感染/转染试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>重组人&amp;nbsp;TGF-β1蛋白人TaqMan引物</td><td>RnD Systems</td><td>240-B</td><td></td></tr><tr><td>Scleraxis人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03054634_g1</td><td></td></tr><tr><td>SCXA（SCX）（NM_00108050514）人标签ORF克隆</td><td>OriGene</td><td>RC224305L4</td><td></td></tr><tr><td>硅胶培养板</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>腱生蛋白C人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00370384_m1</td><td></td></tr><tr><td>腱调节蛋白人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00223332_m1</td><td></td></tr><tr><td>血小板反应蛋白4人TaqMan引物</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00170261_m1</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂BioT</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>B01-01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Thermofisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白聚合促进蛋白家族成员3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043892_m1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二盐酸盐</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导多能干细胞来源的诱导型肌腱细胞的生成 通过 联合scleraxis过表达与二维单轴拉伸

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

当前肌腱与韧带修复面临的挑战迫切需要确定一种适合且有效的基于细胞的治疗候选方案，以促进肌腱再生。间充质基质细胞（MSCs）已被探索作为肌腱修复的一种潜在组织工程策略。尽管这类细胞具有多向分化潜能和再生潜力 体内，它们的自我更新能力有限，且表现出表型异质性。诱导性多能干细胞（iPSCs）由于具有高度的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，能够克服这些局限。在腱细胞发育过程中，Scleraxis（Scx）是肌腱分化的关键直接分子调控因子。此外，机械调控已被证实是引导胚胎期肌腱发育与修复的核心因素。因此，我们开发了一种实验方案，以包载生物学刺激与机械刺激的协同效应，这可能对生成腱细胞至关重要。首先将iPSCs诱导转化为间充质基质细胞（iMSCs），并通过流式细胞术检测经典的间充质基质细胞标志物对其进行表征。随后，利用慢病毒载体对iMSCs进行转导，使其稳定过表达SCX（iMSCSCX+ 这些iMSCSCX+ 细胞可通过使用二维生物反应器施加单轴拉伸负荷，进一步成熟为诱导型肌腱细胞（iTenocytes）。通过观察早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原蛋白沉积，对所得细胞进行表征。该诱导生成iTenocytes的方法可帮助研究人员开发一种潜在无限、即用型的同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗应用。

人iPSC向iMSC的分化 
如先前所述，将iPSC分化为iMSC的现有方案涉及拟胚体的形成2。该过程约需十天即可从iPSC诱导生成iMSC（图1A）。然而，强烈建议对新生成的iMSC至少传代两次。这不仅有助于避免使用明胶包被的培养板，还能建立稳定的MSC表型表达。分化后经六次传代进行的流式细胞术定量分析显示，细胞群体几乎均一，高表达经典的MSC表面标志物，包括CD44（83.1%）、CD90（88.4%）和CD105（99.2%）17,18（图1B）。在形态学方面，iMSC应与骨髓来源的MSC高度相似，呈细长的成纤维细胞样形态（图1C）。
利用慢病毒转导技术对iMSCs进行基因工程改造以过表达SCX 
通过将pLenti-C-mGFP载体（其中已插入SCXB以表达SCX-GFP+）及两种包装质粒共转染至HEK293T/17细胞中来产生慢病毒。转染采用BioT法15,16，BioT（µl）与DNA（µg）的用量比为1.5:1。
转染前18-24小时，将HEK293T/17细胞以5.3 × 104 个细胞/cm2的密度接种。转染时，细胞融合度应达到80%-95%，以避免转染效率低下（图2B1，左图）。加入质粒混合物后24小时内可观察到一定程度的细胞毒性，48小时时达到峰值（图2B2）。由于SCX慢病毒载体与GFP偶联，因此在转染后48小时应可观察到GFP表达（图2B3）。高水平的细胞毒性结合GFP表达是转染成功的可靠指标。慢病毒颗粒分别在转染后48小时和72小时收集，并通过流式细胞术和基因表达分析评估转导效率。GFP阳性细胞的绝对荧光强度被用作SCX整合拷贝数的替代指标，在高滴度条件下显著升高（图3A）。转导效率以SCX-GFP+细胞所占百分比表示，显示出基于慢病毒载量的剂量-反应效应（图3B）。不同传代次数的iMSCSCX+ 流式细胞术检测结果也显示其具有高度稳定性，外源基因表达水平及转导细胞比例均无变化（图3C）。此外，在未经分选、常规培养4周后，iMSCSCX+ 仍维持SCX的稳定高表达（图3D）。大规模转导实验根据病毒滴度进行，使用了75%的慢病毒上清（图2C）。
iMSCSCX+的机械加载 
将iMSCSCX+ 细胞以1.25 × 104 个细胞/cm2的密度接种于可变形的硅胶板上（图4A、B），以在启动拉伸程序前允许细胞贴附。最终接种密度经过优化，以防止单层细胞过度生长。值得注意的是，过高的接种密度会导致细胞过早收缩和早期死亡（图4D）。对于静态对照组，细胞接种于相同的板中，但不进行任何拉伸处理。iMSCSCX+ 细胞在二维生物反应器中接受拉伸处理，持续至少三天，最长七天，拉伸参数为4%单轴应变、0.5 Hz，每天2小时。该拉伸方案与文献中描述的生理相关条件一致9。经过数天拉伸后，与呈现随机排列的静态组相比，可观察到一定程度的细胞有序排列（图4C）。对肌动蛋白纤维进行鬼笔环肽染色进一步显示，细胞趋向于垂直于拉伸方向生长，而静态组的细胞则呈随机排列（图4E）。为了表征新生成的诱导型肌腱细胞（iTenocytes），在拉伸后第3天和第7天收集细胞进行基因表达分析，方法如先前报道14。基因表达分析表明，iMSCSCX+ 细胞具有力学响应性，与第0天的iMSCs相比，在第3天和第7天均显著上调了肌腱生成相关基因（SCX、THBS4、COL1a1、BGN、MKX和TPPP3）的表达5,7,19,20（图5A）。此外，在拉伸7天后，iMSCSCX+ 拉伸组培养基中的胶原沉积量显著高于所有其他组（图5B）。
<img alt="iPSC 分化过程，包括 CD44/CD105/CD90 分析；二维生物反应器及细胞扩增。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：iMSC 分化示意图及流式细胞术表征。（A）iTenocyte 生成的整体示意图及 iMSC 诱导的时间线。经 Papalamprou A. 等人14许可转载。（B）流式细胞术定量结果显示，在分化后经过6代传代的iPSC来源的MSCs中，表达经典MSC表面标志物的细胞比例较高。经 Sheyn D. 等人2许可改编。（C）分化后细胞的相差显微图像显示成纤维细胞样形态。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="慢病毒转染过程示意图及iPSC向iTenocyte的分化；GFP荧光图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：iMSCSCX+ 生产示意图 (A) 使用2进行转染的整体示意图nd 生成SCX慢病毒载体并转导iMSCs。经Papalamprou A.等人许可转载。14. (B1) 加入质粒混合物前的 HEK293T/17 细胞。B2) HEK293T/17 细胞在 48 小时后表达 GFP 并表现出毒性。 (B3在HEK293T/17细胞中可观察到GFP的表达，表明转染成功。C) 诱导生成的iMSCSCX+ 细胞（滴度为75%）表达SCX-GFP+ 细胞核内。比例尺 = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑效率分析；柱状图、小提琴图、流式细胞术；载体滴度测定；GFP荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过流式细胞术和基因表达测定转导效率。 使用流式细胞术检测GFP阳性细胞的绝对荧光强度，作为SCX整合的替代指标。通过流式细胞术分析所有细胞以验证载体滴度，评估慢病毒的感染复数（MOI）。(A) 每病毒滴度对应的绝对荧光强度。(B) 转导效率以SCX-GFP+细胞所占百分比表示。当流式结果以GFP+细胞百分比呈现时，可观察到慢病毒载量对转导效率的剂量-反应效应。MOI，感染复数，n = 3次独立转导实验。采用单因素方差分析比较不同滴度；数据表示为均值 ± 标准差；*p &lt; 0.05。(C) iMSCSCX+ 在多次传代后的流式细胞术结果显示，稳定转基因表达水平及转导细胞比例均无变化。需注意，以100%滴度转导的iMSCs在P3代停止增殖。(D) 使用SCX-GFP+慢病毒载体（75%，MOI = 2.9 e5 TU/mL）转导iMSCs，并在未分选的情况下常规培养4周后检测SCX基因表达。结果显示，iMSCSCX+中SCX表达显著上调，表明在4周后仍维持SCX的稳定过表达。TU，转导单位；数据表示为均值 ± 标准差，**p &gt; 0.01。转载自Papalamprou A. 等人14，经许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过二维生物反应器将iMSC转化为iTenocytes。显微镜显示静态/拉伸培养的效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：接种至二维生物反应器中的iMSCSCX+接受周期性拉伸。（A）二维生物反应器示意图。经Papalamprou A. 等人12许可转载。（B）首先将细胞接种至柔性硅胶板中，并在37 °C下孵育，以在二维生物反应器中进行周期性拉伸前促进细胞贴壁。（C）iMSCSCX+在二维生物反应器中接受长达7天的拉伸处理。静态对照组细胞接种于相同培养板中，但不施加拉伸。（C1）静态对照组培养板在培养7天后显示细胞呈随机排列。（C2）拉伸组培养板在7天后显示出相对更有序的细胞排列。（D）三种不应出现的情况示例。当细胞接种密度过高或拉伸时间过长时，细胞开始脱落。（D1）细胞轻微过度生长。黄色箭头指示细胞提前收缩的起始迹象。（D2）中度过度生长。细胞开始从培养板上脱落。（D3）严重过度生长。细胞不再以单层形式生长，并已形成三维结构。黑色标尺= 400 µm。白色标尺= 1000 µm。（E）经过7天拉伸（或静态培养板相应培养时间）后，使用鬼笔环肽固定细胞以标记肌动蛋白纤维（红色），并用DAPI复染细胞核（蓝色）。白色标尺= 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="iMSC细胞中基因表达的柱状图分析；SCX、THBS4、BGN、蛋白水平、实验图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5通过Scx过表达和在二维生物反应器中施加单轴拉伸刺激腱源性标志基因的表达 (A) iMSCSCX+ 在二维生物反应器中拉伸培养7天。静态对照组细胞接种于相同的培养板中，但不进行拉伸。基因表达分析显示，iMSCSCX+ 具有机械响应性。ND = 未检出。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较每个时间点的基因表达水平。 与. d0。N = 8/组。B二维生物反应器中拉伸7天后的胶原沉积。数据以均值 ± 标准差表示；n = 每组8个样本； *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001。经 Papalamprou A. 等人许可转载。12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过联合使用慢病毒载体过表达Scleraxis并施加单轴拉伸，由iPSC来源的间充质基质细胞生成诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的方法。 通过 二维生物反应器

诱导多能干细胞来源的诱导型肌腱细胞的生成 通过 联合Scleraxis过表达与二维单轴拉伸

当前肌腱与韧带修复面临的挑战迫切需要确定一种适合且有效的细胞治疗候选方案，以……

肌腱损伤是美国最常见的肌肉骨骼问题之一，每年影响约3300万人。我们的研究致力于开发一种细胞与组织工程方法来修复肌腱，从而显著改善患者的治疗效果。目前推动肌腱研究的技术包括使用来自不同来源的干细胞（如诱导多能干细胞），并结合生物反应器、基因工程生物材料以及其他组织工程技术，以模拟肌腱发育所需的微环境信号。我们对肌腱如何从其起源发育而来的理解仍然有限。目前已知有多个在肌腱成熟过程中高度表达的基因，但遗憾的是，这些基因并非肌腱组织所特有。这使得研究人员难以标准化地评估肌腱分化的成功与否。我们的方案利用了诱导性多能细胞（IPC）显著的分化潜能以及目前关于肌腱发育的认知。我们的目标是开发一种同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗的应用。我们的实验室致力于阐明与肌腱细胞命运相关的信号通路，以更深入地理解肌腱的发育过程。我们希望将这些知识与组织工程技术及生物材料相结合，开发出比传统肌腱修复方法更有效的替代方案。在对两块硅胶板进行高压灭菌后，于无菌条件下从灭菌袋中取出硅胶板，并将其放入150毫米的培养皿中。向每个硅胶板的孔中加入 400 微升纤连蛋白溶液。接着，将表达Scleraxis的诱导间充质基质细胞重悬于间充质基质细胞培养基中，并使用自动细胞计数仪计数活细胞。计算每平方厘米接种 1.25 × 10⁴ 个细胞所需的细胞悬液体积。从15毫升锥形管中移除该体积的MSC拉伸培养基，并加入所需体积的scleraxis阳性诱导间充质基质细胞悬液。轻轻颠倒混匀管内液体，使细胞悬液均匀。向每块硅胶板的每个孔中加入400微升细胞悬液。将盖子重新盖回150毫米培养皿上，并在37摄氏度下孵育24小时。进行单轴拉伸时，先用双蒸水冲洗拉伸装置，随后用70%乙醇冲洗。擦拭装置表面，将其放入细胞培养超净台中，并暴露于紫外光下照射15分钟。接下来，将一块培养板放入培养箱中作为静态对照。将第二块带孔的硅胶板放入拉伸装置中，使螺丝与硅胶板上的孔对齐。然后，盖上装置的盖子。将带有固定硅胶板的装置连接至电子源，并置于37摄氏度的培养箱中。设置循环拉伸程序为4%正弦应变，频率0.5赫兹，每日拉伸2小时。通过按下启动按钮开始拉伸。在对表达scleraxis的诱导型间充质基质细胞进行机械加载时，过高的接种密度会导致细胞过早收缩和早期死亡。经过数天的拉伸后，与静态培养组中细胞的随机排列相比，在拉伸培养的表达scleraxis的诱导型间充质基质细胞中观察到一定程度的细胞有序排列。对肌动蛋白丝进行鬼笔环肽染色显示，细胞沿垂直于拉伸方向生长，而静态培养组中的细胞则呈随机排列。基因表达分析显示，在第3天和第7天，与第0天的iMSCs相比，腱系基因显著上调。在拉伸7天后，与其他所有组相比，scleraxis阳性诱导的间充质基质细胞拉伸组在培养基中的胶原沉积显著更高。

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