小鼠双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤模型

摘要

缺血-再灌注损伤（IRI）模型可用于急性肾损伤（AKI）发展的不同阶段，尤其是在AKI向慢性肾病（CKD）进展的过程中。本文介绍了通过经腹途径在小鼠中建立IRI模型的操作步骤，即使用血管夹夹闭肾蒂以诱导缺血性损伤。

摘要

急性肾损伤（AKI）是指肾功能迅速下降的一种病理状态，由于肾单位不可逆地丧失及其适应不良的修复，持续的肾功能障碍会逐渐进展为慢性肾病（CKD）。近年来，AKI 的发病率呈上升趋势，其病因多样，包括容量不足、脓毒症、肾毒性、肌肉损伤和重大创伤等，其中缺血-再灌注损伤（IRI） 是导致大多数 AKI 发作的主要原因。小鼠 IRI 模型通过手术夹闭肾蒂来建立，为 AKI 的临床前研究提供了强大且可控的实验工具。尤为重要的是，该模型可用于模拟 AKI 发展过程中的不同阶段，特别是在 AKI 向 CKD 转变的过程中。尽管 IRI 模型已在众多实验室中广泛应用，但仍存在一系列变量会影响该模型的实验结果。本文详细描述了 IRI 模型的建立步骤，旨在为研究人员提供一种可重复且可靠的方法，以深入探究 AKI 发生机制及其向 CKD 进展的病理过程。

引言

急性肾损伤（AKI）是一种严重的临床综合征，具有显著的发病率和死亡率，其定义为48小时内血清肌酐升高≥0.3 mg/dL（26.5 µM/L），或7天内血清肌酐升高至基线值的≥1.5倍，或尿量<0.5 mL/kg/h持续6小时^1,2,3。尽管已有数十年的研究，目前仍缺乏有效的AKI治疗手段以减轻肾脏损伤或促进肾功能恢复，且相当比例的AKI患者会进展为慢性肾脏病（CKD）^4,5,6。AKI的发生及其进展涉及复杂的分子和信号通路，因此，临床前模型为解析这些复杂机制、开发高效治疗策略提供了有力工具。

临床上，缺血-再灌注损伤（IRI）是多种情况下急性肾损伤（AKI）的主要病因，包括心脏和肝脏手术、循环性休克、容量耗竭、脓毒症、肾血管闭塞或梗阻、肾移植等⁷。IRI-AKI小鼠模型自20世纪60年代起开始使用，该模型通过使用无创血管夹夹闭小鼠肾蒂以诱导缺血，随后松开血管夹恢复肾脏血流，实现再灌注。IRI-AKI模型通常表现为肾小管上皮细胞死亡及进行性肾组织损伤。....

方案

采用8周龄、体重25 g的雄性C57BL/6J小鼠，通过双侧缺血-再灌注建立急性肾损伤（AKI）模型。根据既往研究，手术过程中维持小鼠体温在约36.5 °C–37 °C，缺血再灌注损伤（IRI）手术中肾脏缺血时间为30 min^12,13。每组需要6只小鼠，假手术小鼠作为对照。本研究中的动物实验已获得浙江大学实验动物福利与使用委员会（IACUC）的批准，以保障实验动物的福利。所有动物实验操作均遵循浙江大学的伦理准则与原则。

1. 术前准备

1. 将所有手术器械进行高压灭菌。
2. 在7.6 mL无菌生理盐水中加入2 mL氯胺酮和0.4 mL甲苯噻嗪，配制麻醉液。通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（16 mg/kg）混合物进行麻醉。使用脚趾夹捏反射评估麻醉深度。
3. 将麻醉后的小鼠置于恒温毯上，确保其气道保持通畅。维持体温在36.5–37 °C范围内。
4. 用1%盐酸四环素眼膏覆盖小鼠眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
5. 使用毛发剪剃除腹部毛发，并用聚维酮碘溶液对术区皮肤消毒3次。

2. 手术

1. 使用手术剪通过....

结果

手术期间肾脏的状态

成功缺血的特征是肾脏在1-2分钟内由红色逐渐变为深紫色，成功再灌注的特征是肾脏在1-2分钟内由深紫色逐渐恢复为红色。

术后肾脏组织学

苏木精-伊红（HE）染色和过碘酸-雪夫（PAS）染色是验证急性肾损伤的直接方法。在缺血-再灌注损伤模型中，主要受损部位为近端小管的S3节段。肾小管损伤的经典表现包括明显的小管扩张和结构破坏、刷状缘丢失、脱落碎片以及细胞凋亡。小管损伤程度还通过受损小管所占百分比进行盲法评分：评分0分，无损伤；评分1分，<25%的小管受损；评分2分，25%–50%的小管受损；评分3分，50%–75%的小管受损；评分4分，>75%的小管受损。我们证实了缺血诱导的急性肾损伤（AKI）中存在典型的肾小管病理改变，并观察到小管损伤评分升高（图1A-B）。

讨论

本文中，我们详细介绍了肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型的建立步骤，并进一步阐明该模型是研究急性肾损伤（AKI）及其向慢性肾病（CKD）进展的可靠模型。此外，我们展示了评估肾脏损伤的两个主要指标——肾脏组织学和肾功能——所受到的影响。

在手术操作中，有几个关键点需要强调，以确保模型的可重复性和可靠性。对于腹部手术，建议采用正中切口暴露肾脏，以尽量减少手术相关创伤。由于肾蒂周围存在后腹膜脂肪，完全游离肾蒂较为困难，因此应使用镊子从肾脏后方来回将肾蒂从脂肪组织中剥离。此外，建议使用相同的血管夹以保持手术过程的稳定性，并注意观察血管夹在使用过程中是否存在磨损。另外，由于术中液体丢失可能加重肾脏损伤，因此通过补充生理盐水防止小鼠脱水也十分重要。

在缺血-再灌注损伤（IRI）的手术操作中，有几个重要的故障排除方法需要强调。首先，在分离肾脏及其血管蒂时，难以处理肾脏出血问题。大多数出血可通过充分压迫渗血点来控制，但若出血量> 0.5 mL，则可能引发失血性休克。此时应实施安乐死，并将该小鼠排除出研究。其次，需注意肾脏缺血不完全的问题.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物毛发剪毛器	FEIYUBIO	19-7002
1 ml 注射器	Longreen	SR60061
乙醇	Macklin	E885996
纱布	FEIYUBIO	19-5022
恒温监测系统	Warmmate	40 x 50
持针器	DKBT	CZQ-00160
涂布棒	RWD	R22029-03
无菌生理盐水	Biosharp	BL158A
组织剪刀	DKBT	DC-YKJ1002
组织镊子	DKBT	DK079904
血管夹	Fine Science Tools	18055-02
薇乔缝合线	上海金环	4 -0