Name: 基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习使用功能化磁珠从生物流体中高效分离细胞外囊泡，结合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，加速癌症和帕金森病等疾病的生物标志物发现，为液体活检和临床诊断提供可靠方法。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为3RF1AG064250和R44CA239845。

所有尿液样本均在知情同意后从健康个体采集。实验符合涉及人类样本的所有伦理标准，并遵守普渡大学人类研究保护计划的指南。
1. 样品采集
<ol>
	<li>将12 mL尿液样本在15 mL锥形离心管中以2,500 × g、4 °C离心10分钟，以去除细胞碎片和较大的凋亡小体。</li>
	<li>将上清液10 mL转移至新的15 mL离心管中，继续进行细胞外囊泡（EV）的分离。 
	&#8203;注意：此步骤可暂停，样本可在-80 °C保存，使用时于37 °C解冻。</li>
</ol>
2. 使用 EVtrap 方法分离细胞外囊泡
<ol>
	<li>根据制造商说明书，向样品中加入 0.5 mL 上样缓冲液（体积比 1:10）和 100 µL EVtrap 磁珠悬液（体积比 1:50）。</li>
	<li>将样品在室温下以翻转旋转方式孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 15 mL 圆锥形离心管置于磁力分离架上，使样品沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL 洗涤缓冲液重悬磁珠，并将悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。轻轻吹打以重悬结合了 EV 的磁珠。</li>
	<li>将微量离心管置于 1.5 mL 微量离心管磁力分离架上，吸除上清液。使用 P200 移液器彻底吸走上清液，避免吸到磁珠。</li>
	<li>用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤磁珠。吸走上清液后应立即加入缓冲液，防止磁珠干燥。</li>
	<li>在室温下用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤磁珠 2 次。</li>
	<li>将磁珠与 100 µL 新鲜配制的 100 mM 三乙胺在室温下孵育 10 分钟，并使用 1.5 mL 微量离心管磁力分离架收集含有 EV 的洗脱液。 
	注意：配制 1 mL 100 mM 三乙胺溶液时，需将 14 µL 三乙胺溶于水中。</li>
	<li>重复步骤 2.8，合并洗脱液。使用真空离心浓缩仪在 4 °C 下将洗脱液干燥。 
	注意：实验可在此处暂停。干燥后的 EV 样品可在 -80 °C 下保存数月，不会对后续步骤或实验结果产生不利影响。</li>
</ol>
3. 通过蛋白质印迹法对细胞外囊泡进行表征
<ol>
	<li>将5%的干燥EV样品（相当于0.5 mL尿液样品）重悬于20 µL含10 mM二硫苏糖醇（DTT）的1x十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液中。 
	注：来自0.5 mL尿液的EV足以在Western blot中检测到CD9（一种EV标志物24）信号。</li>
	<li>在95 °C下煮沸样品5分钟。将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶，并按照标准方案进行电泳和免疫印迹25。</li>
	<li>将蛋白转移至低荧光聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的Tris-缓冲盐水吐温-20（TBST）溶液在室温下封闭1小时。配制1 L TBST缓冲液时，加入19 mM Tris碱、137 mM NaCl和1 mL吐温-20，用HCl调节pH至7.4。</li>
	<li>用含1% BSA的TBST溶液将膜与兔抗CD9抗体以1:5,000比例在4 °C孵育过夜，或在室温孵育2小时。</li>
	<li>用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。将膜与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗以1:5,000比例溶于含1% BSA的TBST溶液中，在室温孵育1小时。</li>
	<li>用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。将商品化的增强型化学发光（ECL）底物（1:1比例）加入膜上，并在化学发光成像系统中检测信号。</li>
</ol>
4. 蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析的样品制备
<ol>
	<li>配制新鲜的裂解缓冲液，其中包含 12 mM 脱氧胆酸钠（SDC）、12 mM 月桂酰基肌氨酸钠（SLS）、100 mM 三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）、10 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）、40 mM 氯乙酰胺（CAA）和 1× 磷酸酶抑制剂混合物。 
	注意：储备液的配制详见材料表的描述。根据所需体积，将各储备液加入以获得目标浓度，从而配制裂解缓冲液。</li>
	<li>将干燥的细胞外囊泡（EV）样品溶于 100 µL 裂解缓冲液中，在 95 °C 下加热 10 分钟，同时以 1,100 rpm 振荡。</li>
	<li>将样品冷却至室温后，加入 400 µL 的 50 mM TEAB，稀释五倍。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。以用 50 mM TEAB 稀释五倍的裂解缓冲液作为空白对照。</li>
	<li>按 1:50（酶与蛋白质量比）加入胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶（trypsin/Lys-C）混合酶，37 °C 振荡孵育过夜（1,100 rpm）。</li>
	<li>加入 50 µL 的 10% 三氟乙酸（TFA）对样品进行酸化。</li>
	<li>向样品中加入 600 µL 乙酸乙酯，涡旋混合 2 分钟。</li>
	<li>在 20,000 × g 条件下离心 3 分钟，移除上层有机相。吸取时避免扰动界面。</li>
	<li>重复步骤 4.7–4.8。使用真空离心浓缩仪干燥水相。</li>
	<li>将干燥的样品重悬于 200 µL 含 0.1% TFA 的溶液中，用于酸化肽段，并按照制造商说明书使用 C18 脱盐柱进行脱盐。先用 200 µL 含 0.1% TFA 的 80% 乙腈溶液平衡脱盐柱，随后用 200 µL 含 0.1% TFA 的溶液重复洗涤两次。将酸化后的肽段样品加载至脱盐柱，再用 200 µL 含 0.1% TFA 的溶液洗涤三次。最后用 200 µL 含 80% 乙腈和 0.1% TFA 的溶液洗脱肽段。</li>
	<li>使用真空离心浓缩仪干燥洗脱液。将其中 2% 的肽段样品（相当于 0.2 mL 尿液样品）单独干燥，用于蛋白质组学分析；其余 98% 的样品用于磷酸化蛋白质组学分析。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用磷酸化肽段富集试剂盒从样品中富集磷酸化肽段。按以下步骤进行富集操作：
	<ol>
		<li>将干燥的样品重悬于 200 µL 上样缓冲液中。向样品中加入 50 µL 磁珠，室温剧烈振荡 20 分钟。将含磁珠的样品加载至带滤芯的脱盐柱，于 100 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>依次用 200 µL 上样缓冲液、洗涤缓冲液 1 和洗涤缓冲液 2 洗涤脱盐柱。每次洗涤均以 20 × g 离心 2 分钟，再以 100 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>将带有磁珠的脱盐柱转移至新的离心管中，用于收集洗脱的磷酸化肽段。向脱盐柱中加入 50 µL 洗脱缓冲液，20 × g 离心 2 分钟；再次加入 50 µL 洗脱缓冲液，20 × g 离心 2 分钟；最后以 100 × g 离心 1 分钟，完成最后一次收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用真空离心浓缩仪干燥富集得到的磷酸化肽段。</li>
</ol>
5. 液相色谱-串联质谱分析
注意：可使用不同的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统/设置和数据采集方法，例如数据依赖性采集（DDA）。
<ol>
	<li>用0.1%甲酸（溶剂A）重悬干燥的蛋白质组/磷酸化蛋白质组样品，并根据制造商说明上样。</li>
	<li>通过液相色谱（LC）系统将样品注入捕获离子淌度飞行时间质谱仪，采用预设的标准Whisper每日40个样品方法。肽段在一根15 cm C18色谱柱（内径75 µm，粒径1.9 µm）上进行分离，该色谱柱详见材料表。</li>
	<li>进行蛋白质组学分析时，采用平行累积-串联碎裂结合数据非依赖性采集（dia-PASEF）模式，每个扫描周期的质荷比范围为300–1200 m/z，离子淌度范围为0.6–1.50 1/K0，循环时间为1.38 s。</li>
	<li>进行磷酸化蛋白质组学分析时，采用dia-PASEF采集模式，每个扫描周期的质荷比范围为400–1550 m/z，离子淌度范围为0.6–1.50 1/K0，循环时间为1.38 s。</li>
	<li>将原始文件载入蛋白质组学软件，采用无需谱图库的数据非依赖性采集工作流程进行信号提取、鉴定和定量。
	<ol>
		<li>搜索参数设置：使用Homo sapiens数据库，酶切类型为胰蛋白酶/P，最短肽段长度为7，最长肽段长度为52，允许最多两次漏切，半胱氨酸的羧甲基化作为固定修饰，蛋白N端乙酰化、甲硫氨酸氧化以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化（仅磷酸化蛋白质组学分析）作为可变修饰，最多允许5个可变修饰位点。将肽段-谱图匹配（PSM）、肽段和蛋白组的错误发现率（FDR）均设为0.01。 
		注意：本实验方案使用Spectronaut软件。其他常用的数据非依赖性采集分析软件如DIA-NN和PEAKS也可使用。若数据采用DDA模式采集，则可使用MaxQuant和Proteome Discoverer等软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhancing EV Isolation for Precise Biofluid Analysis

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Maacha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles-mediated+intercellular+communication%3A+roles+in+the+tumor+microenvironment+and+anti-cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance.</a> Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).</li>
<li>van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Becker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((extracellular+vesicles+in+cancer%3A+cell-to-cell+mediators+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis.</a> Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).</li>
<li>Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+extracellular+vesicles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer.</a> Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).</li>
<li>Urabe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).</li>
<li>Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+and+Their+Roles+in+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression.</a> Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).</li>
<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li>
<li>Harsha, H. C., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics in cancer.</a> Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).</li>
<li>Singh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation%3A+Implications+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation: Implications in Cancer.</a> Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).</li>
<li>Delom, F., Chevet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+analysis%3A+from+proteins+to+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes.</a> Proteome Sci. 4, 15(2006).</li>
<li>Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+strategies+for+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analytical strategies for phosphoproteomics.</a> Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Zeringer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+extraction+and+RNA+profiling+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Methodol%22%5BJournal%5D)">Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes.</a> World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+A33+immunoaffinity-purified+exosomes+released+from+the+human+colon+tumor+cell+line+LIM1215+reveals+a+tissue-specific+protein+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).</li>
<li>Enderle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+from+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+isolated+by+a+novel+spin+column-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).</li>
<li>Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Phosphoproteome+Capture+and+Analysis+from+Urinary+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles.</a> J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).</li>
<li>Iliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-derived+extracellular+vesicle+phosphoproteomics+through+chemical+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification.</a> J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).</li>
<li>Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analyses+of+kinase-dependent+tyrosine+phosphoproteomes+based+on+metal+ion-functionalized+soluble+nanopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).</li>
<li>Hadisurya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+extracellular+vesicles+define+diagnostic+and+prognostic+biosignatures+for+Parkinson%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease.</a> Commun Med. 3 (1), 64(2023).</li>
<li>Hadisurya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-independent+acquisition+phosphoproteomics+of+urinary+extracellular+vesicles+enables+renal+cell+carcinoma+grade+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation.</a> Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).</li>
<li>Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+phosphoproteomics+in+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications.</a> Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+web-based+compendium+of+exosomal+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Res Int. 2018, (2018).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+relative+quantitation+of+proteins+using+tandem+mass+tags+%28TMT%29+and+mass+spectrometry+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS).</a> Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).</li>
<li>Charles Jacob, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+early+pancreatic+cancer+biomarkers+KIF5B+and+SFRP2+from+%E2%80%9Cfirst+contact%E2%80%9D+interactions+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clinl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment.</a> J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).</li>
<li>Nunez Lopez, Y. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+proteomics+and+phosphoproteomics+identify+pathways+for+increased+risk+in+patients+hospitalized+with+COVID-19+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).</li>
<li>Hinzman, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-omics+approach+identifies+pancreatic+cancer+cell+extracellular+vesicles+as+mediators+of+the+unfolded+protein+response+in+normal+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Sci Rep. 6, 22519(2016).</li>
<li>Searle, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high+quality+libraries+for+DIA+MS+with+empirically+corrected+peptide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions.</a> Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).</li>
<li>Skowronek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+in-depth+coverage+of+the+%28Phospho-%29proteome+with+deep+libraries+and+optimal+window+design+for+dia-PASEF%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF.</a> Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).</li>
</ol>

作者声明存在竞争性财务利益。Anton Iliuk 和 W. Andy Tao 是 Tymora Analytical Operations 的联合创始人，该公司开发了 EVtrap 磁珠并实现了 PolyMAC 磷肽富集试剂盒的商业化。

有效分离细胞外囊泡（EV）是检测EV中低丰度蛋白和磷酸化蛋白的必要前提。尽管已开发出多种方法以满足这一需求，但大多数方法仍存在回收率低或重复性差等局限性，从而限制了其在大规模研究和常规临床环境中的应用。差速超速离心法（DUC）通常被认为是EV分离最常用的方法，通常还需附加洗涤步骤以提高目标EV的纯度27,28。该过程导致DUC操作更加繁琐且耗时较长（&#62; 6 h）。此外，多项研究已报道DUC后EV回收率较低29,30，本研究结果也显示于图2中。相比之下，EVtrap可实现高效的EV分离（&#60; 1 h）并获得高回收率（图2）。值得注意的是，该工作流程的成功应用标志着在识别多种疾病和癌症的重要EV标志物方面取得了关键进展19<sup...

细胞外囊泡（EVs）是由所有类型的细胞分泌并存在于血液、尿液、唾液等生物流体中的膜包被纳米颗粒1,2,3,4。EVs 携带多种生物活性分子，这些分子反映了其来源细胞的生理和病理状态，因此在疾病进展中发挥关键作用4,5,6。此外，大量研究已证实，基于 EV 的疾病标志物可在症状出现之前或肿瘤被生理学检测到之前被识别5,6,7。
磷酸化是细胞信号传导和调控的关键机制。因此，磷蛋白为生物标志物的发现提供了宝贵的来源，因为异常的磷酸化事件与细胞信号通路失调以及癌症等转移性疾病的发展相关8,9,10。尽管分析磷酸化动态变化有助于识别疾病特异性的磷蛋白特征作为潜在的生物标志物，但磷蛋白丰度低且具有动态特性，这为将其开发为生物标志物带来了重大挑战11,12。值得注意的是，包裹在细胞外囊泡（EVs）内的低丰度磷蛋白可免受细胞外环境中外部酶的降解8。因此，EVs及其来源的磷蛋白是癌症及其他疾病早期检测中生物标志物发现的理想来源。
尽管对细胞外囊泡（EVs）中蛋白质磷酸化的分析为理解癌症信号传导和早期疾病诊断提供了宝贵的资源，但缺乏高效的EV分离方法仍然是一个主要障碍。EV的分离通常通过差速超速离心法（DUC）实现13。然而，该方法耗时较长，且由于通量低、重复性差，不适合临床应用13,14。其他替代性的EV分离方法，例如聚合物诱导沉淀法15，会因非EV蛋白的共沉淀而导致特异性较低。基于亲和力的方法，包括基于抗体的亲和捕获16和亲和过滤17，虽然特异性有所提高，但由于处理体积较小，回收率相对较低，应用受到限制。
为解决细胞外囊泡（EVs）中磷酸化蛋白动态研究中的难题，本研究团队开发了一种基于化学亲和力的细胞外囊泡全回收与纯化技术（EVtrap），该技术利用功能化磁珠捕获EVs18。先前的研究结果表明，这种基于磁珠的EV分离方法能够从多种生物流体样本中高效分离EVs，与差速超速离心法（DUC）及其他现有分离方法相比，可获得更高的EV得率，并显著减少污染18,19。我们已成功将EVtrap技术与本团队开发的基于钛的磷酸化肽段富集方法20相结合，用于分析来源于多种生物流体的EVs的磷酸化蛋白质组，并检测多种疾病的潜在磷酸化蛋白生物标志物19,21,22。
本文介绍了一种基于EVtrap技术分离循环细胞外囊泡（EVs）的实验方案，重点针对尿液中的EVs。我们还展示了利用蛋白质印迹法（western blotting）对分离得到的EVs进行表征的方法。随后详细阐述了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的样品制备及质谱（MS）检测流程。该方案提供了一个高效且可重复的 workflow，用于分析尿液EV的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，将有助于进一步开展EVs相关研究及其临床应用23。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Life Science Products</td><td>M-1700C-LB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 管磁性分离架</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 管磁性分离架</td><td>Sergi Lab Supplies</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>台式恒温振荡器</td><td>Bioer</td><td>DIS-87999-3367802</td><td>Bioer Thermocell Mixing Block MB-101</td></tr><tr><td>CD9 (D3H4P) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13403S</td><td></td></tr><tr><td>氯乙酰胺</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>C0267-100G</td><td>用于还原性巯基的烷基化。以水新鲜配制 400 mM 储存液。</td></tr><tr><td>乙酸乙酯&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>E145-4</td><td>用于沉淀去垢剂</td></tr><tr><td>Evosep One&amp;nbsp;</td><td>Evosep</td><td></td><td>液相色谱系统</td></tr><tr><td>Evotips</td><td>Evosep</td><td>EV2013</td><td>用于 Evosep One 系统的样品加载&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EVtrap</td><td>Tymora Analytical</td><td></td><td>功能化磁珠、上样缓冲液和洗涤缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF 膜</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>IPFL00010</td><td>印迹膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>Invitrogen NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，迷你蛋白凝胶，12 孔</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pepsep C18 15 x 75 x 1.9</td><td>Bruker&amp;nbsp;</td><td>1893473</td><td>分离柱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 2</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P5726-5ML</td><td>100X，磷酸酶抑制剂。</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 3</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P0044-1ML</td><td>100X，&amp;nbsp; 磷酸酶抑制剂。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL 蛋白印迹底物</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>HRP 底物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PolyMAC 磷肽富集试剂盒</td><td>Tymora Analytical</td><td></td><td>基于聚合物的金属离子亲和捕获（PolyMAC）用于磷肽富集</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td>裂解缓冲液中的去垢剂。以水配制 120 mM 储存液。</td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>L9150-50G</td><td>裂解缓冲液中的去垢剂。以水配制 120 mM 储存液。</td></tr><tr><td>timsTOF HT</td><td>Bruker</td><td></td><td>捕获离子淌度飞行时间质谱</td></tr><tr><td>TopTip C-18 (10-200 &amp;mu;L) 吸头&amp;nbsp;</td><td>Glygen</td><td>TT2C18.96</td><td>脱盐方法</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>471283-100ML</td><td>用于 EV 洗脱。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵缓冲液</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>T7408-100ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>C4706</td><td>用于二硫键的还原。以水配制 200 mM 储存液。将储存液分装成小体积，于 -20&amp;deg;C 保存（避免反复冻融）。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA41007</td><td></td></tr></tbody></table>

基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis

近年来，生物液体中的细胞外囊泡（EVs）在液体活检领域受到广泛关注。几乎所有类型的细胞都会释放EVs，它们能够实时反映宿主细胞的状态，并含有丰富的分子信息，包括蛋白质，尤其是具有翻译后修饰（PTMs）（如磷酸化）的蛋白质，这些蛋白质在细胞功能以及疾病的发生和进展中起着关键作用。然而，由于现有EVs分离方法存在得率低和杂质多等问题，从生物液体中分离EVs仍然具有挑战性，这使得对EVs内容物（如EVs磷酸化蛋白）的下游分析变得困难。本文介绍了一种基于功能化磁珠的快速、高效的EVs分离方法，可用于从人尿液等生物液体中分离EVs，并在EVs分离后进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。该方案实现了尿液EVs的高回收率，并获得了灵敏的EVs蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱图。此外，本文还讨论了该方案的通用性及相关技术注意事项。

本方案展示了从细胞外囊泡（EV）的分离到下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的完整工作流程（图1）。对三份尿液样本进行EV分离。分离得到的EV通过蛋白质印迹法进行表征，随后进行基于质谱的蛋白质组学样品制备，包括蛋白质提取、酶解消化和肽段纯化。对于磷酸化蛋白质组学分析，采用金属离子功能化的可溶性纳米聚合物进一步富集磷酸化肽段。肽段和磷酸化肽段样品均在数据非依赖采集模式下通过高分辨率离子迁移质谱进行分析。将获得的原始数据文件与智人（Homo sapiens）数据库进行比对，并采用无需谱图库的数据非依赖采集工作流程进行鉴定及MS2水平的定量分析。
为了表征分离得到的细胞外囊泡（EVs）并评估回收率，我们首先将含有EVs的0.5 mL尿液等量上样至凝胶，进行Western blot检测EV标志物CD9（图2A）。此外，为了进行比较，我们还检测了采用目前最常用的EV分离方法——差速超速离心法（DUC）——从相同体积尿液中分离得到的EVs。结果显示，与DUC...

本方案详细描述了利用功能化磁珠高效分离尿液细胞外囊泡的方法。此外，还包括后续分析步骤，如蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。

来自体液的细胞外囊泡（EVs）最近在液体活检领域受到广泛关注。几乎每种类型的细胞都会释放这些囊泡……

我们正在致力于加速基于生物标志物的发现。其中一个关键步骤是高效且选择性地分离这些生物标志物。基于Mag-Net EV分离技术的EV捕获方法能够显著帮助我们，它具有高通量、操作简便的优点，尤其适合临床应用。我们一直采用该方案来发现不同疾病的蛋白质和磷酸化蛋白生物标志物，例如转移性癌症、肾癌和帕金森病。这些生物标志物来源于生物液体。细胞外囊泡（EVs）有望用于液体活检，从而进一步改善临床诊断和治疗。目前，细胞外囊泡分离最常用的方法是超速离心法和沉淀法。然而，这些方法存在共沉淀污染物以及回收效率低等局限性。因此，我们的EV富集方法将为细胞外囊泡的分离提供一种更高效的技术路径，有助于实现更高重复性和更灵敏的检测，并有利于后续分析。我们正在推进两项工作。首先，我们持续开发用于细胞外囊泡（EV）分离及下游分析的方法和实验方案，特别是基于质谱的分析。其次，由于EV检测技术的优势，我们正在探索其在临床领域的不同应用。首先，从健康个体收集尿液样本。取12毫升样本置于15毫升锥形管中，离心以去除大凋亡体中的细胞碎片。然后，将上清液10毫升转移至新的15毫升离心管中。向样品中加入1毫升上样缓冲液和200微升EV捕获珠悬浮液。将样品在室温下以翻转旋转方式孵育30分钟。为沉淀样品，将15毫升锥形管置于磁力分离架上。小心移除上清液，并将磁珠重悬于1 mL洗涤缓冲液中。随后，将悬液转移至1.5 mL微量离心管中，轻轻吹打以重悬结合了细胞外囊泡（EV）的磁珠。将微量离心管置于适用于1.5 mL管的磁力分离架上。使用P200移液器小心吸除上清液。随后，用1毫升洗涤缓冲液洗涤磁珠，再于室温下用1毫升PBS洗涤两次。将磁珠与100微升新配制的100毫摩尔三乙胺溶液在室温下孵育5分钟。使用1.5毫升微量离心管磁性分离架收集含有细胞外囊泡（EVs）的洗脱液。合并洗脱液后，在4°C条件下使用真空离心浓缩仪将洗脱液干燥。首先，取通过EV trap方法从人尿液中获得的干燥细胞外囊泡样本。使用所示组分配制新鲜的裂解缓冲液。然后，加入 100 微升裂解缓冲液以溶解干燥的 EV 样品。在 95 摄氏度下加热样品 10 分钟，同时以 1,100 转/分钟的速度振荡。将样品冷却至室温后，加入 400 微升 50 毫摩尔 TEAB，稀释五倍。根据制造商说明书，使用 BCA 法蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。向样品中加入胰蛋白酶和赖氨酰内肽酶 C 混合液。37摄氏度下振荡培养过夜，转速为1,100转/分钟。然后，向样品中加入50微升10%三氯乙酸或TFA以酸化样品。接着，向样品中加入600微升乙酸乙酯，并涡旋混合2分钟。将样品在 20,000 G 条件下离心 3 分钟，小心移除上层液体，避免扰动界面。使用真空离心浓缩仪干燥水相。随后，将干燥后的样品重悬于 200 微升 0.1% TFA 中，以酸化肽段。为去除样品中的盐分，使用C18脱盐小柱，先用200 µL含0.1% TFA的80%乙腈溶液进行预处理，随后用200 µL含0.1% TFA的溶液洗涤两次。将酸化后的肽样品加载至小柱中，并用200 µL含0.1% TFA的溶液洗涤三次。最后用200 µL含0.1% TFA和80%乙腈的溶液洗脱肽段。按照演示方法吸取洗脱液后，将干燥的磷酸化蛋白质组样品重悬于200微升负载缓冲液中，用于磷酸化肽段富集。向样品中加入50微升磁珠，在室温下剧烈振荡20分钟。将含有磁珠的样品加入滤芯小柱中，在100 × g条件下离心1分钟。随后依次用200微升负载缓冲液、洗涤缓冲液一和洗涤缓冲液二洗涤小柱。将含有珠子的枪头放入新离心管中，以收集洗脱的磷酸化肽段。向枪头中加入50微升洗脱缓冲液，并在20G条件下离心两分钟。然后，使用真空离心浓缩仪干燥洗脱下来的磷酸化肽段。首先，利用EV trap方法分离尿液样本中的细胞外囊泡，并制备其蛋白质组和磷酸化蛋白质组样本。通过液相色谱系统将样本注入捕获离子淌度飞行时间质谱仪中。将肽段分离至一根15厘米长的C18色谱柱中。进行蛋白质组学分析时，采用dia-PASEF方法采集数据，每阶质谱扫描范围为质荷比300至1200，离子淌度常数范围为0.6至1.501 K₀。进行磷酸化蛋白质组学分析时，采用dia-PASEF采集方法获取数据。将每段质谱扫描的质量范围设置为质荷比400至1550，离子淌度常数设置为0.6至1.501每节。将原始文件载入蛋白质组学软件中。在智人（homo sapiens）数据库中设置搜索参数。在消化类型中选择“特异性”，在酶选项中选择胰蛋白酶P。将肽段长度定义为最小7，最大52，并允许两个漏切位点。然后，将最大可变修饰数设置为5。固定修饰应为半胱氨酸上的羧氨甲基化。可变修饰应包括：蛋白质及末端乙酰化、甲硫氨酸氧化，以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。最后，在液相色谱-质谱和质谱蛋白质组学分析中，将肽段-谱图匹配、肽段及蛋白质组的错误发现率设为 0.01。每个样本的2%可检测到约2,200种蛋白质中的11,000多种独特肽段。值得注意的是，在三个重复样本中，72%的独特蛋白质均稳定存在，并且相较于ExoCarta数据库，共鉴定出90种主要的细胞外囊泡（EV）标志物蛋白。定量精度经验证，其低中等变异系数为5.7%，表明该方法具有高度的可重复性和可靠性。在磷酸化蛋白质组学分析中，每个肽段样品有98%产生了800种独特的磷酸肽和350种磷酸化蛋白。富集结果表明，磷酸丝氨酸肽占72%，磷酸苏氨酸肽占22%，磷酸酪氨酸肽占6%。42%的磷酸肽在所有重复实验中均被鉴定到，且中等变异系数为21.8%，表明定量重复性良好。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

血液中存在的细胞外囊泡被认为可作为多种疾病的新型生物标志物。本文介绍了一种从外周血样本中分离大型质膜来源微囊泡的实验方案，并通过常规流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行后续分析。...

外周血微囊泡的分离与表征

本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。...

从完整组织中提取细胞外囊泡

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

本文提供了一种详细的方案，用于清洗和重复使用聚碳酸酯超速离心管，以进行适用于蛋白质组学实验的细胞外囊泡分离。...

聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。...

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习使用功能化磁珠从生物流体中高效分离细胞外囊泡，结合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，加速癌症和帕金森病等疾病的生物标志物发现，为液体活检和临床诊断提供可靠方法。

基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

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