Name: rd10小鼠中人胚胎干细胞衍生的光感受器祖细胞的视网膜下递送 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解人胚胎干细胞衍生的光感受器祖细胞的制备及其在rd10小鼠视网膜下递送技术。该方法通过32天诱导分化生成祖细胞，为视网膜退行性疾病的干细胞治疗提供可靠的临床前研究方案。

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我们感谢谭伟成、江雪燕、李欣怡和钟 Yingying 在冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞制备过程中提供的技术协助。本研究部分得到了新加坡国家医学研究理事会青年研究者研究基金奖（NMRC/OFYIRG/0042/2017）和新加坡国家研究基金会24的资助。th 竞争性研究计划资助（CRP24-2020-0083）授予 H.G.T.

该 体内 实验均依照新加坡保健集团机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth, IACUC）批准的指南和方案，以及视力与眼科学研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明进行。幼鼠自出生后第17天（移植前）至第30天（移植后）通过饮用含有环孢素（260 g/L）的水进行免疫抑制。
1. 冻存后第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备
<ol>
	<li>将光感受器分化培养基（PRDM）置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>从液氮中取出一支含有第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的冻存管，保持在干冰上。</li>
	<li>在37 °C水浴中解冻冻存管，持续3-5分钟。将第32天的细胞重悬于1 mL PRDM中，并在130 × g条件下离心4分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PRDM中。</li>
	<li>取10 µL混合液用于细胞计数。按照制造商说明书，使用0.2%台盼蓝染色细胞，混匀后将细胞混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活率。</li>
	<li>当细胞活率高于70%时，进行下一步操作。将剩余的细胞悬液在130 × g条件下离心4分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PRDM中，调整浓度至3 × 105 个细胞/µL，用于移植。</li>
	<li>观察是否存在可见的细胞团块。在微量离心管中使用10 µL移液枪头反复吹打重悬细胞团块，直至无可见团块为止。将细胞悬液吸入33G注射器，观察细胞溶液是否能顺利通过针头挤出。</li>
</ol>
2. 视网膜下注射hESCs rd10 小鼠
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>使用氯胺酮（20 mg/kg 体重）和赛拉嗪（2 mg/kg 体重）混合物，通过连接27G针头的1 mL结核菌素注射器经腹腔注射，对小鼠（P20，雄性/雌性，3–6 g）进行麻醉。作为预先镇痛措施，向小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。</li>
		<li>给予麻醉后，滴加1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素各一滴，以实现瞳孔扩张。在角膜上涂抹眼用凝胶，防止眼睛干燥及麻醉相关性白内障的发生。</li>
		<li>将小鼠置于空笼中，直至完全麻醉。通过轻捏足垫评估麻醉深度，确认动物对强烈夹捏无反应。</li>
		<li>当小鼠完全麻醉后，将其放置在设定为38 °C的加热垫上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的视网膜下腔递送
	<ol>
		<li>采用本实验所用的经玻璃体单通道平坦部睫状体途径，在无菌环境下进行视网膜下注射。使用直立式手术显微镜并沿直接光路完成注射操作。</li>
		<li>准备10 µL玻璃注射器，先取下针头卡座。将33G钝头针头安装到玻璃注射器上，使用金属卡座盖小心固定针头。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗，检查针头是否存在泄漏或阻塞情况。排空注射器后，小心放置于一旁备用。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠置于软枕上，使待处理眼正对显微镜物镜向上。滴加0.5%盐酸丙帕他卡因，等待30秒。在眼球表面涂抹150 µL眼用凝胶，并覆盖圆形盖玻片。</li>
		<li>通过观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜，对眼球进行初步检查。调节焦平面，经瞳孔观察小鼠眼底。调整头部位置，使视盘位于瞳孔中央，并通过适当固定头部减少移动。</li>
		<li>多次轻弹装有hESCs的试管底部，使细胞充分混匀形成均匀悬液。使用带有33G钝头针头的10 µL玻璃微量注射器吸取2 µL细胞/培养基。为避免细胞在注射器内沉降或聚集，应在注射前立即吸取细胞悬液。</li>
		<li>使用30G一次性针头，在角膜缘后方2 mm处制作巩膜切口。保持针头角度约为45°，以避免接触晶状体。当针尖进入眼内可视后，缓慢撤出针头。使用后将针头丢弃至锐器盒中，防止针刺伤。</li>
		<li>取玻璃注射器，将钝头针插入巩膜切口。在不接触晶状体的前提下，推进钝头针直至到达切口对侧的视网膜。确保注射区域避开主要视网膜血管，以防出血。</li>
		<li>轻柔穿透视网膜，直至在巩膜处观察到压力隆起。保持针头钝端与巩膜平行，以防止细胞泄漏至玻璃体腔。</li>
		<li>在持续轻压注射器的同时，缓慢将2 µL细胞悬液或PRDM培养基（对照）注入视网膜下腔。成功注射后，注射部位应形成可见的隆起（即含有细胞悬液/培养基的视网膜隆起）。 
		注意：注射过程中仅可施加轻微压力，以避免视网膜撕裂及细胞在针尖处堵塞。</li>
		<li>确认形成隆起后，等待10秒使细胞沉降，然后缓慢将针头从眼球中撤出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术中光学相干断层扫描（OCT）对隆起区域的扫描（可选）
	<ol>
		<li>缓慢移动小鼠头部，使显微镜下可清晰观察到隆起区域。通过轻扶头部固定位置。无需额外扩大瞳孔。不要移除眼球上的盖玻片和凝胶，它们可提供清晰的光学介质以便观察隆起。</li>
		<li>使用手术显微镜内置的iOCT功能进行术中OCT扫描。</li>
		<li>在OCT屏幕上点击Cube 选项，通过点击Arrow 按钮将扫描区域定位至隆起部位。滑动Centering and Focus调节OCT图像至最佳质量。点击Capture/Scan获取隆起区域的OCT扫描图像。检查图像以评估扫描质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后恢复
	<ol>
		<li>移除盖玻片，并用纱布清洁眼球表面的凝胶。注射后一次性涂抹抗生素软膏，以预防感染。</li>
		<li>将动物置于温暖光源下恢复麻醉，直至其恢复足够意识以维持胸卧位，并可返回饲养笼。注射后至少监测动物3天，观察是否存在炎症、感染或痛苦迹象。 
		注意：150 W暖灯应距离动物笼至少30 cm，注意避免造成灼伤。</li>
		<li>术后第一天每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg），或根据兽医建议执行。若观察到眼部出现炎症或感染，应咨询兽医专业人员进行适当治疗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器械的清洁与灭菌
	<ol>
		<li>用100%乙醇冲洗10 µL玻璃微量注射器及33G钝头针头10次。随后用蒸馏水冲洗注射器，去除残留乙醇。</li>
		<li>拆卸玻璃注射器和针头。干燥注射器后储存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Revitalizing Sight: Stem Cell Therapy for Retinal Degeneration

Hwee Goon Tay 是 Alder Therapeutics AB 的联合创始人。其他作者声明无竞争利益。

视网膜下注射已用于细胞悬液移植，以治疗视网膜色素上皮（RPE）和视网膜疾病23,25,26,27,28,31,40。该方法在啮齿类动物研究中极为重要，不仅适用于细胞移植和基因治疗，还可用于评估视网膜疾病的新治疗化合物。目前，将细胞或腺相关病毒（AAVs）递送至视网膜下腔主要有三种途径：经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径。
在经角膜途径中，注射针穿过角膜、瞳孔，最后到达视网膜，将细胞递送至视网膜下腔并成功形成隆起泡（bleb）。经角膜途径的优点是能够在受体动物中实现完全的视网膜脱离4...

遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性可导致感光细胞丧失，最终引发失明。视网膜感光细胞位于视网膜的外层，由专门负责光转导（即将光信号转化为神经信号）的特化细胞组成。视杆细胞和视锥细胞紧邻视网膜色素上皮层（RPE）1。为弥补细胞丢失，感光细胞替代疗法已成为一种新兴且不断发展的治疗策略。目前已使用胚胎干细胞（ESCs）2,3,4、诱导性多能干细胞（iPSCs）来源的RPE细胞以及视网膜前体细胞（RPCs）4,5,6,7,8来修复受损的感光细胞。视网膜下腔是位于视网膜与RPE之间的一个受限空间，因其位置邻近，成为移植这些细胞以替代受损的感光细胞、RPE细胞及穆勒细胞的理想部位9,10,11。
在临床前研究中，基因和细胞疗法已利用视网膜下腔作为多种视网膜疾病的再生医学治疗途径。这包括以反义寡核苷酸疗法12,13或基于腺相关病毒（AAV）策略的CRISPR/Cas9或碱基编辑技术14,15,16形式递送功能性的基因拷贝或基因编辑工具，以及植入材料（例如RPE细胞片、视网膜假体17,18,19）和由干细胞分化而来的视网膜类器官20,21,22，用于治疗视网膜及RPE相关疾病。已有临床试验证明，在视网膜下腔使用hESC-RPE31治疗RPE65相关的莱伯先天性黑蒙（LCA）23,24、CNGA3相关的全色盲25、MERTK相关的视网膜色素变性26以及脉络膜缺失症27,28,29,30是一种有效的治疗方法。将细胞直接注射至损伤区域附近，可显著提高细胞在目标区域的定植、突触整合以及最终视觉功能改善的可能性。
尽管在人类和大眼模型（如猪）中进行视网膜下注射32,33,34,35，兔36,37,38,39,40和非人灵长类动物41,42,43）已被&#160;已建立的方法中，由于小鼠眼球尺寸受限且晶状体巨大，占据了眼球的大部分空间，因此在小鼠模型中进行此类注射仍具有挑战性44,45,46然而，基因修饰模型仅在小型动物中易于获得，而在大型动物（如兔和非人灵长类）中则不易获得，因此小鼠的视网膜下注射成为研究视网膜遗传性疾病新型治疗方法的重要手段。目前有三种主要方法用于将细胞或腺相关病毒（AAV）递送至视网膜下腔，即经角膜途径、经巩膜途径和睫状体平坦部途径（参见 图2经角膜和经巩膜途径与白内障形成、虹膜粘连、脉络膜出血及注射部位反流相关11,44,45,47,48,49我们采用经平坦部入路，可在显微镜下实时直视观察注射过程，并精确定位注射部位。
我们最近描述了一种可在无异源成分、化学成分明确的条件下，利用重组人视网膜特异性层粘连蛋白亚型LN523将人胚胎干细胞（hESCs）分化为光感受器前体细胞的方法。由于发现LN523存在于视网膜中，我们推测人视网膜的细胞外基质微环境可以被模拟重现 体外 从而支持视网膜光感受器细胞由人胚胎干细胞（hESCs）分化而来36单细胞转录组分析显示，在第32天时生成了共表达视锥-视杆同源框基因和视网膜捕获蛋白的光感受器前体细胞。视网膜变性10（rd10) 采用模拟常染色体遗传性人类视网膜色素变性的突变小鼠模型，评估了第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的治疗效果 体内将人胚胎干细胞分化的光感受器前体细胞注射至视网膜下腔 rd10 P20小鼠，此时光感受器功能障碍和变性正在进行中36. 本文详细描述了一种制备冻存后的人胚胎干细胞来源的视光感受器前体细胞并将其递送至视网膜下腔的实验方案 rd10 小鼠。该方法也可用于向小鼠的视网膜下腔注射腺相关病毒（AAVs）、细胞悬液、多肽或化学物质。

<table><tbody><tr><td>0.3% 妥布霉素</td><td>诺华</td><td>NDC &amp;nbsp;0078-0813-01</td><td>Tobrex (3.5 g)</td></tr><tr><td>0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松</td><td>诺华</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3.5 g)</td></tr><tr><td>0.5% 盐酸丙帕他卡因</td><td>爱尔康</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0.5% Alcaine (15 mL)</td></tr><tr><td>1 mL 结核菌素注射器</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺</td><td>爱尔康</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl (15 mL)</td></tr><tr><td>2.5% 盐酸去氧肾上腺素</td><td>爱尔康</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G 一次性针头</td><td>贝克顿·迪金森 (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G，20 mm 长钝针</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>NanoEnTek</td><td>型号：Eve</td><td></td></tr><tr><td>不含维生素 A 的 B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &amp;micro;M&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>环孢素</td><td>诺华</td><td></td><td>260 g/L 饮用水</td></tr><tr><td>第 32 天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞</td><td>杜克-国大医学院</td><td></td><td>人胚胎干细胞分化 32 天。参见参考文献 36 中的方案。</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Winner Industries Co. Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基</td><td>Gibco</td><td>11710&amp;ndash;035</td><td></td></tr><tr><td>人胚胎干细胞系 H1</td><td>WiCell 研究所</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>人脑源性神经营养因子 (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>人睫状神经营养因子 (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 &amp;micro;g&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>微量玻璃注射器 (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯 (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &amp;micro;M&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&amp;ndash;050</td><td>1x&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>NutriStem XF 培养基</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>蔡司</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>带内置 iOCT 功能</td></tr><tr><td>PRDM（光感受器分化培养基，50 mL）</td><td>杜克-国大医学院</td><td></td><td>参见培养基成分&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;。基础培养基：10 &amp;micro;M DAPT、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL CNTF、0.5 &amp;micro;M 视黄酸、2% B27 和 1% N2。基础培养基组成：1x GMEM、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 (NEAA)。</td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Gibco</td><td>11360&amp;ndash;070</td><td>1 mM&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Rd10 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>B6.CXB1-Pde6brd10/J 小鼠</td><td>性别：雄性/雌性，年龄：P20（注射时），体重：3–6 g&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 &amp;micro;M&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>圆形盖玻片 (12 mm)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 &amp;micro;M&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Vidisic 凝胶 (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪 (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985&amp;ndash;023</td><td>0.1 mM&lt;sup&gt;36&lt;/sup&gt;</td></tr></tbody></table>

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

利用人多能干细胞再生光感受器细胞，是治疗遗传性和衰老性晚期视网膜疾病的一种有前景的疗法。我们已证明，人源重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESCs）向光感受器前体细胞的分化。此外，将这些细胞进行视网膜下注射后，在rd10小鼠和兔的动物模型中均观察到部分功能恢复。视网膜下注射是一种成熟的技术，因其接近靶区域，已被广泛用于将药物化合物递送至光感受器细胞及视网膜色素上皮（RPE）层。该方法也已被用于将腺相关病毒载体递送至视网膜下腔，以治疗视网膜疾病。在小鼠模型中，由于眼球尺寸较小，视网膜下给药在操作上具有挑战性。本方案详细描述了用于注射的人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的制备流程，以及在遗传性视网膜色素变性突变小鼠（rd10小鼠）中进行视网膜下细胞递送的技术。该方法可将细胞治疗精准递送至靶区域，特别是光感受器变性类疾病发生的主要部位——视网膜外核层。

根据制造商的说明组装了10 µL玻璃注射器（图1），用于输送细胞悬液/培养基的钝针如图1B所示。不同类型的视网膜下注射方法在图2中进行了图示。本方案中描述的是经平坦部入路法（图2C）。将安装在玻璃注射器上的钝针通过巩膜切口进入，并穿过眼球到达视网膜下腔。如图3A所示，在显微镜下可直接观察注射过程中针头的行进轨迹、穿透视网膜以及细胞输送的情况。通过观察注射部位是否形成隆起（bleb）来确认细胞/培养基是否成功输送（图3B）。成功的隆起表现为浅白色、类似水球样的外观。若注射失败，则表现为细胞/培养基泄漏至玻璃体腔内，且未能形成隆起。对注射区域进行了OCT扫描，结果显示经细胞处理的眼内视网膜下腔中存在悬浮的单个hESCs（图4A）...

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。

利用人多能干细胞再生光感受器细胞是治疗遗传性和年龄相关性视网膜变性疾病的一种有前景的疗法……

我的研究聚焦于开发基于干细胞的疗法，用于治疗导致感光细胞退化的晚期视网膜疾病。我们研究的目标是利用临床安全且具有功能的感光细胞前体细胞替代患者体内丢失的感光细胞，以期改善其视力，甚至恢复视觉功能。主要的临床前研究模型为小鼠。但由于其眼球体积小，使得注射材料变得困难，尤其是在视网膜下注射时。掌握成功进行视网膜下注射的技术需要耐心和毅力。我们已成功开发出一种基于层粘连蛋白的受体分化方法，可在32天内生成光感受器前体细胞。在啮齿类动物中，将这种光感受器前体细胞悬液进行视网膜下移植，可在眼内宿主细胞与移植物之间形成突触连接。这已实现部分视觉功能的恢复。我们的方法十分简便。直接可视化有助于外科医生将针头引导至目标区域。首先将PRDM置于37摄氏度的水浴中。从液氮中取出一支含有第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的冻存管，并将其置于干冰上保存。然后将冻存管在37摄氏度水浴中解冻三到五分钟。用一毫升PRDM重悬细胞。在130×g离心四分钟。去除上清液后，将沉淀物重悬于1毫升PRDM中。细胞计数时，取10微升细胞悬液，按制造商说明书与0.2%台盼蓝混合。用移液器将细胞混合液加入细胞计数板载玻片中。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活率。若细胞活率高于70%，则将剩余的细胞悬液在130g条件下离心4分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PRDM中用于移植。使用10微升移液枪头，将微型离心管中的细胞团块重悬，直至肉眼不可见团块。将细胞悬液转移至33号注射针筒中，并确认细胞溶液可从针头顺利挤出。开始操作前，取一只麻醉小鼠，在其眼部滴加一滴1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素，以扩大瞳孔。然后将眼用凝胶涂抹于角膜，以防止干燥及麻醉引起的白内障。接下来，在无菌环境中架设直立式手术显微镜并调整为直射光路，以进行视网膜下注射。准备10微升玻璃注射器时，先取下针座，再安装33号钝针头。取下金属帽盖，将针头牢固地安装到注射器上。用蒸馏水冲洗针头，以检测是否泄漏及针头是否通畅。然后排空注射器，并小心放置一旁备用。接下来，将麻醉后的小鼠置于垫子上，并使治疗眼朝向显微镜物镜。滴加0.5%盐酸丙帕卡因，等待30秒。然后向眼部加入150 µL眼用凝胶，并贴上圆形盖玻片。进行初步的眼部检查，观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜。调节焦平面，通过瞳孔观察小鼠眼底。然后调整头部位置，使视神经乳头与瞳孔中心对齐。随后，轻敲含有hESC来源的光感受器前体细胞的试管底部，以获得均匀的细胞悬液。使用带有33号钝头针头的10微升玻璃微量注射器，吸取2微升细胞混合物。用30号一次性针头在距角膜缘后方2毫米处制造巩膜切口。保持针头与角膜约呈45度角，以避免接触晶状体。当针尖在眼内可见时，小心地回撤针头。将使用过的针头丢弃至锐器盒中，以防止针刺伤。现在，取玻璃注射器，将钝针插入巩膜切除伤口。推进钝针时避免接触晶状体，直至到达入口伤口对侧的视网膜。轻柔穿刺视网膜，直至观察到巩膜上出现压力分支。然后在保持注射器轻柔压力的同时，向视网膜下腔注射两微升细胞悬液或PRDM培养基。可见泡状隆起的形成表明注射成功。等待10秒，使细胞沉降。轻柔地将针头从眼球撤出。为观察滤泡，移动小鼠头部使眼睛位于显微镜下，并通过轻握头部固定位置。对于术中光学相干断层扫描，使用手术显微镜上的 iOCT 功能，并在 OCT 屏幕上选择“cube”模式。通过按压箭头按钮将扫描区域定位在滤泡上。为优化OCT图像质量，调整居中位置和焦点。按下捕获或扫描按钮以获取滤泡区域的OCT扫描图像。然后查看图像以检查扫描质量。最后，移除盖玻片，并用纱布轻轻清洁眼内的凝胶。注射后给予一次抗生素软膏以预防感染。OCT扫描显示，在经细胞处理的眼中，人胚胎干细胞（HESC）清晰可见，悬浮于视网膜下腔内。相比之下，经培养基处理的眼中则显示清晰透明的液体，视网膜下腔内无细胞存在。

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rd10小鼠中人胚胎干细胞衍生的光感受器祖细胞的视网膜下递送

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。...

围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。...

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。...

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

干细胞移植在一种 体外 模拟缺血/再灌注模型

了解人胚胎干细胞衍生的光感受器祖细胞的制备及其在rd10小鼠视网膜下递送技术。该方法通过32天诱导分化生成祖细胞，为视网膜退行性疾病的干细胞治疗提供可靠的临床前研究方案。

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

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