Name: 冷冻保存全血的微核检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学习使用冷冻保存全血进行微核检测的优化方案，适用于大规模多中心研究。该方法通过细胞培养、辐射处理和显微镜检查评估DNA损伤，为细胞遗传学检测提供可靠技术支持。

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作者谨此感谢 L. Pieters、T. Thiron 和 G. De Smet 提供的技术支持。我们感谢所有为本研究捐献血液的志愿者。本研究工作获得了佛兰德研究基金会（FWO）资助（项目编号：T000118N）的经费支持。

本研究通过静脉穿刺采集了30名年龄在17至65岁之间的健康献血者的血液样本。其中20名献血者的微核（MN）数据重新使用自Beyls等人的论文8。血液样本的采集符合比利时根特大学医院伦理委员会的指南（注册编号：2019/1565）。所有参与者均签署了书面知情同意书。有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 血液样本的采集
<ol>
	<li>开始前，确保已获得受试者的书面知情同意，并严格遵守伦理准则。</li>
	<li>将血液采集至含肝素锂的采血管中，室温保存，待进行冷冻保存前处理。</li>
</ol>
2. 全血的冷冻保存
注意：从开始到细胞收获的所有步骤均须在无菌层流通风柜中以无菌操作进行。
<ol>
	<li>为冷冻保存1 mL血液，通过混合800 µL胎牛血清（FCS）和200 µL二甲基亚砜（DMSO）配制1 mL冻存液。 
	注意：冻存液的配制体积应与需冷冻的血液样本体积相等。</li>
	<li>对于全血的冷冻保存，将抗凝管中的血液样本转移至15 mL或50 mL离心管中。 
	注意：离心管的容量取决于血液体积。</li>
	<li>以低速涡旋血液，并在持续但逐滴加入等体积冻存液的条件下进行混合。</li>
	<li>将2 mL血液-冻存液混合物分装至冻存管（2 mL）中，每份分装液包含1 mL血液样本与1 mL冻存液的混合物。</li>
	<li>逐步缓慢冷冻
	<ol>
		<li>将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中，置于-80 °C冰箱中过夜。</li>
		<li>将冻存管转移至液氮中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冻存血液的解冻
注意：为缩短解冻过程的总时间，每次处理的冻存管不应超过8支（每支2 mL）。
<ol>
	<li>制备
	<ol>
		<li>在解冻血液前，将 200 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）预热至 37 °C。</li>
		<li>在无菌条件下配制所需培养基的工作液。确保每份培养物含有 1.6 mL 完全培养基：即在 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中添加青霉素/链霉素（0.5%）、0.2 mL 胎牛血清（FCS）、20 µL 丙酮酸钠和 2 µL β-巯基乙醇。 
		注意：由于解冻过程中可能损失大量血细胞，解冻后的血液应接种于小孔培养板（如 24 孔板）中进行培养，每孔总体积为 2 mL。每个剂量使用一块多孔板。</li>
		<li>对于每个培养孔，按照下图所示方式（图 1），在盖子上标注供体编号、A/B 分组、日期和剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示生物测定中供体样本放置位置的微孔板布局示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：微核试验中用于培养全血的24孔板建议布局。 对孔位进行标记，并在盖子的相应位置标明供体编号。每个患者样本应设置两个相邻的重复孔。请注意，此布局基于10×10准直器设计，可根据准直器或样本的实际尺寸进行调整。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>解冻与培养全血的操作步骤
	<ol>
		<li>将水浴锅预热至 37 °C。</li>
		<li>从液氮中取出所需数量的冻存管（数量根据实验需求，如剂量数量而定）。 
		​注意：每支冻存管含有 1 mL 血液和 1 mL 冻存液。因此，一支冻存管中的血液可用于建立两个培养体系。</li>
		<li>在预热的水浴锅中部分解冻冻存管（直至管内仍可见微小冰晶）。</li>
		<li>将冻存管从水浴锅中取出，并用无菌纸巾擦拭管外表面。</li>
		<li>在无菌超净工作台中，缓慢打开冻存管，防止管内产生的气泡溢出。</li>
		<li>将每支冻存管中的内容物重悬后，分别转移至 15 mL 圆锥形离心管中（每管对应一支冻存管）。</li>
		<li>向各离心管中逐滴加入 1 mL 预热（37 °C）的 PBS，同时轻轻旋转混匀。使用 P1000 移液器重悬细胞。</li>
		<li>为实现稀释与均匀洗涤，逐滴加入 7 mL 预热的 PBS（37 °C），并用 P1000 移液器重悬。</li>
		<li>在室温下以 180 × g 离心 8 分钟（设置为 加速度 1，刹车 1）。</li>
		<li>在离心过程中，向除细胞培养孔以外的其他孔中加入 500 µL PBS。</li>
		<li>将培养板放回培养箱中预热。</li>
		<li>离心结束后，小心吸除上清液，保留约 1 mL 上清，以避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>用 P1000 移液器将沉淀物在残留的上清液中重悬。</li>
		<li>向各离心管中逐滴加入 8 mL 预热的 PBS（37 °C），同时轻轻旋转混匀，随后用 P1000 移液器重悬。</li>
		<li>将重悬后的血液以 180 × g 离心 8 分钟（设置为 加速度 9，刹车 9）。</li>
		<li>在离心过程中，向各标记好的培养孔中转移 200 µL 培养基。</li>
		<li>将培养板放回培养箱中，保持 37 °C。</li>
		<li>离心结束后，连续动作吸除上清液（避免扰动松散的细胞沉淀），但保留约 80 µL 上清液。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入 280 µL 胎牛血清（FCS，室温），并重悬（总体积为 360 µL）。</li>
		<li>将 180 µL 细胞悬液转移至每个培养孔中并混匀（相当于每孔含“血液”/培养体系 0.5 mL）。每孔总体积现为 380 µL，形成 2 mm 厚的培养基层。</li>
		<li>将培养板置于 CO2 培养箱中，在 37 °C 下孵育至少 10 分钟，随后进行辐照处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. G0 MN 检测
<ol>
	<li>从培养箱中取出培养板，在室温下用所需剂量的X射线（220 kV，13 mA，0.15 mm Cu）对细胞培养物进行照射，如0.5、1和2 Gy。使用假照射样品作为对照，以识别自发微核率。</li>
	<li>照射后立即向每个孔中加入1.62 mL培养基（37 °C）。</li>
	<li>为刺激T淋巴细胞分裂，向每孔加入40 µL植物血凝素（PHA），并充分重悬。</li>
	<li>将这些培养板放回培养箱（5% CO2，37 °C）。 
	注意：此步骤为实验的起始时间。</li>
	<li>在刺激后23小时，通过向每孔加入8 µL细胞松弛素B（6 µg/mL）阻断细胞质分裂，并充分重悬。</li>
	<li>在刺激后/培养70小时收获细胞培养物。重悬细胞并转移至15 mL离心管中。用2 mL PBS冲洗每个孔，并将PBS加入相应的15 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下以180 × g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液，但保留约500 µL上清液覆盖在沉淀上。</li>
	<li>将沉淀在最大速度下涡旋，并在涡旋过程中缓慢逐滴加入2 mL冷氯化钾溶液（KCl，4 °C）。</li>
	<li>立即以180 × g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留约500 µL上清液。</li>
	<li>将沉淀在最大速度下涡旋，并在涡旋过程中缓慢逐滴加入2 mL冷固定液1（甲醇/乙酸/林格氏液，比例为4:1:5）。</li>
	<li>将样品管在4 °C下放置过夜（最少12小时，最多96小时）。</li>
	<li>以180 × g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀在最大速度下涡旋，并在涡旋过程中缓慢逐滴加入2 mL冷固定液2（甲醇/乙酸，比例为4:1）。</li>
	<li>以180 × g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀在最大速度下涡旋，然后在涡旋过程中缓慢逐滴加入2 mL冷固定液2。</li>
	<li>将样品管在4 °C下放置（最少12小时，最多96小时）。</li>
	<li>用异丙醇清洁载玻片，并正确标记。 
	注意：建议使用打印标签进行标记，因为记号笔墨水在处理过程中容易被擦除。</li>
	<li>将样品管以180 × g离心8分钟。</li>
	<li>将上清液转移至另一管中，根据沉淀大小浓缩细胞。</li>
	<li>涡旋沉淀。</li>
	<li>取40 µL固定后的细胞滴加到干燥洁净的载玻片上。</li>
	<li>让载玻片在室温下自然干燥。将载玻片存放在盒中或立即染色以供观察。</li>
</ol>
5. 吖啶橙（AO）染色
<ol>
	<li>将载玻片浸入吖啶橙（AO）染液中染色1分钟，随后用蒸馏水快速冲洗，然后将载玻片放入磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中1分钟。</li>
	<li>从缓冲液中取出载玻片，用洁净的擦镜纸擦干载玻片背面，并将载玻片放置在洁净的擦镜纸上。</li>
	<li>在载玻片表面滴加20 µL磷酸盐缓冲液，轻轻加盖一张洁净的盖玻片，避免产生气泡。</li>
	<li>用硅酮封固剂密封载玻片。 
	​注意：由于吖啶橙（AO）对光敏感且会随时间褪色，为获得良好的对比度和荧光效果，建议在染色后5天内完成载玻片的观察评分。未观察时，务必将载玻片存放于低温环境（4 °C）中。</li>
</ol>
6. 染色切片评分
<ol>
	<li>将载玻片置于荧光显微镜下，观察1,000个双核细胞（BNs）。手动计数微核（MN），微核是毒性六大生物标志物之一。操作时，应由两位独立评分者在相同放大倍数下分别检查每张载玻片上的500个双核细胞。 
	注意：以下是Fenech推荐的染色载玻片评分标准中的一些要点9
	<ol>
		<li>选择双核细胞时，应寻找细胞形态圆润、胞质完整、具有两个大小相近、形状规则且染色均匀的清晰细胞核的细胞。确保该双核细胞的胞质与邻近细胞的胞质可明确区分。</li>
		<li>判定一个微核时需注意，其形态与主核相同但体积更小；即使最大的微核，其直径也不超过主核的1/3。只有当微核不与主核接触，或至少微核边界与主核边界可清晰区分时，方可计为微核。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Examining Micronuclei Yields in Irradiated Whole Blood Samples

<ol><li>Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+chromosomal+aberrations+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Results+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors.</a> Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).</li>
<li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+the+human+immune+system%3A+a+bioresource+for+autoimmunity+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis.</a> Cell. 161 (2), 387-403 (2015).</li>
<li>Bankoglu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+DNA+damage+and+DNA+repair+activity+in+human+blood+samples+in+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay.</a> Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).</li>
<li>Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+cryopreserved+isolated+lymphocytes+for+the+analysis+of+micronuclei+with+the+cytokinesis-block+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method.</a> Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).</li>
<li>Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+on+human+isolated+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125(2020).</li>
<li>Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserving+whole+blood+for+functional+assays+using+viable+lymphocytes+in+molecular+epidemiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies.</a> Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).</li>
<li>Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+cryopreserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood.</a> International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Ramachandran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+thawing+of+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+use+in+high-throughput+human+immune+monitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies.</a> Cells. 1 (3), 313-324 (2012).</li>
<li>Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).</li>
<li>Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+lymphocyte+subset+analysis+using+material+from+frozen+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+and+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood.</a> Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).</li>
<li>Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+blood+cell+subtype+concentrations+from+frozen+whole+blood+samples+using+TruCount+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).</li>
<li>Braudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+reliable+whole+blood+freezing+method+for+flow+cytometry+immuno-phenotyping+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).</li>
<li>Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+dosimetry+using+the+micronucleus+assay+for+lymphocytes%3A+interindividual+differences+in+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.</a> Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).</li>
<li>Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+assay+as+a+biological+dosimeter+of+in+vivo+ionising+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).</li>
<li>Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+and+G2-phase+assays+for+human+blood+lymphocytes+as+biomarkers+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation%3A+limitations+imposed+by+intraindividual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability.</a> Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).</li>
<li>Pajic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-individual+variability+in+the+response+of+human+peripheral+blood+lymphocytes+to+ionizing+radiation%3A+comparison+of+the+dicentric+and+micronucleus+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes%3A+results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li>
<li>Miszczyk, J., Rawojć, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culturing+technique+on+human+peripheral+blood+lymphocytes+response+to+proton+and+X-ray+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

改进后的CBMN检测应用方案是一种相对简便且便于批量保存血液样本的方法。该流程详细说明了在冷冻保存及进行CBMN检测过程中需要特别注意的各项细微而重要的操作细节。其他实验室常规使用的冷冻混合液通常含有10%的DMSO，而本方案中使用的冷冻混合液包含20% DMSO和80% FCS7。由于该冷冻混合液与全血样本以等体积混合，最终DMSO浓度仍为10%。为了提高细胞存活率并促进细胞分裂，我们在完全培养基（cRPMI）中添加了1%的丙酮酸钠和0.1%的β-巯基乙醇。这一配制方法遵循本研究团队建立的细胞培养方案6,8。
尽管本方案未能完全解决解冻过程中细胞结团的问题，但细胞分散效果优于其他常规方案。在洗涤步骤中，与直接快速加入培养基复苏细胞相比，逐滴加入预热的PBS（37 °C）可获得更好的结果。该改进有助于降低细胞应激反应，减少细胞结团，并已证实可实现较高的细胞回收率。此外，使用PBS与RPMI相比，细胞活力未见明显差异。本研究团队已验证，无论是辐照还是未辐照样本，冻存时间长短（最长至1年）均不会影响微核（MN）的产出量6,8。研究表明，外周血单个核细胞（PBMCs）在低温（液氮）下逐步冷冻，解冻时逐步加入预热培养基，可实现良好的细胞活力和增殖能力10,11。研究人员已证实，解冻全血中T淋巴细胞亚群的分布与解冻PBMCs中的分布具有可比性12。此外，已有研究证明，从冻存全血样本中回收的细胞亚型与新鲜全血样本中观察到的细胞亚型相似13,14。
如果我们考察报告中获得的指示性结果，会发现其随剂量呈线性二次增长图3) 与其他关于线性能量传递（LET）诱导微核的文献报道一致15,16在冻存全血样本中观察到的MN产量的变异性（表1) 在新鲜全血培养物报道的范围内8,17,18此处详细描述的方案已在20名健康志愿者的新鲜和冻存全血样本上得到验证8核分裂指数（NDI），是该报告中观察到的细胞增殖的重要参数8 与新鲜全血建议值一致19,20综上所述，这种优化的全血冷冻保存方案与改良的微核试验相结合，可获得更高的细胞得率，因此推荐采用该方案进行辐射敏感性评估。由于该方案的可重复性已得到验证8建议其适用于大规模、多中心研究。

自从发现以来，由于电离辐射（IR）对生物体具有不良影响，其使用在研究人员中一直存在争议。这种有害效应通常表现为DNA损伤，例如双链断裂（DSBs）；若这些双链断裂未能得到修复，则会导致染色体畸变和突变，而这些正是癌症的重要特征1,2。此类染色体畸变可通过细胞遗传学检测方法进行观察，例如细胞质分裂阻滞微核（CBMN）试验。微核是指在有丝分裂过程中无法被整合进子代细胞核中的滞后染色体片段，因而被遗留在细胞质中。
CBMN 是一种常用的、可靠的细胞遗传学技术，用于评估暴露于体内或体外电离辐射个体的染色体损伤。CBMN 检测可使用新鲜全血或分离的外周血单个核细胞（PBMCs）。由于 PBMC 的分离与处理过程耗时，且会丢失作为细胞存活与生长支持介质的血清血浆，因此新鲜全血通常是首选的生物材料。为获得较高的双核细胞得率，新鲜全血应在采集后立即处理。然而，在时间受限的情况下，立即处理可能带来后勤上的挑战。此外，当需要在较长时间内采集大量样本，或在远离处理中心的地点采样时，新鲜血液样本的储存可能成为一个限制因素3,4。
此外，为了能够在同一个个体/患者中重复进行微核（MN）分析，冷冻保存血液样本将具有重要意义。将淋巴细胞保存以用于后续CBMN检测的一种方法是冷冻分离后的外周血单个核细胞（PBMCs）5,6。然而，该技术在冷冻PBMCs之前需要多个处理步骤。因此，全血的冷冻保存可作为分离PBMCs冷冻保存的一种简便且省时的替代方法。目前关于使用冷冻全血进行细胞遗传学检测或需要淋巴细胞增殖的检测的相关信息较少。仅有一篇文献报道了使用冷冻保存的全血进行中期相分析7。
由于全血的冷冻保存在生物监测、生物剂量测定和放射敏感性评估领域具有诸多优势，我们课题组优化了一种全血冷冻保存方案，可用于微核实验（CBMN assay）8。我们证实，冻存全血培养物中的淋巴细胞至少在一年内仍保持其基因组完整性和增殖能力。在本方法学论文中，我们详细描述了由Beyls等人8优化的全血冷冻保存程序及CBMN实验方案，并报告了30名健康个体冻存血液样本的实验结果。在进行CBMN实验时，对血液培养物进行体外（in vitro）照射，照射剂量分别为0.5、1和2 Gy，以评估冻存全血样本中淋巴细胞的微核反应。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞悬浮培养板&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2779</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>ChemLab</td><td>CL00.1807.2500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Merck life science</td><td>8,18,75,52,500</td><td></td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Merck life science</td><td>235474-5g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck life science</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1365</td><td>22 x 50</td></tr><tr><td>冻存盒（Mr.Frosty）</td><td>Nalgene, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>Novolab</td><td>A04573</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素B&amp;nbsp;</td><td>Merck life science</td><td>C6762-10</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Merck life science</td><td>D4540-500ml</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>固定液1</td><td></td><td></td><td>甲醇/乙酸/林格液，按4:1:5比例混合</td></tr><tr><td>固定液2</td><td></td><td></td><td>甲醇/乙酸，按4:1比例混合</td></tr><tr><td>GURR缓冲液</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10582013</td><td>磷酸盐缓冲液（pH 6.8）</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck life science</td><td>1,04,93,60,250</td><td>75 mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck life science</td><td>1,04,87,30,250</td><td></td></tr><tr><td>锂肝素管</td><td>BD Life sciences</td><td>367526-LH170 I.U.</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>fisher scinetific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck life science</td><td>10,65,80,500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck life science</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>MENZAA00000112E04</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/mL + 10,000 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>植物血凝素（PHA-M）</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>林格液</td><td></td><td></td><td>含 NaCl、KCl、CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;，溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>52400041</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶密封胶</td><td>collall</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>无菌预温PBS（37 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td>含 NaCl,&amp;nbsp; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr></tbody></table>

冻存全血微核试验

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

的 体外 细胞分裂阻断微核（cytokinesis-block micronucleus, CBMN）试验是放射生物学研究、生物剂量学、遗传毒性研究中广泛使用的一种技术，以及 体外 放射敏感性检测。这种细胞遗传学方法基于检测双核细胞中因染色体片段在细胞分裂过程中滞后而形成的微核。新鲜全血样本是CBMN检测最优先选择的样本类型。然而，使用新鲜血液样本的缺点包括采血后需立即处理，以及在不进行额外采血的情况下可重复分析的次数有限。 
由于新鲜血液样本在实际操作中可能面临物流上的挑战，因此在冻存的全血样本上进行CBMN检测将具有显著优势，尤其是在大规模的患者研究中。本文介绍了一种冻存全血样本并在此类冻存样本上实施CBMN检测的实验方案。来自健康志愿者的血液样本在不同时间点被冷冻和解冻后，采用改良的微核检测方案进行处理。结果表明，该优化后的流程可成功在冻存血液样本上开展CBMN检测。所描述的冷冻保存方案也可能适用于其他细胞遗传学检测以及多种需要淋巴细胞增殖的功能性检测。

为验证该方案的可重复性，我们对30名年龄在17至65岁之间的健康志愿者的冷冻保存血液样本进行了微核试验。该组人群的平均年龄为35岁，冷冻保存时间范围为1周至154周。将全血细胞培养物暴露于不同辐射剂量（0.5、1和2 Gy）后，在显微镜下检测1,000个双核细胞中的微核产率。形态良好、呈圆形的双核细胞（如图2所示）表明已成功从冷冻保存的全血样本中复苏出健康且具有活力的细胞。值得注意的是，淋巴细胞在超低温（液氮）长期保存后，其辐射反应仍保持稳定。该观察结果与新鲜血液样本所预期的反应一致。
<img alt="荧光显微镜：颗粒分布热图；细胞分析，箭头指示聚集体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：从一年前冷冻保存的全血样本中获取的双核细胞中观察到的微核。（A）放大倍数200倍，（B）放大倍数400倍；箭头指向微核（MNs）。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
随着辐射剂量的增加（0.5、1 和 2 Gy），观察到微核产率呈线性-二次方增长（表1 和 图3）。假照射对照样品（0 Gy）中的微核产率代表了主要由滞后染色体引起的背景微核水平。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>剂量 (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均值</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变异系数 (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>范围</td>
			<td>5-41  </td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：30名健康供体冻存全血样本中微核得率的平均值、变化范围及变异系数，反映个体间差异。缩写：CV = 变异系数；SD = 标准差。
<img alt="剂量-反应曲线图；微核细胞数 vs 剂量（Gy）；显示生物学效应相关性的统计图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：30名供体的对照组与辐照冷冻保存全血样本中观察到的微核率。 冷冻保存时间范围为1周至154周。散点图显示个体数值，聚类中的线条表示该组的均值 ± 标准差（Mean ± SD）。缩写：MN = 微核；BN = 双核细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为了研究个体间微核（MN）产出量的差异，计算了变异系数（CV）（见表1）。对于辐射诱导的微核，在所有剂量（0.5、1 和 2 Gy）下均获得 CV < 25%，表明该改良方案具有良好的可重复性。

本文介绍了一种针对冻存全血样本的细胞松弛素B阻滞微核试验的优化方案。这种用于微核分析的全血冻存优化方法是一种可靠的技术，适用于大规模采样和多中心研究，也可用于其他与血液相关的检测。

体外细胞分裂阻断微核（CBMN）试验是一种广泛应用于放射生物学研究、生物剂量测定、遗传毒性研究中的技术，……

我们的研究主要聚焦于评估电离辐射对健康组织的影响。我们正在研究癌症患者以及DNA修复障碍个体的染色体辐射敏感性。此外，我们还参与生物学不对称性研究，评估暴露于电离辐射所诱导的DNA损伤。为了推动本领域的研究进展，我们采用自动显微系统进行高通量分析。阈值血液样本是微核试验中最优选的样本类型，因其易于获取且对患者造成的不适最小。然而，在时间受限的情况下，样本需立即处理可能带来后勤上的挑战。全血样本的冷冻保存使得无需再次采样即可进行多次分析。该方法是一种简便且高效的血液样本储存方式，适用于大规模、多中心研究。全血冷冻保存方案不仅对微核试验具有优势，还可用于其他需要淋巴细胞增殖的细胞遗传学实验或功能实验。准备培养孔时，用供体代码 A 或 B、日期和剂量标记 24 孔板的盖子。从液氮中取出含有人血的冻存管，在温水浴中部分解冻，直至观察到微小冰晶。接着在超净工作台内小心打开冻存管，防止气泡进入管内。将小瓶中的内容物重新悬浮，并转移至15毫升离心管中。在轻轻摇动管子的同时，逐滴加入1毫升预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。使用P1000移液器混匀PBS与血液。为进行稀释和均匀洗涤，向15毫升离心管中加入7毫升预热的PBS，用移液器吹打混匀。将血液在180 ×g 下离心8分钟。同时，向24孔板中未标记的孔内各加入500微升PBS，并将该板在37摄氏度预热。离心后，小心移除上清液，保留约一毫升于离心管中，注意不要扰动沉淀。使用移液器将沉淀在残留的上清液中重新悬浮。然后按照之前的方法，逐渐向管中加入八毫升预热的 PBS。将重悬的血液离心。在此期间，向已标记的孔中加入200微升RPMI培养基，并按所示预热培养板。离心后，弃去上清液，保留约80微升上清液。然后加入 280 µL 胎牛血清并重悬沉淀。将 180 µL 细胞悬液转移至标记好的孔中。将培养板置于 37 °C 的二氧化碳培养箱中孵育 10 分钟。将冻存的血液样本解冻并培养后，在室温下用所需的X射线剂量进行照射。然后向每孔加入1.62毫升预热的RPMI培养基。为刺激T淋巴细胞的细胞分裂，向每孔加入40微升植物血凝素，并充分重悬。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育23小时。次日，每孔加入8微升细胞松弛素B，以阻断胞质分裂。70小时后，从培养箱中取出培养板，将细胞悬液转移至15毫升离心管中。用两毫升 PBS 清洗每个孔，并将此 PBS 加入 15 毫升离心管中。将细胞悬液在 180 ×g 条件下离心 8 分钟，弃去上清液，保留 500 微升液体覆盖在沉淀上。在涡旋振荡沉淀的同时，向管中加入两毫升预冷的氯化钾溶液。再次离心并弃去上清液，操作方法同前。缓慢加入2 mL冷固定液一，涡旋重悬沉淀，并在4°C下孵育过夜。次日，离心并弃去上清液。在涡旋振荡沉淀的同时，向离心管中逐滴加入2毫升冷固定液二，在4°C条件下静置过夜。离心样品后，根据沉淀物的大小，将上清液转移至另一离心管中以浓缩细胞。用异丙醇清洁载玻片并正确标记。将沉淀物涡旋混匀后，取40 µL固定细胞悬液滴加到载玻片上。待其干燥后，将载玻片浸入吖啶橙染液中染色一分钟。然后将玻片用蒸馏水快速冲洗，再放入磷酸盐缓冲液中一分钟。擦干玻片背面，将其放置在洁净的吸水纸上。在玻片上加入20微升磷酸盐缓冲液，并用洁净的盖玻片覆盖，避免产生气泡。用硅胶密封此载玻片。将载玻片置于荧光显微镜下，观察双核细胞。最后，手动计数微核。出现圆形双核细胞表明已成功从冻存的全血样本中回收到健康且具有活力的细胞。随着辐射剂量的增加，微核产率呈线性二次方增长。在假照光对照样本中，本底微核产率主要源于滞后的染色体。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

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