机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

慢性伤口和大面积皮肤缺损是临床治疗中的重大难题，目前可用的治疗手段有限。我们旨在探索利用一种易于获取的自体细胞来源——脂肪组织，作为潜在的治疗方案。通过手术切除或吸脂术获取脂肪组织后，从中分离出基质血管组分。

机械分离的基质血管组分被用作酶法处理的基质血管组分（SVF）的替代方案，以避免体外实验室处理过程中面临的问题。典型问题包括处理时间长、污染风险以及产生的费用。我们认为，上述机械分离的基质血管组分（MSVF）细胞所具备的多种再生能力，结合纤维蛋白水凝胶的优势，可为促进伤口愈合过程提供一种创新性方法。

总体而言，该方法可实现有活力的基质血管组分（MSVF）细胞的有效局部递送。未来，我们将探讨如何将所获得的知识转化为临床应用，特别是SVF中每种细胞类型在体外病理条件下的作用。开始操作时，在细胞培养超净台中，将收获的脂肪抽吸物加入50毫升离心管中。

将脂肪抽吸物转移至一支无菌的 20 毫升螺口注射器中。然后将一个 1.4 毫米的连接器连接到该注射器上。接着，将另一支 20 毫升螺口注射器连接到连接器的对侧。

将脂肪组织在两个注射器之间来回推注约30次。然后，将乳化后的脂肪转移至一个新的50毫升离心管中。在500×g条件下离心10分钟。

然后，弃去上层油相。收集中间含有分离的基质血管层的纯净层，并将其转移至一个新的50毫升离心管中。接着，用添加了补充物的DMEM填充离心管，直至液面达到40毫升刻度线。

将离心管再次以500×g离心5分钟。收集所得的基质血管组分（MSVF）层，并转移至一个新的50毫升离心管中。取100微升分离得到的基质血管组分，用移液器加入无菌的1.5毫升离心管中。

向其中加入 10 微升凝血酶，然后用移液器加入 10 微升氯化钙。最后，使用新的移液器吸头向混合物中加入 70 微升氨甲环酸。在应用前 shortly，向试管中加入 10 微升纤维蛋白原。

聚合MSVF水凝胶混合物后，将200微升水凝胶用移液器加入12孔板中用于分析。现在，向其中一个孔加入100微升纤维蛋白水凝胶作为阴性对照。将12孔板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。

然后，向每个孔中加入1毫升预热的培养基，将12孔板重新放回培养箱中继续孵育4小时。再次孵育前，向每个孔中加入1毫升刃天青，继续孵育24小时。用移液器将刃天青样品转移至96孔板中。

第二天，使用细胞成像多功能微孔板检测仪测定初始荧光强度。在第1、3和7天进行组织学分析时，将纤维蛋白水凝胶置于0.5毫升4%多聚甲醛中固定。随后向孔板中加入1% PBS，并在4摄氏度下保存。

采用刃天青（resazurin）检测法对血管组分和水凝胶的体外细胞变异性进行定量分析。血管组分在第3天显示出活力下降，而MSVF-纤维蛋白水凝胶组合的活力仍接近基线水平。到第7天时，MSVF的活力进一步下降，而MSVF-纤维蛋白水凝胶组合的活力则有所上升。

组织学分析显示，在第3天和第7天，细胞核数量未见减少。纤维蛋白水凝胶降解程度轻微，可见的细胞簇分布均匀。