缺氧人胎盘来源的小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障

我们的研究聚焦于胎盘与大脑之间的通讯。我们正在探索细胞外小囊泡是否可能破坏血脑屏障，以及这是否与子痫前期女性中观察到的细胞血管并发症相关的潜在机制有关。我们先前已证实，子痫前期女性的血浆可损害血脑屏障。

然而，血浆中这种潜在有害因子的性质尚不明确。本实验室的研究表明，来自子痫前期孕妇血浆或在低氧条件下培养的胎盘所释放的细胞外囊泡会损害血脑屏障。胎盘来源的细胞外囊泡损害血脑屏障的潜在机制仍需进一步研究，包括对细胞外囊泡内容物的分析，例如调控脑内皮细胞消化蛋白表达的特定微小RNA（microRNAs）。

使用无菌镊子开始提取人胎盘样本的外植体时，小心地从胎盘底板上移除血凝块。持续提取小块外植体，直至获得约10克的最终组织量。用培养基洗涤并重悬外植体后，将重悬的外植体均分为两份，分别放入两个100毫米的培养皿中。

将其中一个培养皿置于标准常氧条件下，37摄氏度，含8%氧气和5%二氧化碳的环境中。将另一个培养皿放入含1%氧气的低氧培养箱中。在两种不同条件下培养组织块18小时后，继续收集组织块的条件培养基至15毫升离心管中。

分别收集常氧和低氧条件下类器官培养的培养基至不同的离心管中。在室温下对收集的条件培养基进行连续离心。每次离心后，使用 20 至 100 微升移液器小心吸取上清液，弃去沉淀。

对最后收集的上清液再进行一次离心。将获得的含有胎盘来源小细胞外囊泡（SEVs）的沉淀重悬于500 µL PBS中，并将悬液通过0.22 µm滤器过滤。胎盘来源的SEVs现已准备就绪，可用于注射小鼠。

为了向小鼠注射小型细胞外囊泡（SEVs），请使用从人胎盘外植体中分离的SEVs，这些外植体在低氧和常氧条件下培养。将200微克胎盘SEVs溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，定容至终体积70微升。注射前，使用RMCBS量表评估动物的健康状况。

然后使用带有30号针头的胰岛素注射器，将溶液注入已适当麻醉的小鼠颈外静脉。注射后，用干燥的棉签对注射部位施加轻压15秒。在注射后3、6、12和24小时，使用RMCBS评分系统评估小鼠的健康状况。

为了分析伊文思蓝外渗，用 PBS 配制 2% 伊文思蓝染料溶液。通过眼眶后途径注射 SEV 后 24 小时，将伊文思蓝溶液注入适当麻醉的小鼠体内。待伊文思蓝在动物体内循环后，用约三毫升生理盐水对麻醉小鼠进行心脏灌注，以清除循环中的染料。

在通过心脏灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定小鼠并小心取出脑组织后，称重并拍照。按照所示步骤，使用体视变倍显微镜从各组动物中提取脑组织，观察所获取的脑切片图像。利用所获取的图像，通过Image J软件定量分析伊文思蓝外渗情况。

与注射了来自常氧胎盘的SEVs的小鼠不同，注射了来自缺氧胎盘SEVs的小鼠在注射后24小时内神经学评分呈进行性下降。注射了缺氧胎盘SEVs的小鼠脑组织中伊文思蓝外渗量高于注射了常氧胎盘SEVs的小鼠。注射了缺氧胎盘SEVs的小鼠脑组织中紧密连接蛋白claudin-5的含量减少，而该蛋白对血脑屏障的完整性至关重要。

所有这些结果表明，缺氧胎盘来源的SEV引起了血脑屏障的破坏。