Name: 缺氧人胎盘的小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 探索缺氧人胎盘小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障的机制。该方法通过分离胎盘外植体sEVs并注射至小鼠颈静脉，结合伊文思蓝渗漏分析，揭示子痫前期血管并发症的潜在病理基础。

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作者谨向隶属于GRIVAS健康组织的研究人员致以诚挚的感谢。同时感谢来自智利奇廉医院妇产科服务部门的助产士和临床工作人员。本研究由Fondecyt Regular 1200250项目资助。

本研究遵循《赫尔辛基宣言》所表达的原则，并在各伦理审查委员会的授权下进行。所有人类参与者在样本采集前均签署了知情同意书，如前所述。25此外，比奥比奥大学的生物伦理与生物安全委员会批准了本项目（Fondecyt 资助编号 1200250）。动物实验严格遵循实验动物使用中“3R原则”的基本要求。35，并遵循美国国立卫生研究院（US National Institute of Health）发布的《实验动物护理和使用指南》中的建议。动物饲养于比奥比奥大学（University of Bío-Bío）动物实验中心的适宜环境中。足月妊娠（妊娠38至41周）、年龄为28至31岁的健康产妇在智利奇廉市赫明达·马丁临床医院（Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile）接受选择性剖宫产术后1小时内获取新鲜胎盘组织（n = 4），获取方法如先前报道所述。25. 以应用 体内 模型采用4-6月龄雌性未孕小鼠（C57BLACK/6品系），分为三组实验组：（1）对照组（无处理），（2）经常氧培养胎盘来源sEVs（sEVs-Nor）处理组，（3）经低氧培养胎盘来源sEVs（sEVs-Hyp）处理组，用于评估血脑屏障（BBB）的破坏情况 体内25所有注射溶液均为无菌。此外，sEVs 的制备均在无菌条件下于二级生物安全柜中进行，以避免污染。
1. 胎盘组织培养外植体
<ol>
	<li>为提取正常妊娠胎盘的外植体，请参考 Miller 等人于 2005 年发表的方法36。</li>
	<li>使用灭菌镊子小心去除人胎盘底板上的血凝块。提取小块外植体，以获得最终 10 g 的组织样本。</li>
	<li>确保从胎盘母体部分的四个象限中分别获取胎盘外植体，并排除无活力组织和钙化区域。</li>
	<li>操作胎盘组织时，应在冰上、无菌条件下并在生物安全柜内进行。</li>
	<li>用大量（相当于外植体体积五倍）的冷（4 °C）磷酸盐缓冲液（PBS 1x，pH 7.4）对外植体进行充分洗涤（至少三次），以尽可能去除血液。每次洗涤之间在室温下离心（252 × g，10 分钟）。</li>
	<li>将洗涤后的 10 g 外植体重悬于 20 mL 培养基中，培养基中添加 2% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（见材料表）。</li>
	<li>将悬液转移至 100 mm 培养皿中，在 37 °C、21% 氧气和 5% CO2 的培养箱中孵育 2 小时。</li>
	<li>之后，用 37 °C 的 1x PBS 重新洗涤外植体（三次），每次洗涤之间在室温下离心（252 × g，10 分钟）。</li>
	<li>随后，将组织重悬于 20 mL 预先去除纳米颗粒的培养基中。 
	注：为去除纳米颗粒，需进行超速离心（120,000 × g，室温 18 小时）和微孔过滤（0.22 µm 滤器）。</li>
	<li>将重悬的外植体均分至两个 100 mm 培养皿中，每个培养皿加入 10 mL 重悬液。</li>
	<li>随后，将其中一个含胎盘外植体的培养皿置于标准培养条件（37 °C、8% 氧气和 5% CO2）下，另一个置于含 1% O2 的低氧环境中。 
	注：（可选）可采用相同组织样本并按照其他文献所述方法37,38 进行组织活力分析，如 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法。使用外植体匀浆中测定的总蛋白浓度对 MTT 结果进行标准化处理。</li>
	<li>培养 18 小时后，收集外植体的条件培养基至新的 15 mL 离心管中。 
	&#8203;注：此步骤中，条件培养基可于 -80 °C 长期冻存（数周）。</li>
</ol>
2. 胎盘来源的小细胞外囊泡（sEVs）分离
<ol>
	<li>采用差速离心和微滤方法，按照先前发表的文献报道从条件培养基中分离小细胞外囊泡（sEVs）25,39。</li>
	<li>对收集的条件培养基进行连续离心。离心步骤依次为：(1) 300 × g 离心10分钟，(2) 2000 × g 离心10分钟，(3) 10,000 × g 离心30分钟，以及 (4) 120,000 × g 在室温下离心2小时。</li>
	<li>在所有这些离心步骤中，使用20–100 μL移液器小心收集上清液，并弃去沉淀。</li>
	<li>完成后，将最后一次收集的上清液通过0.22 µm滤膜过滤（见材料表）。随后，在室温下以120,000 × g 再次离心18小时。</li>
	<li>之后，弃去上清液，将沉淀（含有胎盘来源sEVs）重悬于500 µL PBS（pH 7.4）中，并再次通过0.22 µm滤膜过滤。最后，在室温下以120,000 × g 离心3小时。</li>
	<li>接着，将沉淀（含有胎盘来源sEVs）重悬于500 µL PBS（pH 7.4，预先去除sEVs）中，并通过0.22 µm滤膜过滤。</li>
	<li>将样品标记为常氧条件下的sEVs储备液（sEVs-Nor）或低氧条件下的sEVs储备液（sEVs-Hyp）。 
	注：将分离得到的sEVs分装为50–100 µL的小份，用于后续实验。小细胞外囊泡可在-80 °C长期保存（数月）。</li>
	<li>按照先前报道的方法对胎盘来源sEVs进行粒径、数量及sEV蛋白标志物的表征25。理想的sEVs平均粒径范围为50–150 nm。 
	注：sEVs的表征应包括CD63、Tsg101、Alix和HSP70的阳性检测（用于鉴定富含外泌体的sEVs群体）。此外，使用PLAP作为胎盘来源的标志物25。</li>
	<li>根据BCA蛋白检测试剂盒的说明书测定sEVs溶液中的总蛋白含量（见材料表）。 
	&#8203;注：图1展示了胎盘组织外植体培养及细胞外囊泡分离的整体流程。</li>
</ol>
3. 小鼠注射
<ol>
	<li>在麻醉诱导室中使用5%异氟烷进行麻醉诱导（参见 材料表）。验证麻醉水平 通过 脚趾夹捏</li>
	<li>约40秒后，将小鼠放入麻醉系统中，通过面罩给予2%异氟烷以维持麻醉状态。</li>
	<li>接下来，将动物放置在加热平台上（参见 材料表在28 °C的室温下进行。使用人工泪液保持眼睛湿润。</li>
	<li>注射前，将胎盘sEVs（总蛋白200 μg）用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释至终体积70 µL。</li>
	<li>使用70%乙醇和棉签对注射部位进行消毒。确保使用带有30 G针头的胰岛素注射器注射sEVs溶液。 
	注意：可将注射器置于加热平台上5分钟，以达到生理温度。</li>
	<li>然后，将溶液注入外颈静脉。此步骤需要经过专门培训。 
	注意：操作过程必须谨慎，缓慢回撤针头并轻柔抽吸，观察是否有血液回流。</li>
	<li>注射后，用干燥的棉签对注射部位施加轻压约15秒，随后将动物放回各自的笼具中。</li>
	<li>确保在15分钟内评估意识状态和行为。意识恢复的指标是动物完全恢复自主运动活动。 
	&#8203;注意：确保动物笼具内保持适宜的温度。</li>
</ol>
4. 小鼠快速昏迷和行为评分（RMCBS）
<ol>
	<li>使用RMCBS评估动物的神经功能和健康状况参数40。 
	注：RMCBS可在操作者干预较少的情况下实现快速评估（约3分钟），对动物造成的应激最小。RMCBS包含十个参数（每项评分为0-2分）。</li>
	<li>在注射sEVs前0小时以及注射后3小时、6小时、12小时和24小时，使用RMCBS量表评估小鼠的健康状况。 
	&#8203;注：在注射sEVs后6小时检测claudin-5，在注射后24小时检测伊文思蓝外渗，以评估血脑屏障（BBB）的破坏情况（图2）。</li>
</ol>
5. 伊文思蓝外渗分析
<ol>
	<li>胎盘sEVs注射后24小时，按照步骤3.1所述方法麻醉小鼠。</li>
	<li>配制伊文思蓝溶液（2%，用1×磷酸盐缓冲液稀释）（参见 材料表).</li>
	<li>通过眶后途径25，按 2 mL/kg 注射伊文思蓝溶液。</li>
	<li>在维持麻醉的条件下，使伊文思蓝溶液循环20分钟。</li>
	<li>接下来，按照先前描述的方案进行心脏内灌注41 用生理盐水（约 3 mL，0.9%，w/v）冲洗以清除循环中的伊文思蓝染料。此步骤为必需。 
	注意：进行此操作时，将麻醉深度增加至5%，并确认动物已达到深度麻醉状态（即呼吸频率显著降低）。</li>
	<li>暴露心脏 通过 胸骨旁开胸术41 (图3).</li>
	<li>随后，通过心脏灌注4%多聚甲醛溶液（溶于PBS，v/v）固定整个动物。 
	注意：通过检查尾部的僵硬度来监测固定是否适当。</li>
	<li>此外，固定完成后，小心取出脑组织，称重并拍照记录41用整个大脑紧贴直尺进行拍照42.</li>
	<li>接下来，将脑组织放入小鼠脑切片器中（参见 材料表).</li>
	<li>将脑组织沿头尾方向解剖为九个部分，包括小脑（每个部分厚度为100 μm）。</li>
	<li>解剖后，在体视变倍显微镜下观察并采集脑切片的图像（参见 材料表).</li>
	<li>使用采集的图像，通过 ImageJ 软件定量分析伊文思蓝外渗（参见 材料表). 
	注意：为了分析伊文思蓝染料的存在，需使用脑切片的阳性对照（来自注射了染料但未进行心内灌注的对照动物）来设定伊文思蓝的数值。阳性对照中获得的伊文思蓝数值在蓝色通道的强度直方图中通常介于75至110之间。图4).</li>
	<li>确保由相关实验组对脑部图像进行盲法分析，以避免观察者偏倚。或者，可通过脑组织匀浆后分光光度法定量伊文思蓝外渗。43. 
	注意：在独立实验中，使用sEVs注射后小鼠（6小时）新鲜分离的脑组织，分析紧密连接蛋白5（claudin 5，CLND-5）的蛋白水平（参见 材料表），一种与血脑屏障紧密性相关的关键紧密连接蛋白44 (图5).</li>
</ol>

Evaluating Murine BBB Disruption Induced by Hypoxic Human Placenta-Derived sEVs

作者声明无任何利益冲突。

本研究揭示了在低氧条件下培养的人胎盘外植体所分离的小细胞外囊泡（sEVs）对啮齿类动物血脑屏障破坏的潜在危害。该病理机制涉及后脑区域CLND-5的减少25。
既往研究表明，子痫前期患者的血浆sEV可诱导多种器官的内皮功能障碍 体外 模型46,47本研究重点考察了血脑屏障，揭示了来自低氧培养胎盘的sEVs可破坏这一重要屏障，为该领域提供了新的视角。这些发现开辟了一个新的研究方向，即sEVs可能在正常及病理性妊娠（如子痫前期）等情况下，作为胎盘与大脑之间通讯的媒介。
本方案操作简便，但有几个关键步骤需要特别说明。本方案要求在分娩后1小时内获取新鲜胎盘。我们还建议不要将培养时间延长超过24小时，以防止组织降解。本方案可避免小鼠胎盘产生的小细胞外囊泡（sEVs）带来的潜在污染。伊文思蓝外渗的数字化分析较为耗时。此外，脑组织切片后伊文思蓝染色的可见度会降低。因此，建议先使用阳性对照建立蓝色范围的识别条件。也可使用阴性对照，例如未注射伊文思蓝的小鼠脑组织。为避免观察者偏倚，必须对实验组进行盲法分析。
在本实验方案中可能会遇到若干挑战。其中一个重要的限制因素在于来源于人胎盘和注射小鼠的生物学变异性。为了确保伊文思蓝外渗实验的可重复性，建议确定从人胎盘分离的小细胞外囊泡（sEV）的使用剂量。我们选择使用总蛋白含量为200 µg的剂量；然而，该剂量可能因囊泡纯度、颈静脉注射效率、伊文思蓝给药情况、其在循环系统中的清除速率，以及sEV内容物所介导的生物学效应等因素而有所波动。
人胎盘来源的小细胞外囊泡（sEVs）破坏血脑屏障的细胞机制仍需进一步实验验证。然而，该方法具有重要意义，提示胎盘与大脑之间可能存在潜在通讯，值得深入探索。因此，未来的研究应集中于sEVs及其与血脑屏障的相互作用，以及其携带的生物活性分子对神经组织的影响。血脑屏障功能受损是否会对母体大脑造成持久性影响，仍有待进一步研究。

约70%的子痫前期相关孕产妇死亡与急性脑血管并发症有关。子痫前期是一种以胎盘形成障碍、母体全身性血管内皮功能障碍以及在严重情况下出现多器官衰竭为特征的妊娠期高血压综合征1,2。大多数孕产妇死亡发生在中低收入国家5。然而，尽管子痫前期相关的脑血管并发症具有重要的临床和流行病学意义，其潜在机制仍不明确3,4。
另一方面，细胞外囊泡（EVs）（直径约30-400 nm）是组织和器官之间（包括母体-胎盘相互作用6）细胞间通讯的重要介质。除了表面携带的蛋白质和脂质外，EVs内部还含有多种物质（如蛋白质、RNA和脂质）。根据大小、生物发生方式、内容物及潜在的信号功能，EVs可分为三类：（1）外泌体（直径约50-150 nm，也称为小EVs（sEVs））；（2）中等/大型EVs；（3）凋亡小体。EVs的组成取决于其来源细胞类型以及疾病状态7。合体滋养层细胞来源的EVs表达胎盘碱性磷酸酶（PLAP）8,9，可用于检测妊娠期间来源于胎盘的循环小EVs（PDsEVs）。此外，PLAP还有助于区分子痫前期与正常血压妊娠中PDsEVs所携带物质的变化及其生物学效应10,11,12,13,14,15。
胎盘已被认为是子痫前期16或该疾病相关脑部并发症17,18,19病理生理学中的必要组成部分。然而，这一远隔器官如何诱导脑循环的改变尚不清楚。由于sEVs能够将生物活性成分从供体细胞转移至受体细胞，因而在细胞间通讯中发挥关键作用6,20,21，越来越多的研究已将胎盘来源的sEVs与子痫前期孕妇母体血管内皮功能障碍的发生联系起来21,22,23,24，包括脑血管内皮细胞的损伤25,26。因此，脑血管内皮功能的受损可能导致血脑屏障（BBB）的破坏，而血脑屏障是子痫前期相关脑血管并发症中的一个关键因素3,27。
然而，使用子痫前期女性血清处理的大鼠脑血管28或暴露于子痫前期女性血浆的人脑微血管内皮细胞29的临床前研究发现，循环中的某些因子可导致血脑屏障（BBB）破坏。尽管在子痫前期孕妇的母体循环中存在多种可能损害血脑屏障的候选因子，例如升高的促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子）18,28、血管调节因子（如血管内皮生长因子（VEGF））29,30,31，或氧化分子如氧化型脂蛋白（oxo-LDL）32,33等34，但这些因子均未能建立胎盘与血脑屏障之间的直接联系。最近研究表明，从缺氧胎盘中分离出的sEVs可在非妊娠雌性小鼠中破坏血脑屏障25。由于胎盘来源的sEVs可能携带上述大多数具有破坏血脑屏障能力的循环因子，因此sEVs被认为是连接受损胎盘、作为有害循环因子的载体并在子痫前期中导致血脑屏障破坏的合适候选介质。
本方案旨在研究在低氧条件下培养的胎盘外植体所分离出的小细胞外囊泡（sEVs）是否可在非妊娠雌性小鼠中破坏血脑屏障（BBB），从而作为理解子痫前期期间脑部并发症病理生理机制的替代模型。

<table><tbody><tr><td>成年小鼠脑切片矩阵 3D 打印</td><td>开放获取文件</td><td>成年小鼠</td><td>成年小鼠脑切片器，使用 PLA 丝材打印</td></tr><tr><td>抗 &amp;beta;-肌动蛋白一抗</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>克隆 AC-74</td><td>用于上样对照（Western blot）的抗体</td></tr><tr><td>抗 Claudin5 一抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-374221</td><td>用于检测小鼠血脑屏障紧密连接蛋白 CLDN5 的一抗（Western blot）</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>用于测定蛋白浓度的试剂盒</td></tr><tr><td>培养基 #200 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>m200500</td><td>胎盘外植体培养用培养基</td></tr><tr><td>D180 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>RWD Life Science</td><td>D180</td><td>用于稳定外植体及培养 sEVs-Nor 的标准培养箱</td></tr><tr><td>伊文思蓝染料&amp;nbsp; &gt; 75% 10 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129.10G</td><td>用于体内分析血脑屏障破坏的染料</td></tr><tr><td>胎牛血清 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>培养基 200 的添加型生长因子</td></tr><tr><td>Himac 超速离心机 CP100NX</td><td>Himac eppendorf group</td><td>5720410101</td><td>用于条件培养基的超速离心（&gt; 1,20,000 × g）</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>异氟烷 100 mL</td><td>USP Baxter</td><td>212-094</td><td>用于小鼠的挥发性吸入麻醉剂</td></tr><tr><td>CellTiter 96 非放射性检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>0000105232</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 胎盘外植体活力检测</td></tr><tr><td>小鼠 IgG 二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MO 63103</td><td>用于 CLDN5 检测的二抗（Western blot）</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>90278090</td><td>用于分析胎盘外植体条件培养基中颗粒的纳米追踪系统</td></tr><tr><td>多聚甲醛 E 97% 溶液 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11313.22</td><td>用于脑组织切片及心脏灌注固定的固定液（稀释后使用）</td></tr><tr><td>PBS 1× pH 7.4 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>胎盘外植体洗涤液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100× 20 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>胎盘外植体培养基用抗生素</td></tr><tr><td>ProOX C21 细胞中心 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 子室控制器</td><td>BioSpherix</td><td>SCR_021131</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 调节器，用于在密闭腔室中诱导低氧以制备 sEVs-Hyp</td></tr><tr><td>硫喷妥钠 1 g</td><td>Chemie</td><td>7061</td><td>人道安乐死试剂</td></tr><tr><td>Somnosuite 低流量麻醉系统</td><td>Kent Scientifics</td><td>SS-01</td><td>用于小型啮齿动物的异氟烷蒸发器</td></tr><tr><td>手术加热平台</td><td>Kent Scientifics</td><td>A41166</td><td>用于维持小鼠麻醉期间体温的加热平台</td></tr><tr><td>注射器滤器，聚四氟乙烯（PTFE），疏水性，0.22 &amp;micro;m，无菌，25 mm</td><td>Southern Labware</td><td>10026</td><td>用于过滤从胎盘外植体收获的条件培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台式高速微量离心机&amp;nbsp;HITACHI himac CT15E/CT15RE</td><td>Hitachi 医疗系统</td><td>6020</td><td>用于条件培养基的系列离心（&amp;lt; 1,20,000 × g）</td></tr><tr><td>三目体视显微镜，透射与反射光源，10x–160x&amp;nbsp;</td><td>Center Medical</td><td>2597</td><td>用于记录脑切片的体视显微镜</td></tr></tbody></table>

缺氧人胎盘来源的小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障

Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas

脑血管并发症，包括脑水肿、缺血性卒中和出血性卒中，是子痫前期相关孕产妇死亡的首要原因。这些脑血管并发症的潜在机制尚不明确，但已知与胎盘功能障碍及血脑屏障（BBB）破坏有关。然而，这两个远端器官之间的关联机制仍有待阐明。越来越多的证据表明，胎盘会向母体循环系统释放包括细胞外囊泡在内的多种信号分子。细胞外囊泡根据其大小进行分类，其中直径小于200 nm的小细胞外囊泡（sEVs）被认为是生理和病理状态下重要的信号传递颗粒。在子痫前期，母体循环中的sEVs数量增加，但其信号功能尚未被充分理解。在子痫前期释放的胎盘sEVs，或由正常妊娠胎盘在缺氧条件下释放的sEVs，均可诱导脑血管内皮功能障碍及血脑屏障破坏。本实验方案旨在评估在缺氧条件下培养胎盘外植体所分离的sEVs（模拟子痫前期的某一特征）是否会导致血脑屏障的破坏 体内.

本方案旨在评估在低氧条件下培养的胎盘来源sEVs破坏非妊娠小鼠血脑屏障（BBB）的能力。该方法有助于更深入地理解胎盘与大脑在生理及病理状态下之间的潜在联系。特别是，该方法可作为分析胎盘sEVs在子痫前期相关脑部并发症发生中作用的间接手段。
与注射sEVs-Nor的小鼠不同，注射sEVs-Hyp的小鼠神经学评分持续下降至24小时（表1），表明sEVs-Hyp具有损害脑功能的能力。
此外，注射 sEVs-Hyp 的小鼠脑组织新鲜重量高于注射 sEVs-Nor 或对照组小鼠的脑组织（分别为 0.51 ± 0.008；0.46 ± 0.008；0.47 ± 0.01 g），这可能构成脑水肿的宏观指标45。
与此发现一致，本方案可使人识别伊文思蓝外渗现象，作为血脑屏障（BBB）破坏的指标。在这方面，注射了sEVs-Hyp的小鼠脑组织比注射了sEVs-Nor的小鼠脑组织表现出更高的伊文思蓝外渗水平（图5A）。
尽管本方案未分析sEVs-Hyp诱导的血脑屏障破坏的潜在机制，但结果也表明，注射sEVs-Hyp的小鼠在血脑屏障受影响最严重的区域（即后部区域）中CLND-5的蛋白含量降低（图5B）。因此，sEVs-Hyp可能损害这一关键内皮紧密连接蛋白的功能表达。
<img alt="胎盘外植体培养、小细胞外囊泡超速离心、纳米颗粒追踪分析、蛋白质印迹图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：胎盘外植体培养及细胞外囊泡分离流程。 （A）正常胎盘外植体培养。 （B）将外植体分为两种条件以诱导胎盘来源的小细胞外囊泡（sEVs）生成：常氧（sEVs-Nor，8% O2）或低氧（sEVs-Hyp，1% O2），处理 18 小时。 （C）收集条件培养基，过滤并离心以去除细胞碎片。 （D）通过超速离心法分离 sEVs。 （E）采用纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法对 sEVs 进行表征。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig01largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠研究示意图：胎盘sEVs注射、脑切片、使用染料注射评估血脑屏障破坏。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：体内血脑屏障破坏方案的评估。 使用4-6月龄的非妊娠C57BL6/J小鼠。(A) 通过外颈静脉向动物注射从常氧（sEVs-Nor，8% O2）或低氧（sEVs-Hyp，1% O2）胎盘培养物中分离的sEVs（总蛋白200 μg）。注射后0-24小时监测RMCBS。(B) sEVs注射6小时后，取出大脑并切成九个片段用于蛋白质提取。在九个片段的匀浆物中分析紧密连接蛋白5（CLDN5）。(C) 在sEVs注射24小时后，通过眶后穿刺注射伊文思蓝，分析九个脑段中的染料外渗情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物手术操作：A）术前对比；B）打开体腔暴露内脏器官。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：伊文思蓝染料注射与心脏灌流实验流程图解。（A）通过眼后静脉注射给予小鼠伊文思蓝染料。（左）注射前动物状态，（右）注射伊文思蓝15秒后状态。（B）进行胸廓切开术，实施心内灌注磷酸盐缓冲液（1× PBS）和4%多聚甲醛（4% PFA）。图中针尖指向左心室。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="示意图、脑切片、直方图分析和神经解剖学研究展示的脑切片过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：注射sEVs后伊文思蓝外渗的分析。 （A）显示伊文思蓝外渗的全脑代表性图像。虚线表示从全脑获取的九个切片区域。（B）使用小鼠脑切片器进行脑组织解剖。（C）注射sEVs后24小时的脑切片代表性图像。对照组（CTL）、常氧条件下的胎盘来源sEVs（sEVs-Nor）或缺氧条件下的胎盘来源sEVs（sEVs-Hyp）。比例尺 = 0.4 cm。（D）使用ImageJ对脑切片进行数字轮廓勾画。（E）蓝色通道的直方图。数值在75–110范围内与伊文思蓝外渗相关。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="不同脑区伊文思蓝外渗及CLDN5/β-actin比较的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65867/65867fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：注射胎盘外植体分离sEVs小鼠的伊文思蓝外渗及紧密连接蛋白5水平。（A）基于全脑切片计算的伊文思蓝（EB）外渗百分比。对照组（CTL，蓝色），常氧条件胎盘（sEVs-Nor，红色）或低氧条件胎盘（sEVs-Hyp，绿色）。（B）来自三个实验组的九个脑区中紧密连接蛋白5（CLDN5）的相对表达水平。以β-actin作为上样对照。数据表示为均值 ± 四分位间距。每个圆点代表一个独立的实验个体。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.005，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001；采用单因素方差分析（ANOVA）后接Bonferroni多重比较检验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65867/65867fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间 (h)</td>
			<td>对照组</td>
			<td>sEVs-常氧</td>
			<td>sEVs-低氧</td>
			<td>ANOVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>18.75 ± 0.250</td>
			<td>18.5 ± 0.288</td>
			<td>18.75 ± 0.250</td>
			<td>ns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>18.5 ± 0.866</td>
			<td>17 ± 0.707</td>
			<td>13.25 ± 1.750*α</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>19.25 ± 0.750</td>
			<td>17 ± 0.577</td>
			<td>11.75 ± 1.250*α</td>
			<td>0.002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>18.5 ± 0.645</td>
			<td>16.75 ± 1.109</td>
			<td>13 ± 0.816*α</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>19.5 ± 0.288</td>
			<td>17.75 ± 0.250</td>
			<td>10.25 ± 0.853*α</td>
			<td>&lt;0.0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">*p &lt; 0.01 与对照组比较。αp &lt; 0.01 与 sEVs-常氧组比较</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：注射sEVs后24小时小鼠快速昏迷与行为评分（RMCBS）。 评分以均值±标准误表示。动物评分越接近20分表示状态越正常，评分越低表明中枢神经系统功能障碍越严重。

本方案旨在评估在低氧条件下培养胎盘外植体（模拟子痫前期的某一特征）所分离出的小细胞外囊泡（sEVs）是否会破坏非妊娠成年雌性小鼠的血脑屏障。

脑血管并发症，包括脑水肿以及缺血性和出血性卒中，是导致与妊娠相关 maternal 死亡的首要原因……

我们的研究聚焦于胎盘与大脑之间的通讯。我们正在探索细胞外小囊泡是否可能破坏血脑屏障，以及这是否与子痫前期女性中观察到的细胞血管并发症相关的潜在机制有关。我们先前已证实，子痫前期女性的血浆可损害血脑屏障。然而，血浆中这种潜在有害因子的性质尚不明确。本实验室的研究表明，来自子痫前期孕妇血浆或在低氧条件下培养的胎盘所释放的细胞外囊泡会损害血脑屏障。胎盘来源的细胞外囊泡损害血脑屏障的潜在机制仍需进一步研究，包括对细胞外囊泡内容物的分析，例如调控脑内皮细胞消化蛋白表达的特定微小RNA（microRNAs）。使用无菌镊子开始提取人胎盘样本的外植体时，小心地从胎盘底板上移除血凝块。持续提取小块外植体，直至获得约10克的最终组织量。用培养基洗涤并重悬外植体后，将重悬的外植体均分为两份，分别放入两个100毫米的培养皿中。将其中一个培养皿置于标准常氧条件下，37摄氏度，含8%氧气和5%二氧化碳的环境中。将另一个培养皿放入含1%氧气的低氧培养箱中。在两种不同条件下培养组织块18小时后，继续收集组织块的条件培养基至15毫升离心管中。分别收集常氧和低氧条件下类器官培养的培养基至不同的离心管中。在室温下对收集的条件培养基进行连续离心。每次离心后，使用 20 至 100 微升移液器小心吸取上清液，弃去沉淀。对最后收集的上清液再进行一次离心。将获得的含有胎盘来源小细胞外囊泡（SEVs）的沉淀重悬于500 µL PBS中，并将悬液通过0.22 µm滤器过滤。胎盘来源的SEVs现已准备就绪，可用于注射小鼠。为了向小鼠注射小型细胞外囊泡（SEVs），请使用从人胎盘外植体中分离的SEVs，这些外植体在低氧和常氧条件下培养。将200微克胎盘SEVs溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，定容至终体积70微升。注射前，使用RMCBS量表评估动物的健康状况。然后使用带有30号针头的胰岛素注射器，将溶液注入已适当麻醉的小鼠颈外静脉。注射后，用干燥的棉签对注射部位施加轻压15秒。在注射后3、6、12和24小时，使用RMCBS评分系统评估小鼠的健康状况。为了分析伊文思蓝外渗，用 PBS 配制 2% 伊文思蓝染料溶液。通过眼眶后途径注射 SEV 后 24 小时，将伊文思蓝溶液注入适当麻醉的小鼠体内。待伊文思蓝在动物体内循环后，用约三毫升生理盐水对麻醉小鼠进行心脏灌注，以清除循环中的染料。在通过心脏灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定小鼠并小心取出脑组织后，称重并拍照。按照所示步骤，使用体视变倍显微镜从各组动物中提取脑组织，观察所获取的脑切片图像。利用所获取的图像，通过Image J软件定量分析伊文思蓝外渗情况。与注射了来自常氧胎盘的SEVs的小鼠不同，注射了来自缺氧胎盘SEVs的小鼠在注射后24小时内神经学评分呈进行性下降。注射了缺氧胎盘SEVs的小鼠脑组织中伊文思蓝外渗量高于注射了常氧胎盘SEVs的小鼠。注射了缺氧胎盘SEVs的小鼠脑组织中紧密连接蛋白claudin-5的含量减少，而该蛋白对血脑屏障的完整性至关重要。所有这些结果表明，缺氧胎盘来源的SEV引起了血脑屏障的破坏。

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医学

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