Name: 蛛网膜下腔出血后脑切片中重要和非重要脑周细胞的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 了解蛛网膜下腔出血后脑切片中活性和非活性周细胞的成像技术。该方法利用大鼠脑切片模型和免疫荧光标记，帮助研究人员区分存活与死亡的周细胞，揭示神经血管损伤机制。

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本研究得到中国国家自然科学基金（81960226，81760223）和云南省自然科学基金（202001AS070045，202301AY070001-011）的资助

实验方案经昆明医科大学动物伦理与使用委员会批准（编号：kmmu20220945）。本研究采用 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄均有，体重为 300–350 g。
1. 诱导蛛网膜下腔出血模型
<ol>
	<li>使用2%异氟烷和100%氧气对大鼠进行麻醉。通过持续吸入1%–3%异氟烷维持麻醉状态。使用立体定位仪（见材料表）固定大鼠头部。</li>
	<li>按照以下步骤建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型。
	<ol>
		<li>将微量注射针插入鞍上池，然后使用注射泵（见材料表）将来自大鼠尾动脉的自体血液（不含抗凝剂）注入鞍上池。</li>
		<li>根据以下坐标将微量注射针植入右侧侧脑室：前囟后方−0.8 mm，侧向1.4 mm，深度4 mm9。对于SAH组，注入0.2 mL大鼠尾动脉血液；对于假手术组，注入等体积的等渗盐水（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脑切片制备与稳定
<ol>
	<li>使用2%异氟烷吸入法对大鼠进行深度麻醉。断头后取出全脑，并将其浸入冰冻的人工脑脊液（ACSF）中。 
	注意：使用新鲜配制的ACSF溶液，其成分为：134 mM NaCl、2.8 mM KCl、29 mM NaHCO3、1.1 mM NaH2PO4、1.5 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2 和 10.11 mM D-葡萄糖（见材料表）。保持pH值在7.3至7.4之间。</li>
	<li>使用振动切片机（见材料表）在冰冻且通入5% CO2 和95% O2 的ACSF中，从SD大鼠脑组织制备厚度为200 µm的急性脑片（图2）。</li>
	<li>将200 µm厚的急性脑片置于储存室中的尼龙网架上，并完全浸没于ACSF中。用95% O2 和5% CO2 平衡ACSF溶液，维持温度在35–37 °C范围内。让脑片稳定孵育2小时，使其充分适应环境（图3）。</li>
</ol>
3. 使用 TO-PRO-3 对急性脑切片中的壁细胞进行标记
注意：使用示踪剂 TO-PRO-310 对急性脑切片中的周细胞进行荧光标记。
<ol>
	<li>将荧光染料 TO-PRO-3 加入 ACSF 中，使其终浓度达到 1 µM。将急性脑片置于含 TO-PRO-3 的 ACSF 中，在室温避光环境下孵育 20 分钟。 
	注意：操作 TO-PRO-3 时请佩戴乳胶手套以作防护。</li>
	<li>将承载脑片的尼龙网筛从加样室转移至6孔板冲洗室（见材料表）。让脑片在冲洗室中停留 10 分钟（图 4D）。 
	注意：此冲洗步骤可终止染色过程，降低背景染色，并防止非特异性染色。</li>
	<li>使用经 5% CO2 和 95% O2 混合气体平衡的 ACSF 溶液对样本进行冲洗，总时长为 15 分钟。此冲洗步骤可终止染料摄取，并最大限度减少背景染色（图 4C）。</li>
</ol>
4. 急性脑切片中脑微循环非活性周细胞的染色
<ol>
	<li>在避光环境中，将预先加载TO-PRO-3的脑切片与Alexa Fluor 488标记的异凝集素B4（FITC-ISOB4；5 µg/mL，参见材料表）在37 °C下共同孵育30分钟。孵育后，用ACSF冲洗脑切片15分钟（图4E）。</li>
	<li>按照常规方法，将脑切片置于经5% CO2和95% O2气体饱和的ACSF中孵育。在两种溶液中均加入终浓度为37 µM的碘化丙啶（PI），并在37 °C下进行孵育。此步骤可标记非活体脑周细胞。将样品在该ACSF溶液中于避光条件下继续孵育60分钟（图4F）。</li>
	<li>随后，用ACSF溶液冲洗样品15分钟，以终止染料摄取并降低背景荧光信号。</li>
</ol>
5. 急性脑切片中活体与非活体脑周细胞的成像
<ol>
	<li>使用塑料巴斯德吸管将脑切片轻轻转移至玻璃底共聚焦培养皿中（参见材料表）。向培养皿中加入先前用5% CO2 和95% O2 平衡的ACSF溶液。使用铁丝网将大鼠脑切片固定在适当位置。</li>
	<li>将玻璃底共聚焦培养皿转移至共聚焦显微镜的载物台上。将急性脑切片置于培养皿底部，并在共聚焦显微成像过程中持续灌流（perfuse）9 用95% O2 和5% CO2 混合气体平衡的ACSF溶液（图5A 和 图5Ab'）。</li>
	<li>使用40倍物镜观察大脑皮层微血管的管壁细胞。使用兼容软件（参见材料表）采集图像堆栈。针对IB4（激发/发射波长460 nm/520 nm）、PI（激发/发射波长545 nm/595 nm）和TO-PRO-3（激发/发射波长606 nm/666 nm）选择适当的滤光片（图5D）。 
	注意：图像采集参数如下：40× DIC N1物镜，3 × 12位，512 × 512像素（0.22 × 0.22 mm），标定值：0.42 µm/px。</li>
	<li>根据微血管网络结构及细胞形态识别大脑微血管及周细胞。在每张脑切片上定位包含大脑微血管网络的特定区域，并采集图像。</li>
	<li>仔细记录成像位置，以确保后续采集的一致性（图5B、C）。后续处理与分析可使用图像分析软件（ImageJ）及图像编辑软件（参见材料表）。</li>
</ol>

Visualization of Brain Pericyte Contractility Post-Subarachnoid Hemorrhage

<ol><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+properties+of+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li>
<li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li>
<li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li>
<li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+%CE%B12+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li>
<li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li>
<li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li>
<li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining%3A+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+An+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已开发出高分辨率共聚焦成像技术，用于在脑切片中可视化活体脑周细胞、非活体脑周细胞以及微血管系统。在急性大鼠脑切片中，该过程首先使用TO-PRO-311标记周细胞，随后用IB412标记微血管内皮细胞；接着使用PI鉴定已死亡的周细胞。该方案操作简便、可重复性强，适用于功能学研究。
为了特异性示踪神经系统中的脑周细胞，使用远红荧光染料TO-PRO-3。虽然TO-PRO-3主要对固定组织的细胞核进行染色13，但在生理盐水中体外应用时，可选择性地进入活的周细胞14。先前的研究已证实，使用TO-PRO-3可明确鉴定小鼠脑周细胞15。该荧光染料能有效标记活体脑周细胞11。相比之下，PI是一种常用于实时细胞活力评估的带电荧光染料12，在固定前应用时（即固定前PI染色）...

脑周细胞以其细长的突起和突出的胞体为特征，环绕在微循环周围1,2。虽然脑血流量的增加主要由毛细血管扩张驱动，但较小的动脉扩张速度较慢3。周细胞的收缩性可影响毛细血管直径及周细胞自身形态，从而调控血管动力学4。脑周细胞收缩会导致毛细血管变窄，在病理情况下，过度收缩可能阻碍红细胞流动5。多种因素可诱导脑毛细血管内周细胞收缩，例如由蓝斑释放的去甲肾上腺素6。周细胞在脑血流调节中发挥重要作用，并能够合成20-HETE，在高氧状态下充当氧感受器7。氧化-亚硝化应激引发的脑周细胞收缩对毛细血管产生不利影响5。尽管已有针对脑周细胞收缩的体内（in vivo）和离体（ex vivo）研究8，但关于脑切片中存活与非存活脑周细胞成像的研究仍十分有限。
关键的是，组织固定后的脑周细胞成像会损害其活力，从而影响后续收缩功能的评估。此外，在某些病理情况下（例如神经系统疾病，如蛛网膜下腔出血 - SAH），转基因标记脑周细胞的方法无法区分存活与非存活的周细胞，这一点已在我们先前关于SAH诱导的脑周细胞死亡的初步研究中得到证实9。
为了克服这些挑战，我们采用TO-PRO-3标记活体周细胞，而死亡的周细胞则用碘化丙啶（PI）进行染色。我们利用高分辨率共聚焦成像技术，在保持脑片活性的同时，对脑切片中的活体与非活体脑周细胞进行可视化观察。本文旨在介绍一种可重复的成像方法，用于在脑切片中观察活体与非活体脑周细胞，为研究蛛网膜下腔出血（SAH）后脑周细胞对脑微循环的影响提供有力工具。

<table><tbody><tr><td>6孔板</td><td>ABC biochemistry</td><td>ABC703006</td><td>RT</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td><td>RT</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>MIAOJIE</td><td>225 mm x 273 mm</td><td>RT</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>RT</td></tr><tr><td>共聚焦成像软件</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements 4.10.00</td><td>RT</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Nikon</td><td>N-SIM/C2si</td><td>RT</td></tr><tr><td>气体钢瓶（5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>PENGYIDA</td><td>40L</td><td>RT</td></tr><tr><td>玻璃底共聚焦培养皿</td><td>Beyotime</td><td>FCFC020-10pcs</td><td>RT</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>RT</td></tr><tr><td>胶水</td><td>EVOBOND</td><td>KH-502</td><td>RT</td></tr><tr><td>制冰机</td><td>XUEKE</td><td>IMS-20</td><td>RT</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>Image J</td><td>RT</td></tr><tr><td>吸入式麻醉系统</td><td>SCIENCE</td><td>QAF700</td><td>RT</td></tr><tr><td>凝集素B4-FITC</td><td>SIGMA</td><td>L2895&amp;ndash;2MG</td><td>分装后于&amp;ndash;20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447&amp;ndash;40&amp;ndash;7</td><td>RT</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>RT</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647&amp;ndash;14&amp;ndash;5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10049&amp;ndash;21&amp;ndash;5</td><td>RT</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>RT</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>NEST Biotechnology</td><td>318314</td><td>RT</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Scientific Industries Inc</td><td>Model 203</td><td>RT</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-D0815/CS-7538</td><td>分装后于&amp;ndash;20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>SCIENCE</td><td>QA</td><td>RT</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard PUMP</td><td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td><td>RT</td></tr><tr><td>恒温水浴箱</td><td>OLABO</td><td>HH-2</td><td>RT</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

脑出血后脑切片中脑周细胞活力成像

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

周细胞是位于脑微循环中的重要壁细胞，通过调节收缩性在主动调控脑血流中发挥关键作用。传统上，通过观察特定条件下周细胞的形态变化及其邻近毛细血管直径的改变来评估其收缩性。然而，在组织固定后，所成像脑周细胞的活性以及由此反映的周细胞收缩性评估会受到限制。同样，通过基因标记脑周细胞的方法难以区分存活与非存活的周细胞，尤其是在蛛网膜下腔出血（SAH）等神经系统疾病中，我们的初步研究已证实脑周细胞会发生死亡。为此，已开发出一种可靠的实验方案，可克服上述局限，实现在脑切片中同时对功能性与非功能性脑周细胞进行荧光标记。该标记方法可在高分辨率共聚焦显微镜下实现可视化，并可同时标记脑片中的微血管结构。这一创新性方案为评估脑周细胞的收缩性、其对毛细血管直径的影响以及周细胞自身结构提供了有效手段。在SAH背景下研究脑周细胞的收缩性，有助于深入理解其对脑微循环的影响。

在正常的生理条件下，脑周细胞通常不会发生细胞死亡。图6展示了这一现象，其中黄色表示存活的脑周细胞的存在；脑周细胞未被碘化丙啶（PI）染色，表明其具有活性。为了进一步研究周细胞在细胞死亡后是否仍附着于微血管，研究人员在蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠模型中采用了相关方法，并进行了后续成像分析。
已开发出在蛛网膜下腔出血（SAH）后对脑切片中存活和非存活脑周细胞进行成像的方法。如图7所示，存活的脑周细胞（蓝色箭头）位于微血管系统内，而非存活的脑周细胞由白色箭头标示。这种同步可视化方法可实现在脑切片中同时识别存活与非存活的脑周细胞。此外，观察到PI标记的非存活脑周细胞仍附着于整个微血管系统。
<img alt="动物手术装置；注射器采血；解剖检查；科研实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_uploa...

初步研究证实，蛛网膜下腔出血（SAH）可导致脑周细胞死亡。评估SAH后周细胞的收缩功能需区分存活与非存活的脑周细胞。因此，已建立一种可在脑组织切片中同时标记存活与非存活脑周细胞的方法，便于利用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。

周细胞是位于脑微循环中的重要壁细胞，通过收缩性在主动调节脑血流中发挥关键作用……

本研究显示，蛛网膜下腔出血（SAH）后6小时开始，周细胞死亡数量显著增加。研究结果表明，非活性周细胞的数量与SAH后经过的时间呈正相关。在SAH后的脑切片中对活性及非活性脑周细胞进行成像，以及周细胞分离技术，推动了本领域的研究进展。目前，要完全区分染色的周细胞和染色的内皮细胞仍然相当困难。我们的研究发现，蛛网膜下腔出血（SAH）后周细胞会出现依赖于收缩的凋亡现象。我们已建立了一种非常可靠的方案，能够同时对切除组织中的功能性与非功能性脑周细胞进行荧光标记。为建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型，将微量注射针插入麻醉大鼠的鞍上池。使用注射泵，将取自大鼠尾动脉的自体血液注入鞍上池。随后，根据给定坐标，将另一根针植入右侧侧脑室。对于蛛网膜下腔出血（SAH）模型，注射0.2毫升大鼠尾动脉血液；对于假手术组，注射等体积的等渗盐水。断头后，取出大鼠全脑并浸入冰冻的人工脑脊液（ACSF）中。使用振动切片机在冰上预冷并平衡的ACSF中制备200微米厚的急性脑切片。将脑切片置于浸没在平衡ACSF中的尼龙网上，并放入储存室中，在35至37摄氏度下保存。为标记周细胞，将荧光染料TO-PRO-3加入人工脑脊液（ACSF）中。现在将新切好的大鼠脑片置于含染料的ACSF中，在室温避光条件下孵育20分钟。接着，将带有脑片的尼龙网筛转移至六孔板冲洗室中，让脑片在其中静置10分钟。为了标记非活性周细胞，将TO-PRO-3标记的脑切片在结合异硫氰酸荧光素的凝集素B4中于37摄氏度避光孵育30分钟。孵育后，用人工脑脊液冲洗脑切片15分钟。接着，将脑切片置于用5%二氧化碳和95%氧气饱和的ACSF中。在此基础上，于37摄氏度条件下加入终浓度为37微摩尔的碘化丙啶。为终止染料摄取并尽量减少背景染色，用ACSF冲洗样本15分钟。在正常生理条件下，脑周细胞不会发生细胞死亡。检测到未被碘化丙啶染色的存活周细胞。蛛网膜下腔出血模型显示微血管内存在有活力的周细胞。同时也检测到了无活力的周细胞。碘化丙啶标记的非活性周细胞仍附着于整个微血管系统。首先，使用塑料巴斯德吸管将荧光染色的脑切片轻柔转移至玻璃底共聚焦培养皿中。向这些培养皿中加入已平衡的ACSF。使用铁丝网将大鼠脑切片固定到位。接着，将玻璃底共聚焦培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台上。将急性脑切片置于培养皿底部，并在成像过程中用平衡过的ACSF进行灌流。使用40倍物镜观察脑皮层微血管的管壁细胞。随后，使用兼容的软件采集图像序列。根据血管网络结构和形态特征识别脑微血管及周细胞，然后在每张脑切片上定位包含脑微血管网络的特定区域，并采集图像。在正常的生理条件下，脑周细胞不会发生细胞死亡。检测到未被碘化丙啶染色的存活周细胞。蛛网膜下腔出血（SAH）模型显示微血管内存在有活力的周细胞。也检测到无活力的周细胞。碘化丙啶标记的无活力周细胞仍与整个微血管系统分离。

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