脑出血后脑切片中脑周细胞活力成像

本研究显示，蛛网膜下腔出血（SAH）后6小时开始，周细胞死亡数量显著增加。研究结果表明，非活性周细胞的数量与SAH后经过的时间呈正相关。在SAH后的脑切片中对活性及非活性脑周细胞进行成像，以及周细胞分离技术，推动了本领域的研究进展。

目前，要完全区分染色的周细胞和染色的内皮细胞仍然相当困难。我们的研究发现，蛛网膜下腔出血（SAH）后周细胞会出现依赖于收缩的凋亡现象。我们已建立了一种非常可靠的方案，能够同时对切除组织中的功能性与非功能性脑周细胞进行荧光标记。

为建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型，将微量注射针插入麻醉大鼠的鞍上池。使用注射泵，将取自大鼠尾动脉的自体血液注入鞍上池。随后，根据给定坐标，将另一根针植入右侧侧脑室。

对于蛛网膜下腔出血（SAH）模型，注射0.2毫升大鼠尾动脉血液；对于假手术组，注射等体积的等渗盐水。断头后，取出大鼠全脑并浸入冰冻的人工脑脊液（ACSF）中。

使用振动切片机在冰上预冷并平衡的ACSF中制备200微米厚的急性脑切片。将脑切片置于浸没在平衡ACSF中的尼龙网上，并放入储存室中，在35至37摄氏度下保存。为标记周细胞，将荧光染料TO-PRO-3加入人工脑脊液（ACSF）中。

现在将新切好的大鼠脑片置于含染料的ACSF中，在室温避光条件下孵育20分钟。接着，将带有脑片的尼龙网筛转移至六孔板冲洗室中，让脑片在其中静置10分钟。

为了标记非活性周细胞，将TO-PRO-3标记的脑切片在结合异硫氰酸荧光素的凝集素B4中于37摄氏度避光孵育30分钟。孵育后，用人工脑脊液冲洗脑切片15分钟。接着，将脑切片置于用5%二氧化碳和95%氧气饱和的ACSF中。

在此基础上，于37摄氏度条件下加入终浓度为37微摩尔的碘化丙啶。为终止染料摄取并尽量减少背景染色，用ACSF冲洗样本15分钟。在正常生理条件下，脑周细胞不会发生细胞死亡。

检测到未被碘化丙啶染色的存活周细胞。蛛网膜下腔出血模型显示微血管内存在有活力的周细胞。同时也检测到了无活力的周细胞。

碘化丙啶标记的非活性周细胞仍附着于整个微血管系统。首先，使用塑料巴斯德吸管将荧光染色的脑切片轻柔转移至玻璃底共聚焦培养皿中。向这些培养皿中加入已平衡的ACSF。

使用铁丝网将大鼠脑切片固定到位。接着，将玻璃底共聚焦培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台上。将急性脑切片置于培养皿底部，并在成像过程中用平衡过的ACSF进行灌流。

使用40倍物镜观察脑皮层微血管的管壁细胞。随后，使用兼容的软件采集图像序列。根据血管网络结构和形态特征识别脑微血管及周细胞，然后在每张脑切片上定位包含脑微血管网络的特定区域，并采集图像。

在正常的生理条件下，脑周细胞不会发生细胞死亡。检测到未被碘化丙啶染色的存活周细胞。蛛网膜下腔出血（SAH）模型显示微血管内存在有活力的周细胞。

也检测到无活力的周细胞。碘化丙啶标记的无活力周细胞仍与整个微血管系统分离。