远程神经元激活结合自动化采血以诱导并测量小鼠循环黄体生成素

我们的目标是了解特定神经元群体在调节黄体生成素脉冲式分泌中的作用。为此，我们需要精确控制神经元的分布、身份和活性，同时在不干扰或应激动物的情况下连续采集血液样本。目前在清醒小鼠中进行连续采血的方法仅限于尾部切割，需要较长的训练周期，并且容易受到人为操作和环境应激的影响。

无需研究人员在场即可进行自动输注和采血，从而减少小鼠应激，能够在清醒、自由活动且未受干扰的小鼠中捕捉激素水平的变化。该技术为神经科学研究提供了强有力的支持，是一项重要的研究工具。密歇根小鼠代谢表型分析中心将自动输注及广泛的采样实验作为核心服务提供。

首先，向麻醉后的小鼠注射预防性镇痛剂。使用电推剪剃除小鼠头部的毛发。将动物固定于立体定位仪上，并正确安置耳杆。

将小鼠的口腔固定在小鼠固定装置上，并小心地将舌头置于外部，以防止窒息。检查麻醉深度后，在动物身体下方放置高度调节支撑物，确保身体和头部保持水平。使用带有纸张的加热垫以维持动物的体温。

在双眼上涂抹药膏以防止干燥。然后使用碘和酒精对小鼠头部进行消毒。使用手术刀沿头部正中线做切口，切口从眼睛后方延伸至人字缝后方。

暴露颅骨，并用浸有0.9%氯化钠溶液的无菌棉签擦拭。在体视显微镜下识别嗅前静脉（RRV），并用无菌铅笔标记。以无菌针头作为参考，确认脑部的方向。

确保背腹（DV）和内侧-外侧（ML）坐标不变。接下来，将装有病毒溶液的无菌玻璃移液管移至RRV参考点，以确定前后方向的零点参考位置。沿矢状缝推进移液管，直至到达选定的前后坐标。

用无菌铅笔标记该位置，然后提起针头。小心地在标记位置周围钻出一个小圆圈，以避免损伤上矢状窦，并用小镊子移除该片颅骨。接着以上矢状窦中线作为内外侧参考，将移液管移至相应位置，并缓慢下降直至接触硬脑膜，以此作为背腹向参考。

在硬脑膜上制造轻微裂口，将移液管下降至选定的背腹侧位置。向脑内注射指定体积的腺相关病毒（adeno-associated virus）或 AAV 载体，随后撤出移液管。松开小鼠的耳杆固定装置。

然后使用外科缝合夹闭合皮肤。将动物转移至单独的加温笼子中以恢复。密切观察小鼠的恢复情况。

待其恢复意识后，将其放回原来的饲养笼中。首先，向小鼠脑内注射腺相关病毒载体。病毒注射后三至四周，剃除麻醉小鼠颈部腹侧和背部区域的毛发。

使用碘伏溶液与70%乙醇溶液交替进行三次消毒，清洁剃毛区域。在肩胛骨之间的皮肤上做腹部切口。随后，将手术纱布覆盖在切口上，并将动物置于仰卧位，头部朝向手术者。

然后在锁骨上方的右侧颈部做一个小的纵向切口，以暴露右颈总动脉和颈外静脉。分离皮下组织后，暴露右侧颈外静脉，并将缝线置于静脉下方。结扎颈外静脉的远端以阻断血流。

使用显微镊子和剪刀，在塌陷的静脉上做一个小切口。然后将静脉导管斜面向下插入，并向近心端推进至上腔静脉，直至到达右心房。使用7-0丝线缝合线将导管固定于血管上。

解剖结缔组织以暴露右侧颈总动脉。在颈内动脉与颈外动脉分叉处预先放置两根7-0丝线缝合环，保持未打结状态。为暂时阻断血流，牵拉预先放置的缝合环即可。

然后使用显微剪刀或27号针头，在血管壁上制造一个小开口。在松开缝合线环的同时，将动脉导管向近端插入，并推进导管使其到达主动脉弓，注意避免接触主动脉瓣。使用先前放置的两根缝线将导管固定于血管上。

将所有导管皮下穿行，经颈部背部的预切切口引出，然后闭合腹侧切口。将导管连接至由25号针头导管制成的硅胶涂层管路连接器的静脉或动脉接口。在闭合腹侧切口后，当背部皮肤缝合封闭时，将连接器固定于皮下。

使用不锈钢外科导丝，用肝素化生理盐水填充导管，并紧密堵塞导管末端。术后24小时将动物连接至自动采血系统时，将悬吊钩连接到动物颈部背面的金属环上，并连接动脉导管。动脉导管与注射管路连接后，将静脉导管连接至采样管路。

设定注射时间为每分钟500微升，剂量为每千克0.5毫克。设定采血时间、频率以及用生理盐水进行的样本稀释。系统将自动补充等量的生理盐水以替代采集的血液。

执行自动化的注射前采血。接着，以每分钟500微升的注射速率自动静脉注射药物氯氮平-N-氧化物。然后进行注射后血液采样。

展示了在弓状核接受单侧立体定位注射AAV-hM3Dq mCherry的成年kiss1-EYFP雌性小鼠中的黄体生成素分泌模式。动情间期的黄体生成素水平通常较低，但由于其脉冲式释放，通常可观察到波动。注射氯氮平N-氧化物后，黄体生成素水平出现急剧上升。

大多数mCherry神经元与Kiss1-EYFP共定位，表明病毒和神经元激活特异性地针对目标细胞群。图中显示了动情间期野生型小鼠黄体生成素的脉冲式释放模式，以及其对腹腔注射kisspeptin-10的反应。观察到典型的动情间期雌性小鼠的黄体生成素脉冲，表现为基础黄体生成素水平较低。

给予kisspeptin后，黄体生成素出现迅速且显著的升高。