Name: 远程神经元激活与自动血液采样相结合，以诱导和测量小鼠体内循环黄体生成素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解远程神经元激活与自动血液采样相结合的方法，用于诱导和测量小鼠体内循环黄体生成素。该技术通过AAV病毒载体精准操控神经元活动，实现无应激激素监测，为生殖神经内分泌研究提供可靠工具。

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感谢 Daniel Haisenleder 博士在测试不同血液稀释方法过程中提供的帮助。血清激素检测由弗吉尼亚大学生殖研究中心配体检测与分析核心实验室完成，该实验室由 Eunice Kennedy Shriver 国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助项目 R24 HD102061 支持。密歇根小鼠代谢表型分析中心-活体（Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live）由美国国立卫生研究院（NIH）中心资助项目 U2C DK135066 支持。JF 和 NQ 的研究工作获得资助项目 DK020572（MDRC）和 DK089503（MNORC）的支持。CFE 和 CSM 的研究工作获得 NICHD 资助项目 R21 HD109485 和 R01 HD096324 的支持。

所有动物实验操作均依照《美国国家研究委员会实验室动物护理与使用指南》进行18 以及联邦、州和地方法律。本方案演示使用成年雌性小鼠（3-6月龄），包括4只C57BL/6J雌性小鼠和4只Kiss1-Cre;ChR2-eYFP（Kiss1-eYFP）雌性小鼠。小鼠饲养于12小时光照:12小时黑暗循环条件下，环境温度控制在22 °C，并提供标准饲料喂养 随意摄取 采用低植物雌激素饮食。实验操作和方案已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，动物实验方案编号：PRO00010420 和 PRO00010138）的批准。
1. 将 AAV 递送至特定细胞群体的立体定位注射
<ol>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>对所有器械进行灭菌。准备多套外科手术器械包，确保每套器械包用于不超过五只动物。准备无菌手套，每只动物至少使用一副。</li>
		<li>使用以下参数（参见材料表）拉制用于注射的玻璃微电极，以获得细长、注射平稳且不易堵塞的微电极：加热1：915，加热2：630，拉制：630。根据不同的拉制仪优化上述参数。</li>
		<li>在指定的手术区域进行操作。使用70%乙醇对术区表面进行消毒。</li>
		<li>使用无菌手术单以维持手术区域的无菌状态。穿戴洁净的实验服或一次性手术衣，并佩戴口罩。</li>
		<li>准备吸入式麻醉系统。打开氧气供应，并将流速调节至0.8 L/min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>将小鼠放入麻醉箱，开启异氟烷至2.5%。初始诱导后将异氟烷流量降至2%，并在整个手术过程中维持该流量。如采用其他麻醉方法，请参照动物实验方案及当地伦理委员会指南。</li>
		<li>根据动物使用委员会建议及当地法规，预先注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg，皮下注射）。</li>
		<li>使用电动剃毛器剃除小鼠头部毛发。</li>
		<li>将动物固定于立体定位仪上，安装耳杆，并确保头部正确固定且稳定。将小鼠的嘴部固定在咬合器上，注意将舌头移至一侧并置于口外，以防窒息。</li>
		<li>手术开始前通过脚趾夹捏测试确认动物已深度麻醉，并在手术过程中持续监测其呼吸频率和体色变化。</li>
		<li>在小鼠身体下方放置垫高支撑物，以保持躯干与头部处于水平位置。使用覆盖纸巾的加热垫为动物保温。双眼涂抹眼膏，防止角膜干燥。</li>
		<li>尽可能保持手术区域清洁。佩戴无菌手套。在切开皮肤前，使用碘伏和酒精对小鼠头部进行消毒。使用手术刀沿中线切开头皮，切口范围约从眼后至人字缝后方。暴露颅骨后，用浸有无菌0.9% NaCl溶液的棉签清洁表面。</li>
		<li>找到前嗅静脉（RRV），并用无菌记号笔标记。后续操作使用体视显微镜进行。 
		注：我们发现以前嗅静脉作为前后方向（AP）参考点效果更佳，但通常以前囟（bregma）作为参考。</li>
		<li>使用无菌针头作为参考，确认在进行立体定位测量前脑部方向正确。同时确保前嗅静脉和人字缝处颅骨表面的高度以及左右倾斜度一致（± 0.02 mm）。 
		注：当注射靶点位于更外侧的脑区时，左右倾斜度的影响更为显著。</li>
		<li>将无菌玻璃微电极吸入待注射的病毒溶液。将其移至前嗅静脉处作为前后方向（AP）零点参考。沿矢状缝移动至目标AP坐标位置，用无菌记号笔标记该位置，抬起针头，随后进行颅骨开窗。</li>
		<li>小心钻出围绕标记点的小圆孔，避免损伤上矢状窦。钻孔时将钻头倾斜而非垂直放置，以减少钻孔压力。使用小镊子移除颅骨碎片。</li>
		<li>暴露血管后，以上矢状窦中线作为内外侧（ML）参考（即0点），此方法比使用矢状缝更为精确。移动至目标ML坐标位置。将微电极下降至接触硬脑膜，作为背腹向（DV）参考（即0点）。轻微刺破硬脑膜后，将微电极继续下降至目标DV位置。</li>
		<li>注入所需体积的AAV病毒（50–200 nL），留置微电极3分钟以确保液体充分扩散。随后小心将微电极从脑组织中撤出。</li>
		<li>松开耳杆，解除动物固定。使用手术夹或其他合适方式缝合皮肤。将动物置于独立的加温笼中恢复。密切观察其苏醒后的恢复情况、反应性及活动能力。待完全恢复后，将小鼠放回原饲养笼。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行后续实验步骤前，至少等待3–4周以确保病毒充分表达。</li>
</ol>
2. 颈静脉和颈动脉插管
<ol>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>在指定的手术区域进行手术操作。在开始操作前，使用70%乙醇对手术台面进行消毒。准备多套手术器械包，确保每套器械包用于不超过五只动物。</li>
		<li>将所有手术器械进行高压灭菌。随后，在每次手术之间使用无菌水或生理盐水清洗，并按照制造商说明使用热珠灭菌器对器械灭菌至少15秒。</li>
		<li>使用无菌手术巾以维持手术区域的无菌状态。穿戴洁净的实验服或一次性手术衣，并佩戴口罩。</li>
		<li>准备用于颈动脉和颈外静脉插管的微型导管。动脉导管由一段微小的Microrenathane管（拉伸后外径[OD]为0.025英寸，内径[ID]为0.012英寸）与Silastic管（外径0.025英寸，内径0.012英寸）连接而成；静脉导管仅使用Silastic管（外径0.025英寸，内径0.012英寸）。所有导管在手术前需在70%乙醇中浸泡过夜。</li>
		<li>根据动物的体重和体长预估长度，将两根导管的切割端以45°角进行斜面处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>使用台式低流量异氟烷系统，以2%异氟烷对动物实施麻醉，以精确控制手术期间的麻醉深度和阶段。</li>
		<li>预先注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg，皮下注射），并涂抹眼用软膏以防止角膜干燥和损伤。</li>
		<li>剃除颈部腹侧和背部区域的毛发，并使用碘伏溶液与70%乙醇交替清洗皮肤三次。在肩胛骨之间做一条垂直皮肤切口（12 mm），并用手术纱布覆盖以备后续使用。将动物置于仰卧位，头部朝向术者。</li>
		<li>以下所述操作的大部分步骤均使用体视显微镜进行。</li>
		<li>在颈部右侧锁骨上方做一小段垂直切口（约10 mm），剪开皮肤后使用尖端精细的无齿显微镊进行钝性分离，以暴露皮下组织，进而显露右侧颈外静脉和右侧颈总动脉。</li>
		<li>结扎颈外静脉远端以阻断血流，使用显微镊和剪刀在塌陷的静脉壁上剪开一小孔。将静脉导管斜面朝下、近端朝前插入，使用显微镊辅助推进，使其经上腔静脉到达右心房水平。对于体重30 g的瘦小小鼠，插入长度约为10–12 mm。使用7-0丝线将导管与血管结扎固定。 
		注：当导管位置正确时，可轻松回抽血液；否则导管可能误入胸外侧静脉，需重新插入。</li>
		<li>仔细分离结缔组织，暴露位于胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和二腹肌所围成三角区域内的右侧颈总动脉。必要时使用金属牵开器分离上述肌肉。在颈内动脉与颈外动脉分叉处使用7-0丝线结扎动脉，并预先放置两根未打结的缝合线环于近端。</li>
		<li>通过牵拉预先放置的缝合线环暂时阻断血流，使用显微剪刀或27 G针头在血管壁上剪开或穿刺一小孔。将动脉导管斜面朝下、近端朝前插入至预估长度，使其到达主动脉弓水平但不接触主动脉瓣。对于体重30 g的瘦小小鼠，插入长度约为9–10 mm。使用两根预先放置的缝线将导管与血管结扎固定。</li>
		<li>将所有导管经皮下隧道引出，通过预先切开的背部切口穿出，并连接至由25 G针管制成的硅胶涂层管路连接器的静脉或动脉接口：该连接器为改良型MASA19，由两段25 G针管和两段4.0 cm长的PE-20管组成，外层套有2.0 cm长、内径0.062英寸的Silastic管，并附带一小段金属丝制成的环。每根导管（含连接器）的总管腔体积为6–8 µL（图1A）。</li>
		<li>缝合腹侧切口，并在背部皮肤缝合时将连接器皮下固定。用肝素化生理盐水（200 U/mL）充满两根导管，并用不锈钢手术丝线紧密封堵末端。</li>
		<li>小鼠在数分钟内即可从异氟烷麻醉中恢复，术后5天内完全康复。手术后24小时将动物放入自动化采血饲养舱，通过将系统上的系绳挂钩连接至颈部背部植入的管路连接器上的金属环，使动物与系统相连。在采血开始前24小时，将动脉和静脉导管分别连接至系统的采样管路和注射管路（图1B）。采样管路总长度为55 cm，管腔体积为40 µL。 
		注：注射与采样管路的设置、采样程序的编程以及自动化采血系统笼体的平衡机制已有详细描述20,21。该系统通过每20分钟自动注入10 µL肝素化生理盐水以保持导管通畅。</li>
		<li>通过系统的计算机程序设定给药前采样、给药及给药后采样的时间与频率。当前参数设置详见下文步骤3.1。</li>
		<li>该系统通过感知小鼠运动并使饲养舱向相反方向旋转，使动物可在不缠绕采样和/或输注管路的情况下自由活动21（图1）。</li>
		<li>在输注或注射开始前至少2小时，重新填充输注或注射管路中的化合物，并重新连接至静脉导管。 
		&#8203;注：手术可能出现并发症，需密切监测动物术后恢复情况及术后数日的状态。请参照动物实验方案中的正确监测方法、终止标准及相关操作流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 自动化采血与静脉注射
<ol>
	<li>自动采血
	<ol>
		<li>要遵循本方案，请使用一个 采样体积 的 20.0 µL 并设置一个间隔&#160;即， 7.0 分钟) 每次取样之间 具有一个 采样频率 的每一 每样本 10.0 分钟。该 最大速率 连续采样 3.0 分钟/样品；该 最小值 可能的 采样体积 是 5.0 µL系统会自动回输等量的生理盐水以替代采集的血液，维持体液平衡。</li>
		<li>设定 总采样时间 作为 30 (t = -30 - 0分钟前和 30 (t = 0 - 30) 分钟 在静脉注射CNO（0.5 mg/kg， 图2).</li>
		<li>每份采集的血液样本（20.0 µL）将被自动稀释于&#160;50 µL 生理盐水（含 10 U/mL 肝素）&#160;并由系统存放在冷藏样品转盘中的微量离心管内，单独保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动静脉注射
	<ol>
		<li>在采血开始前至少2小时，断开静脉管路与静脉导管的连接，重新填充CNO（按0.5 mg/kg剂量计算，体积约为50–60 µL）。</li>
		<li>用注射器从管路中逆行手动抽出溶液（略多于计算体积），在溶液与管路中已有的生理盐水之间留出一个小的气泡。</li>
		<li>重新连接注射管路至静脉导管，并设置 注射速率 在 500 µL/min 以及 注射开始时间 在 2 分钟 t = 0 采样结束后。该 每只动物的总注射时间 是 5-6 秒. 
		注意：如有需要，也可通过手动腹腔注射（IP）给予化合物，但这将在血液采集程序期间或之前干扰动物。我们在结果部分也展示了这一替代方法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 动物灌注和脑组织采集（可选）
注意：仅当需要分析神经元激活的脑区位置或下游反应时，才应遵循此操作步骤。
<ol>
	<li>在采血程序结束时，将小鼠从采血系统中断开。静脉注射后2小时，使用首选方法或如其他文献所述方法，用10%中性缓冲福尔马林（NBF）灌注动物22。</li>
	<li>解剖脑组织，并将其保存于含20%蔗糖的10% NBF溶液中固定3小时。</li>
	<li>3小时后，将固定好的脑组织转移至含20%蔗糖的PBS溶液中，于4 °C保存，直至准备切片。 
	注意：避免过度固定，否则会掩盖cFOS抗原。在20%蔗糖溶液中，脑组织应沉入容器底部。</li>
	<li>使用冷冻切片机或恒冷切片机进行切片，并采用合适的方法检测神经元激活情况（例如，本文展示了cFOS免疫组织化学染色结果）。 
	&#8203;注意：本实验所用抗体详见材料表。</li>
</ol>
5. 样品处理与分析
<ol>
	<li>实验结束后立即将血样从自动采样器中取出，并置于冰上。</li>
	<li>以 14,000 × g 离心 30 秒。</li>
	<li>收集血浆，于 -80 °C 保存直至分析。</li>
	<li>按照先前所述方法10,23，采用 LH ELISA 检测血样。</li>
</ol>

DREADDs Technology and Automated Blood Sampling

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过本方案，我们能够显示神经元群体在基础状态下的黄体生成素（LH）脉冲式分泌以及刺激后的LH分泌。该系统的主要优势在于采样过程处于无应激的环境中，采样期间无需人员在场或对动物进行操作。此外，实验前无需耗时的动物训练，也无需让动物适应人员在场或操作。以往采用手动采血的实验需要投入大量时间和精力以尽量减少应激因素7,31,32。然而，仅剪尾操作本身即构成一种应激刺激33。在共享动物设施中实施无应激环境和训练范式可能受到不可预测干扰的限制。在某些实验室中，动物通常需要被转运至其他操作室进行采血。这些限制可能使手动方法不适用于检测LH水平的细微变化，因此在这些情况下，非接触式方法可能更为适用。自动采样系统设置于安静的房间内，小鼠需提前数天放置其中以适应新环境。我们此前使用该方案的经验表明，可精确检测小鼠皮质酮和脉冲式生长激素的分泌模式，并且在自动采样过程中未观察到皮质酮水平升高15。在本研究的实验中，所有动物均很好地适应了采样系统，在采样约24小时后于采样舱内表现出筑巢行为，毛发色泽光亮，表明其无应激反应且整体健康状况良好（图1）。
导致实验结果呈阴性的主要困难可能是腺相关病毒（AAV）未能准确靶向目标神经元群体。立体定位注射的精确性至关重要，因此应在正式实验前进行预训练，以验证注射坐标和注射体积。预训练可通过在非存活手术中向目标位置注射少量0.5-1%伊文思蓝溶液实现，随后使用小鼠脑切片模具（例如Ted Pella）对新鲜解剖的脑组织进行切片，并借助体视显微镜观察注射位点及范围，以确认注射准确性。
还需要注意的是，从自动采血系统收集的血液和血浆会被肝素化生理盐水稀释（例如，在我们的结果中，20 µL 血液稀释于 50 µL 生理盐水中）20，且可能需要根据所选分析方法的灵敏度调整稀释比例。我们测试了将全血稀释于 BSA-PBS（如超敏 LH ELISA 所推荐）10 或生理盐水中检测 LH 水平，发现 LH 测定值无差异。稀释液中不能使用 Tween，因为其会进入血液循环，通过替换样本液体来提取样本20。根据我们的经验，稀释倍数小于 1:10 时可获得良好的 LH 检测结果，但与 1:3.5 稀释相比，LH 水平略有低估。这表明如有必要，可进一步调整稀释比例以减少采集的血量。
一种替代自动化化合物递送的方法是通过静脉导管进行手动注射。在此情况下，研究人员会短暂进入房间以完成注射操作。然而，该过程不涉及与动物及其饲养环境的直接接触，并且与腹腔或皮下注射不同，动物通常不会察觉整个操作过程。手动注射的优点在于无需预先配制化合物稀释液，这对于那些因成本过高而不适合在较大体积中使用，或随时间推移易发生降解的化合物尤为重要；此外，由于操作体积较小，相较于自动化递送（后者需要以更多化合物溶液预填充输注管路和导管）更为节约。
自动采血为研究睡眠期间黄体生成素（LH）的变化提供了独特的机会。我们经常观察到动物在采血期间于巢穴中自然睡眠。该采血过程可与脑电图（EEG）记录相结合，从而更详细地分析神经活动与LH分泌模式之间的关系34。如本研究所示，自动采血的应用范围广泛：既可用于基础状态下的LH采样，也可用于检测LH对内源性或外源性化合物的反应，或对神经元群体进行激活或抑制后的LH变化。神经元操控可通过化学遗传学或光遗传学进行急性干预，也可利用转基因小鼠模型及促凋亡或神经元沉默工具实现长期干预。自动采血还可用于检测其他具有强烈脉冲式分泌特征的激素（例如生长激素15）。在雌性小鼠中，若需特定动情周期阶段，可在启动实验方案前数小时小心采集阴道涂片26，而不会干扰输注和采血管路。动物可连接至采样系统达7–10天，但随着时间延长，动脉导管发生堵塞的风险会逐渐增加。
然而，该技术仅限于单独饲养的动物使用，因此可能不适用于研究社会互动行为。此外，该技术具有侵入性，且需要技术难度较高的手术操作，因此可能无法在幼年动物或某些疾病模型中实施。最后，由于购买该系统的成本可能过高，单个研究实验室难以承担，建议将其建立在核心实验室中，作为提供所述实验方案的服务平台。
综上所述，本实验方案展示了如何进行立体定位注射腺相关病毒（AAV）并结合自动化血液采样。该技术实现了精确的空间和时间控制，且可灵活应用于不同动物模型、检测方案及激素种类，因而是研究啮齿类动物激素调控的有力方法。尤为重要的是，该方法通过在注射和/或采样过程中消除人为干预和动物抓取，并省去前期训练步骤，为实验动物提供了无应激的环境。这些优势，加之多路复用的可能性，使该方法成为研究清醒、自由活动且不受干扰的小鼠神经调控激素变化的独特工具。

下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的核心调控机制是促性腺激素释放激素（GnRH）以脉冲方式释放进入垂体门脉系统。在垂体中，GnRH 控制促性腺激素——黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）——以脉冲形式释放到循环系统中。LH 的脉冲式释放是中枢 HPG 轴功能的标志性特征1,2,3,4。例如，它可反映遗传改变或激素及环境因素变化对轴的神经部分的影响5,6,7。直到最近，由于需要高频采样和较大的血样体积才能识别脉冲，LH 脉冲模式的测量仅限于大型哺乳动物8和大鼠9。
检测小鼠中的黄体生成素（LH）脉冲具有重要意义，因为该物种拥有广泛的遗传模型，且易于通过基因组工程技术进行操作，从而进一步研究特定基因和细胞群体。在过去十年中，利用夹心法黄体生成素酶联免疫吸附测定（LH ELISA）分析小鼠体内LH浓度的技术取得了重大进展，使得仅需微量血液即可检测LH10。频繁尾尖采血技术的发展，使得能够进行高频次采样，从而实现对小鼠LH脉冲频率和幅度的准确检测10,11。然而，尾尖采血仅适用于清醒状态下的动物，需要较长的训练周期，使小鼠适应操作过程以及采样期间特定研究人员的存在。该方法的成功率极易受到环境应激因素的影响，可能不适用于表现出高度焦虑行为的小鼠品系。心房插管技术也曾用于自由活动的清醒小鼠的频繁采血12。然而，该方法仍需重复手动采血，限制了动物的活动空间，且心房插管可能引起心脏功能的动态变化。因此，建立一种在无应激条件下，无需预先训练、无需人为操作或人员在场，即可对清醒、自由活动且不受干扰的小鼠进行血液采集的方法具有重要意义。
自动化的血液或透析液采样此前已被用于测量不同激素水平（例如褪黑素13,14）及其脉冲式分泌（例如生长激素）15，在未束缚的啮齿类动物中进行。本文介绍一种针对清醒且未束缚动物的自动化长期频繁采血方案，并结合化学遗传学技术实现对特定神经元群体的远程时序激活：&#160;即仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）。我们将描述腺相关病毒（AAV）载体的立体定位注射，以及通过自动化静脉（IV）给予氯氮平-N-氧化物（CNO）实现远程激活16,17。该方案可同时在多只动物中顺序检测黄体生成素（LH）脉冲的基础水平及诱导后的变化。血液采样和化合物的静脉给药均由计算机程序精确控制时间，无需研究人员亲自在场，也无需预先训练小鼠。该方法克服了手动采血的主要局限性，能够在无应激条件下进行血液采集，并实现静脉给药与远程神经元活动调控的同步操作。我们展示了单独使用自动化采血或将其与远程神经元激活结合的代表性结果，并讨论其优势、局限性及其他潜在应用。

<table><tbody><tr><td>AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td>不一定必须使用该病毒，但代表性结果中使用的是此病毒</td></tr><tr><td>酒精</td><td></td><td></td><td>消毒</td></tr><tr><td>麻醉诱导箱</td><td>Vetequip</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导机</td><td>Kent Scientific Equipment</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>小鼠用麻醉面罩</td><td>Kent Scientific Equipment</td><td>SOMNO-0801</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动夹施加器</td><td>Clay Adams</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动夹移除器</td><td>Clay Adams</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动夹</td><td>Clay Adams</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>BASi Culex 控制器</td><td>Culex</td><td>SN: 2151, 2152, 2156, 2158</td><td>4 个通道</td></tr><tr><td>BASi Honey Comb 组分收集器</td><td>Honey Comb</td><td>SN: 2105, 2106, 2107, 2108</td><td>4 个通道</td></tr><tr><td>BASi Ratrun 旋转控制器</td><td>RATURN 2</td><td>SN: 5680, 5681, 5682, 5683</td><td>4 个通道</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td></td><td>JAX # 000664</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Zoetis</td><td>Rimadyl</td><td>镇痛药</td></tr><tr><td>毛发修剪器</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯氮平-N-氧化物</td><td>ENZO</td><td>BLM-NS105-0005</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULEX 自动化活体采样系统</td><td>BASi</td><td>DS000627</td><td>含 CX-4000S 替换管路套装</td></tr><tr><td>带齿弯镊</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>钻机</td><td>Dremel</td><td>61100</td><td></td></tr><tr><td>Empis 控制模块</td><td>EMPIS CM</td><td>SN: 174</td><td></td></tr><tr><td>Empis 可编程输注系统</td><td>EMPIS</td><td>SN: 2125 , 2126, 2127, 2128</td><td>配备 CX-7010S 4 套 BAS-2 输注组件；4 个通道</td></tr><tr><td>Envigo 2016 饲料</td><td></td><td></td><td>低植物雌激素饲料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Dechra</td><td>Puralube Vet Ointment</td><td>凡士林眼用软膏</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>World Precision Instruments</td><td>MIB100-6</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>RS-7101</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Betadine 外科洗手液</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VetOne</td><td>Fluriso</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器或 SomnoSuite 低流量麻醉系统</td><td>Surgivet 或 Kent Scientific Corp</td><td>SS-01</td><td>麻醉机</td></tr><tr><td>Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) 小鼠</td><td></td><td>&amp;nbsp;JAX # 023436 和 #024109</td><td></td></tr><tr><td>Kisspeptin-10</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>048-56</td><td></td></tr><tr><td>Micro-renathane 管路&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>手术导管置入</td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>RS-5606</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;RS-7842</td><td></td></tr><tr><td>皮升级注射器</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td>P30</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物加热垫 X2</td><td>Stoelting</td><td>53850</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>RS-6808</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Liveo 实验室管路</td><td>NO.508-001</td><td>内径 0.012 英寸 × 外径 0.025 英寸</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>RWD</td><td>E06208</td><td></td></tr><tr><td>无菌 0.9% 生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>SKLAR</td><td>06-3011</td><td></td></tr><tr><td>手术体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>f-160</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz Surgical</td><td>&amp;nbsp; RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗-cFos&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ABE457</td><td>抗原靶点：cFos N 端；宿主生物：兔；使用稀释度：1:5,000；RRID: AB_2631318&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1010</td><td>抗原靶点：重组 GFP 缺失型；宿主生物：鸡；使用稀释度：1:10,000；RRID: AB_2307313&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SP-生物素偶联的驴抗兔 IgG 二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>711-065-152</td><td>抗原靶点：兔 IgG (H+L)；宿主生物：驴；使用稀释度：1:1,000；RRID: AB_2340593&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG，AlexaFluor 594 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21209</td><td>抗原靶点：大鼠 IgG (H+L)；宿主生物：驴；使用稀释度：1:500；RRID: AB_2535795&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>抗原靶点：鸡 IgY (H+L)；宿主生物：山羊；使用稀释度：1:500；RRID: AB_2534096</td></tr><tr><td>mCherry 单克隆抗体 (16D7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M11217</td><td>抗原靶点：mCherry 标签；宿主生物：大鼠；使用稀释度：1:5,000；RRID: AB_2536611&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

远程神经元激活结合自动化采血以诱导并测量小鼠循环黄体生成素

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

循环黄体生成素（LH）水平是评估下丘脑-垂体对生殖功能调控作用的重要指标。目前，多种输入信号及神经元群体在调节LH释放中的作用仍不明确。在小鼠中检测LH水平的变化常常具有挑战性，因为其极易受到环境应激的干扰。现有的测量LH释放及其脉冲波动的技术需要对小鼠进行长期训练，以适应操作应激、一定程度的束缚以及研究人员的存在，且通常只能针对单个动物进行，从而限制了其在许多研究问题中的应用价值。
本文介绍了一种利用仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）技术，结合自动化连续采血系统，在清醒、自由活动且未受干扰的小鼠中远距离激活特定神经元群体的技术。我们首先描述了立体定位手术方案，用于将表达DREADDs的腺相关病毒（AAV）载体递送至特定神经元群体。接着，我们介绍了颈动脉和颈外静脉插管的实验步骤，以及术后与CULEX自动化采血系统的连接方法。最后，我们阐述了通过静脉注射氯氮平-N-氧化物以实现远距离神经元激活及自动化血液采集的操作流程。该技术可在设定时间段内按程序实现每5分钟或更长时间间隔的自动化采样，并可在指定时间点或持续时间段内进行静脉给药。总体而言，我们发现该技术是研究神经内分泌调控的一种强有力的方法。

表达Kisspeptin的神经元（Kiss1 位于下丘脑弓状核的基因是促性腺激素释放激素（GnRH）的强效刺激因子，因而也是垂体释放黄体生成素（LH）的强效刺激因子24,25在本方案演示中，我们采用促吻素诱导的黄体生成素分泌来展示自动采血技术的工作原理。 图2 显示了成年Kiss1-eYFP雌性小鼠中典型的黄体生成素（LH）分泌模式，这些小鼠此前在弓状核（AP: -4.95, ML: -0.35, DV: -5.7）接受了单侧立体定位注射AAV-hM3Dq-mCherry。ChR2-eYFP被用作荧光报告分子 Kiss1 细胞。立体定位手术一个月后，小鼠接受颈动脉和颈外静脉插管，并在术后第4天连接至自动采血装置。术后次日开始采集血液以测定基础LH水平，采样频率为每10分钟一次（样品间间隔7分钟，每次采样持续3分钟），随后通过自动静脉注射CNO，并继续每10分钟采血一次，持续30分钟。动情间期的LH水平通常较低（图2A），但由于其脉冲式释放，通常会观察到变异图2B）。在注射CNO（并激活kisspeptin神经元）后，LH水平迅速上升（10分钟内）。上升的幅度和峰值持续时间取决于多种因素，包括注射位点、被激活的神经元数量或所靶向的神经元群体。
图3展示了在图2A中所示雌性小鼠弓状核的注射位点。Kiss1-eYFP神经元以绿色标记，而mCherry免疫反应性显示了AAV注射位点以及CNO处理后的激活区域。通过DAB标记的cFOS免疫反应性检测到被激活的神经元。大多数mCherry神经元与Kiss1-eYFP共定位，且其中许多神经元呈现cFOS免疫反应阳性，表明病毒转导及神经元激活特异性地发生在目标神经元群体中。
典型黄体期野生型（C57BL/6J）小鼠的促黄体生成素（LH）脉冲式释放模式及其对腹腔注射kisspeptin-10的反应示于 图4小鼠在手术后4天进行颈动脉插管，并连接至自动采血系统。次日早晨检测动情周期，并在动情间期进行采血和醋酸酮戊环肽-10（kisspeptin-10）注射。26每7分钟采集一次血液样本，持续2小时（注射前120分钟内，每4分钟间隔加3分钟采样），以测定基础水平及黄体生成素（LH）的脉冲分泌情况，随后进行腹腔注射kisspeptin-10（65 µg/kg）并在此后每7分钟继续采血一次，持续30分钟。观察到典型的间情期雌性黄体生成素（LH）脉冲分泌模式，表现为基础LH水平较低，脉冲频率约为每小时2次，脉冲幅度约为1 ng/mL27注射kisspeptin后，促黄体生成素（LH）迅速且显著升高28促性腺激素分泌模式及刺激后的变化与其他采用手动采血的研究结果一致10,27,29,30这些结果表明，自动化采血方法能够在无应激条件下捕捉到典型的以及受刺激的黄体生成素分泌模式。
<img alt="小鼠笼内电极装置的神经科学实验；脑活动监测设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：连接系统及小鼠与输注和采样系统管路连接的细节。（A）使用两根25G针头管和两根PE-20管、外层套有硅胶管并连接一个小金属环制成的硅胶涂层管路连接器（MASA）。（B）在采样笼中连接输注和采样管路的小鼠，在血液采样期间静卧于巢穴中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Kiss1-CRE AAV-hM3Dq CNO 对 LH 分泌的影响；折线图；注射后时间；激素水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：在弓状核注射 AAV-hM3Dq 并通过 CNO 远程激活的 Kiss1-Cre 雌性小鼠中 LH 脉冲的代表性结果。 基础 LH 水平每 10 分钟测定一次，持续 30 分钟。在采集血液后的 0 时刻，雌性小鼠接受静脉注射氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，0.5 mg/kg），随后继续从颈动脉每 10 分钟采集一次血液，持续额外 30 分钟。（A）显示基础 LH 水平较低的雌性小鼠。（B）显示注射前出现 LH 脉冲的雌性小鼠。缩写：Kiss1 = Kisspeptin；AAV = adeno-associated virus；CNO = clozapine-N-oxide；LH = luteinizing hormone。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经组织荧光显微镜，免疫组织化学，细胞分布，神经通路" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Kiss1-Cre;Chr2-eYFP（Kiss1-eYFP）雌性小鼠弓状核中的脑区激活情况表示为 图2A. ChR2-eYFP 仅用作报告基因以标记 kiss1 神经元。A低倍荧光图像显示在弓状核中的AAV注射位点。绿色：eYFP免疫反应性，洋红色：mCherry免疫反应性。B低倍明场图像，对应区域 图3A，显示在弓状核的AAV注射位点处cFOS免疫反应性（黑色）。(C高倍荧光与明场图像结合，展示神经元的更清晰细节 图3A，B共表达AAV-mCherry且被激活的Kiss1-eYFP神经元表现为白色胞质和黑色细胞核（箭头所示）。比例尺 = 50 µm (A，B), 20 µm (C缩写：Kiss1 = Kisspeptin；AAV = 腺相关病毒；eYFP = 增强型黄色荧光蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="LH激素水平图；发情间期Kisspeptin-10随时间的作用；数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：在发情间期的野生型雌性个体中，每7分钟测定一次基础LH脉冲分泌，持续2小时。 随后在0时间点给予该雌性个体腹腔注射Kisspeptin-10（65 µg/kg），并在之后半小时内每7分钟连续采集血样。缩写：LH = 黄体生成素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

黄体生成素（LH）的脉冲式分泌是生殖功能的显著特征。本文介绍一种通过远程激活特定神经元群体并结合连续自动采血的实验方案。该技术可实现定时激素调控、多重检测，并最大限度减少操作干预对清醒、自由活动且未受干扰动物体内LH水平的影响。

循环黄体生成素（LH）水平是评估下丘脑-垂体生殖调控功能的重要指标。……

我们的目标是了解特定神经元群体在调节黄体生成素脉冲式分泌中的作用。为此，我们需要精确控制神经元的分布、身份和活性，同时在不干扰或应激动物的情况下连续采集血液样本。目前在清醒小鼠中进行连续采血的方法仅限于尾部切割，需要较长的训练周期，并且容易受到人为操作和环境应激的影响。无需研究人员在场即可进行自动输注和采血，从而减少小鼠应激，能够在清醒、自由活动且未受干扰的小鼠中捕捉激素水平的变化。该技术为神经科学研究提供了强有力的支持，是一项重要的研究工具。密歇根小鼠代谢表型分析中心将自动输注及广泛的采样实验作为核心服务提供。首先，向麻醉后的小鼠注射预防性镇痛剂。使用电推剪剃除小鼠头部的毛发。将动物固定于立体定位仪上，并正确安置耳杆。将小鼠的口腔固定在小鼠固定装置上，并小心地将舌头置于外部，以防止窒息。检查麻醉深度后，在动物身体下方放置高度调节支撑物，确保身体和头部保持水平。使用带有纸张的加热垫以维持动物的体温。在双眼上涂抹药膏以防止干燥。然后使用碘和酒精对小鼠头部进行消毒。使用手术刀沿头部正中线做切口，切口从眼睛后方延伸至人字缝后方。暴露颅骨，并用浸有0.9%氯化钠溶液的无菌棉签擦拭。在体视显微镜下识别嗅前静脉（RRV），并用无菌铅笔标记。以无菌针头作为参考，确认脑部的方向。确保背腹（DV）和内侧-外侧（ML）坐标不变。接下来，将装有病毒溶液的无菌玻璃移液管移至RRV参考点，以确定前后方向的零点参考位置。沿矢状缝推进移液管，直至到达选定的前后坐标。用无菌铅笔标记该位置，然后提起针头。小心地在标记位置周围钻出一个小圆圈，以避免损伤上矢状窦，并用小镊子移除该片颅骨。接着以上矢状窦中线作为内外侧参考，将移液管移至相应位置，并缓慢下降直至接触硬脑膜，以此作为背腹向参考。在硬脑膜上制造轻微裂口，将移液管下降至选定的背腹侧位置。向脑内注射指定体积的腺相关病毒（adeno-associated virus）或 AAV 载体，随后撤出移液管。松开小鼠的耳杆固定装置。然后使用外科缝合夹闭合皮肤。将动物转移至单独的加温笼子中以恢复。密切观察小鼠的恢复情况。待其恢复意识后，将其放回原来的饲养笼中。首先，向小鼠脑内注射腺相关病毒载体。病毒注射后三至四周，剃除麻醉小鼠颈部腹侧和背部区域的毛发。使用碘伏溶液与70%乙醇溶液交替进行三次消毒，清洁剃毛区域。在肩胛骨之间的皮肤上做腹部切口。随后，将手术纱布覆盖在切口上，并将动物置于仰卧位，头部朝向手术者。然后在锁骨上方的右侧颈部做一个小的纵向切口，以暴露右颈总动脉和颈外静脉。分离皮下组织后，暴露右侧颈外静脉，并将缝线置于静脉下方。结扎颈外静脉的远端以阻断血流。使用显微镊子和剪刀，在塌陷的静脉上做一个小切口。然后将静脉导管斜面向下插入，并向近心端推进至上腔静脉，直至到达右心房。使用7-0丝线缝合线将导管固定于血管上。解剖结缔组织以暴露右侧颈总动脉。在颈内动脉与颈外动脉分叉处预先放置两根7-0丝线缝合环，保持未打结状态。为暂时阻断血流，牵拉预先放置的缝合环即可。然后使用显微剪刀或27号针头，在血管壁上制造一个小开口。在松开缝合线环的同时，将动脉导管向近端插入，并推进导管使其到达主动脉弓，注意避免接触主动脉瓣。使用先前放置的两根缝线将导管固定于血管上。将所有导管皮下穿行，经颈部背部的预切切口引出，然后闭合腹侧切口。将导管连接至由25号针头导管制成的硅胶涂层管路连接器的静脉或动脉接口。在闭合腹侧切口后，当背部皮肤缝合封闭时，将连接器固定于皮下。使用不锈钢外科导丝，用肝素化生理盐水填充导管，并紧密堵塞导管末端。术后24小时将动物连接至自动采血系统时，将悬吊钩连接到动物颈部背面的金属环上，并连接动脉导管。动脉导管与注射管路连接后，将静脉导管连接至采样管路。设定注射时间为每分钟500微升，剂量为每千克0.5毫克。设定采血时间、频率以及用生理盐水进行的样本稀释。系统将自动补充等量的生理盐水以替代采集的血液。执行自动化的注射前采血。接着，以每分钟500微升的注射速率自动静脉注射药物氯氮平-N-氧化物。然后进行注射后血液采样。展示了在弓状核接受单侧立体定位注射AAV-hM3Dq mCherry的成年kiss1-EYFP雌性小鼠中的黄体生成素分泌模式。动情间期的黄体生成素水平通常较低，但由于其脉冲式释放，通常可观察到波动。注射氯氮平N-氧化物后，黄体生成素水平出现急剧上升。大多数mCherry神经元与Kiss1-EYFP共定位，表明病毒和神经元激活特异性地针对目标细胞群。图中显示了动情间期野生型小鼠黄体生成素的脉冲式释放模式，以及其对腹腔注射kisspeptin-10的反应。观察到典型的动情间期雌性小鼠的黄体生成素脉冲，表现为基础黄体生成素水平较低。给予kisspeptin后，黄体生成素出现迅速且显著的升高。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

远程神经元激活与自动血液采样相结合，以诱导和测量小鼠体内循环黄体生成素

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially...

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

来源：Breid, S., 等. α-突触核蛋白纤维外周接种后转基因小鼠神经炎症的生物发光成像。J. Vis. Exp.

转基因小鼠神经炎症的生物发光成像

这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。...

体内 利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

本文介绍了一种在自由活动的小鼠中进行尾尖采血以频繁采集样本的实验方案。该方法可用于评估促黄体生成素脉冲式分泌的模式，也可根据需要调整用于分析其他循环因子。...

频繁采集小鼠尾尖血样以评估脉动性黄体生成素分泌

蓝斑是一个参与多种生理过程的小型神经元群。本文介绍了一种制备小鼠脑切片的方案，用于研究该核团中的蛋白质和金属元素。...

小鼠脑内蓝斑核的定位

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本文介绍了一种无需使用脑立体定位仪的徒手操作方法，用于在小鼠中快速、简便地进行脑室内注射。...

小鼠脑室内自由手注射

本文介绍了一种在体外培养中生长特定下丘脑细胞亚型的实验方案。这些细胞可根据适当且独特的膜表面标志物进行筛选，并可用于多种实验应用，包括免疫荧光、电生理学以及生物化学检测。...

分离特定下丘脑神经元用于激素、代谢和电生理调控研究

本方案描述了一种通过经皮穿刺途径将肿瘤细胞注入小鼠小脑延髓池以可靠诱导软脑膜转移的方法，该方法可减少创伤及颅外肿瘤负荷。...

用于小鼠软脑膜转移研究的微创大池注射模型

了解远程神经元激活与自动血液采样相结合的方法，用于诱导和测量小鼠体内循环黄体生成素。该技术通过AAV病毒载体精准操控神经元活动，实现无应激激素监测，为生殖神经内分泌研究提供可靠工具。

远程神经元激活结合自动化采血以诱导并测量小鼠循环黄体生成素

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