Name: 止泻药和植物提取物对黑腹果蝇效果的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解利用黑腹果蝇评估止泻药和植物提取物效果的实验方法。该研究通过粪便沉积分析快速筛选抗腹泻药物，为传统药用植物的科学验证提供高效、低成本的体内模型。

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我们感谢 Martina Gáliková 博士为我们提供了黑腹果蝇（Drosophila）品系。我们衷心感谢 Michelle Crozatier-Borde 和 Marc Haenlin 团队对本研究提出的宝贵意见，并帮助我们改进了模型。我们感谢 Napo Pharmaceuticals 公司提供了药物 Crofelemer。作者还感谢特约编辑 Hugues Petitjean 博士为我们提供了发表本实验方案的机会。本研究由法国国家研究署（Agence Nationale de la Recherche, ANR）项目 ANR-22-CE03-0001-01 资助。

1. 制备植物提取物
<ol>
	<li>从成年树上采集Psidium guajava L. 叶片30，并按如下步骤处理：将叶片在40 °C烘箱中干燥6天，随后室温风干6天，再于40 °C烘箱中继续干燥4天，最后通过研磨机或咖啡研磨机将干燥叶片研磨成粉。</li>
	<li>取100 g干燥粉末加入1 L 96%乙醇中，使用摇床持续搅拌浸提24小时。对植物残渣重复上述过程一次，合并滤液后在减压（175 mbar）、40 °C条件下使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸发至干。</li>
	<li>将植物提取物溶于乙醇，配制成所需浓度。通过测试一系列浓度（采用本方案所述方法）确定最佳浓度。
	<ol>
		<li>对于植物提取物，测试100 µg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、100 mg/mL的浓度范围，并选择对果蝇存活率无影响的浓度；对于纯化合物，测试0.05、0.5、5 和 50 mM12的浓度范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备食物培养基
<ol>
	<li>量取 100 mL 蒸馏水，倒入含有 4 g 糖和 0.8 g 琼脂的烧杯中（见材料表）。加热至 100 °C（同时搅拌），并维持 10 分钟。</li>
	<li>将温度降至 80 °C，边搅拌边加入 7.4 g 面粉和 2.8 g 酵母。继续加热至少 20 分钟，期间持续搅拌并控制温度在约 80 °C。</li>
	<li>加入霉克灵-丙酸溶液（1 mL 霉克灵与 0.3 g 丙酸充分混合）。待温度降至约 50 °C 后，加入植物提取物溶液（1 mg/mL）和 0.5 g 溴酚蓝粉末。 
	注：有关需测试的其他浓度的更多细节，请参见第 1.3.1 节。</li>
	<li>将培养基倒入培养皿中，至培养皿充满为止（图 1A）。让培养皿冷却至室温（约 3 小时），然后盖上皿盖，并于 4 °C 冰箱中保存。 
	&#8203;注：为避免水分蒸发，培养皿在冰箱中保存不应超过 2 周。</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65877/65877fig01.jpg" /> 
图 1：粪便沉积实验流程示意图。（A）含有足量培养基的培养皿图像。确保培养皿中有足够的食物，以避免出现空隙困住果蝇并阻碍其移动。但不要添加过多食物，以便表面能够均匀覆盖。（B）实验方案中所述刮刀的图像。（C）实验方案中所述粪便沉积测试的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/65877fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 准备果蝇
<ol>
	<li>制备 CO2 水箱，CO2 吹管配针头、果蝇操作板、画笔和显微镜。果蝇操作台提供CO₂2 既连接到果蝇操作垫，也连接到吹气装置。果蝇操作垫用于分选果蝇，而CO2 使用吹管对试管、瓶子和培养皿中的果蝇进行麻醉。</li>
	<li>通过选择含有蛹（至少10只）的培养瓶并采用以下方法清除成虫，以标准化果蝇的年龄。逐一将培养瓶倒置，将针头插入棉塞与瓶壁之间，用CO₂麻醉成虫2 用吹气管吹气直至所有果蝇在棉塞上昏迷（麻醉需数秒，停止吹气后麻醉效果可持续数秒）。打开小瓶，将其置于装有70%乙醇的玻璃瓶上方，将果蝇投入其中。用棉塞重新塞好小瓶，并将其置于培养箱中继续培养 25 &#176;C 湿度保持在60%。将培养箱的光照周期设置为12小时光照/12小时黑暗。</li>
	<li>孵育后（最长8小时），在显微镜下利用蝇垫将果蝇翻转至背侧朝下，观察其外生殖器，区分并分选出未交配的雌雄个体。
	<ol>
		<li>雌性外生殖器颜色较浅，而雄性外生殖器呈红褐色。雄性果蝇还可通过其前足第一对腿节上存在的深色刚毛（称为性梳）进行鉴别。将果蝇分别放入两个新的离心管中（雄性和雌性各一管），在25°C下培养6至8天 25 &#176;C. 
		&#8203;注意：在 25 &#176;C雌性果蝇羽化后大约保持处女状态8小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 粪便排泄试验
<ol>
	<li>用相应的菌株、性别和药物标记培养皿，以避免不同培养皿之间混淆。将培养皿叠放在一起。</li>
	<li>取出含有染色食物的培养皿，倒置在吸水纸上以吸收多余液体。使用刮铲（图1B）将食物切成12等份，然后用刮铲将其中一份放入一个空的培养皿中。 
	注意：根据重复实验的数量，每个培养皿中的切片数可增加至最多20片。每一片应大小相同。</li>
	<li>用 CO2 对果蝇进行麻醉，直至所有果蝇在棉塞上陷入睡眠状态。将六只健康的果蝇转移至每个培养皿中（图1C），立即盖上盖子，然后将其放入培养箱（25°C，60%湿度，12小时光照/12小时黑暗）。</li>
	<li>为确保果蝇在实验过程中不会从培养皿中逃逸，需用胶带将培养皿的上下盖固定在一起。每个测试组至少准备六个重复的培养皿。</li>
	<li>让果蝇培养24小时后，使用 CO2 将其麻醉，将果蝇转移至装有70%乙醇的容器中，并处理掉剩余的食物。</li>
	<li>保留培养皿，继续进行步骤5。</li>
</ol>
5. 培养皿的定量分析
<ol>
	<li>在计算机上创建一个文件夹，并根据实验菌株名称、果蝇性别以及所用药物类型对文件夹进行重命名。在该文件夹内，创建三个子文件夹，分别命名为 Original、Cut 和 Analysis。</li>
	<li>使用光学分辨率为每英寸6,400像素（ppi）的高分辨率扫描仪扫描培养皿。将每个培养皿的上盖和底座分别单独放置在扫描仪视野中央，进行顶部和底部的单独扫描。</li>
	<li>打开安装在计算机上的应用程序。计算机屏幕上将弹出一个欢迎窗口，其中包含所有常规设置（图2A). 
	注意：请勿修改高级设置。此步骤仅适用于使用与本文推荐型号相同的扫描仪的用户 材料表. 如果使用其他软件，请参考相关指南。
	<ol>
		<li>在应用中为培养皿命名，命名时需包含序列号、上盖或下盖、性别以及所用食物类型。选择步骤5.1中设置的子文件夹“original”。</li>
		<li>预览培养皿。单击 预览 在窗口底部等待几秒钟，让扫描仪进行预扫描，随后计算机屏幕上会出现一个窗口。移动屏幕上显示的方框，使其包围培养皿。</li>
		<li>点击 扫描 在计算机屏幕窗口的右下角，扫描结果将自动保存为图像，并存储至所选文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用应用程序（例如开源的 Fiji 软件）对图像进行裁剪，以确保不将伪影和食物残渣误认为沉积物。 
	注意：以下步骤仅适用于安装了 Fiji 软件的用户。若使用其他软件，请参考相应指南。
	<ol>
		<li>打开 Fiji 应用程序，等待数秒，直至屏幕出现工具栏。</li>
		<li>将待裁剪的图像拖动到工具栏上，然后选择第3个图标 多边形选择 在工具栏中，通过点击屏幕在饼图周围标记一个角度，裁剪掉照片中不需要的部分（彩色饼图）图2B-1,2). 
		注意：在界定图像中的裁剪区域时，所选择的帧必须首尾无缝连接。</li>
		<li>点击 编辑 位于条形图左上角，然后在 填充/清除外部 (图2B-3).</li>
		<li>要保存照片，请点击 文件 位于条形图左上角，然后点击 另存为，最后在 Tiff. 选择子文件夹 切割 步骤5.1中设定。 
		注意：保存裁剪后的图像时，确保不包含任何特殊字符（例如 !, &amp;#38;, $, #, _,-,&#8230;）或文件名中包含过多字符。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65877/65877fig02.jpg" /> 
图2：粪便沉积物测试数据分析过程中的关键步骤。（A）扫描应用程序设置信息的截图。（B）使用Fiji应用程序裁剪后的图像。确保不将伪影和食物残渣视为沉积物。（C）打开Excel_merge-v4应用程序时的界面截图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/65877fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 使用开源软件“终极粪便阅读器”识别粪便沉积物
注意：粪便软件最终用户的介绍和使用说明详见补充文件1。
<ol>
	<li>首先，打开 T.U.R.D. 软件（补充图1）。创建一个新实验，为文档命名，然后将其保存在第5.1步中设置的子文件夹“Analysis”中。</li>
	<li>点击 培养皿 然后在 加板. 选择要处理的培养皿。一个新窗口将显示所选平板的名称及新参数。设置区块大小、偏移量、最小尺寸和最大尺寸（补充图2).</li>
	<li>为确认检测到的粪便沉积物是否正确，单击 培养皿，然后 检查选定的平板，然后 图形，以及 查看带注释的图像 (补充图3）。放大并查看计数结果。如果仅有少数沉积物不应包含在分析中，请取消选择要排除的沉积物（补充图4).</li>
	<li>对于每一张需要处理的新图像，均需从步骤 6.3 重新开始。</li>
	<li>使用 T.U.R.D. 软件分析完培养板后，通过点击来修改果蝇数量 编号。果蝇 (补充图5).</li>
	<li>通过点击修改组名 培养皿 &#62; 编辑组 &#62; 添加，然后在 组 列，选择组名称。</li>
	<li>分别点击以导出不同重复组的数据 分析 &#62; 描述性统计 &#62; 选择组别 (补充图6）。将所有电子表格文件（.csv）保存在同一个文件夹中。</li>
	<li>为了将所有文件（在步骤 6.7 中获得）汇总到一个电子表格中，打开应用程序 Excel_merge-v4补充编码文件 1），等待出现以下句子：“选择文件夹路径（包含 .csv 文件）：”，然后粘贴上述文件夹地址。例如，路径可以是 C:\Experiment\Fecal deposit test\，然后单击 输入 键盘上两次图2C随后，在同一文件夹中创建一个新的电子表格文件。该电子表格文件在不同的工作表中包含所有导出的文件。</li>
	<li>在先前的电子表格文件中，添加另一个工作表以汇总所有重复样本各参数的均值（使用 VLOOKUP 函数处理数据）。示例见于 补充表 1.</li>
	<li>分析 p-值</li>
</ol>

Drosophila Fecal Deposit Analysis for Drug Discovery

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

D. melanogaster 由于基因上的相似性，已被广泛接受为研究多种生物过程的模型 D. melanogaster 和人类36. 的使用 D. melanogaster 作为研究肠道的模型被广泛采用，T.U.R.D. 已被用于估算粪便沉积的数量、面积和量。然而，表型检测方法尚未被用于评估果蝇的腹泻情况。因此，本方案介绍了一种通过检测粪便沉积来粗略评估腹泻发生的新方法。
粪便排泄物是评估肠道功能和健康状况的重要指标37。在此背景下，本文提出一种将黑腹果蝇（D. melanogaster）饲养于含药物培养基上的方法，用于研究粪便排泄物的多种参数。通过监测排泄物的数量，可确定排便频率，并评估药物是否对肠道转运产生影响。测量排泄物的总面积可用于评价粪便物质的浓度与稀释程度，这是判断肠道整体健康状况的重要因素。此外，总积分光密度（IOD）可用于检测排泄物中粪便物质的总量。本实验方案提供了一种高效筛选和评估影响肠道功能的药物及植物提取物的方法。当以黑腹果蝇（D. melanogaster）作为模式生物时，可评估潜在药物的有效性，从而加速药物发现进程。将该方法应用于植物提取物研究，有助于验证其作为止泻剂的用途。
在使用本方案研究黑腹果蝇（D. melanogaster）的粪便沉积物时，有几个关键步骤需要考虑。首先，必须准确计算药物在培养基中达到目标浓度所需的用量。此外，在将药物加入培养基时，应确保操作条件适宜，因为高温可能导致药物降解，从而影响其活性。其次，雌蝇的选择在本方案中至关重要。应使用处女雌蝇，以避免处女雌蝇与交配雌蝇在排泄物产量上的差异。例如，处女雌蝇产生的斑点比交配雌蝇更接近圆形，而交配雌蝇通常比处女雌蝇排泄更多的粪便物质27,28。因此，建议在羽化后8小时内收集果蝇，以确保所收集的雌蝇均为处女蝇。此外，用于实验的果蝇应健康强壮，因为其健康状况可能影响摄食量和排泄量。例如，翅膀形态异常的果蝇可能难以获取食物。最后，为了成功使用T.U.R.D.方法，方块大小（像素）和偏移量设置至关重要。由于图像的光照对比度存在差异，可能需要尝试不同的参数设置，以实现对粪便沉积物的最佳识别。
尽管所介绍的方法是有效的，但仍存在一些局限性。其一是培养基中药物浓度的准确性。由于培养基在制备过程中需要加热，部分水分可能蒸发，从而影响药物浓度。另一个局限性在于培养皿的扫描过程。培养皿的某些部分（例如边缘）无法被扫描到，这可能导致对总粪便沉积物的计算出现偏差。此外，果蝇在培养皿的上盖和下盖产生的粪便沉积量并不相同。由于果蝇倾向于在下盖产生更多的沉积物，上下盖之间分析结果的标准差可能较高，从而影响实验结果的准确性。
利用本实验方案，研究人员可以对黑腹果蝇（D. melanogaster）的腹泻现象进行研究。通过调整含药培养基，该方法可用于筛选具有止泻作用的植物，从而为药物发现提供一种新途径。传统药物和天然产物已被用于治疗包括胃肠道疾病在内的多种疾病达数个世纪之久。利用本方案评估植物提取物对粪便沉积的影响，可识别出治疗肠道疾病潜在的新疗法，并为这些提取物作为止泻剂的使用提供科学依据。该方法可为药物发现和民族药理学领域提供重要贡献。

胃肠道（GI）也称为消化道，负责营养物质的消化与吸收以及未消化产物的排泄1。胃肠道容易受到多种疾病的侵袭，可能导致不适、疼痛以及日常生活受到干扰。胃肠道疾病包括腹痛和不适、腹胀、烧心、消化不良或上腹不适、恶心、呕吐、腹泻和便秘2。腹泻是胃肠道疾病的最常见症状3，其定义为在24小时内至少出现三次稀便或水样便4。腹泻可由多种病原体引起，包括细菌、病毒、寄生虫、真菌，也可由药物引发5,6。在全球范围内，腹泻仍是5岁以下儿童死亡的第二大原因7。尽管腹泻可能自行缓解，但如果持续数天以上，则可能提示存在更严重的潜在疾病。
为了研究肠道，研究人员通常采用小鼠、大鼠和猪等动物模型8,9。然而，这些动物的使用可能成本高昂且耗时，因为它们需要专门的饲养设施并涉及伦理考量。近期研究表明，D. melanogaster 可作为研究胃肠道的模型，用于探究某些机制，例如再生稳态的维持、免疫衰老的发展、上皮屏障功能的丧失以及代谢稳态的下降10,11。D. melanogaster（即果蝇）与人类具有高度的基因同源性，据估计，约75%的人类疾病基因在果蝇中存在功能同源基因12。果蝇还具有结构简单的消化系统，由前肠、中肠和后肠组成13。D. melanogaster 易于在实验室中培养，并可通过多种方式进行遗传修饰14。因此，利用 D. melanogaster 进行 in vivo 检测是一种强有力的工具，使研究人员能够在受控环境中研究复杂的生物学过程。
根据世界卫生组织（WHO）的数据，大约80%的居住在发展中国家的人群使用传统医学来满足其基本健康需求15。药用植物的广泛使用可归因于其易于获取、价格低廉且副作用较少的特点16。草药治疗中主要使用的植物部位包括叶、树皮、根和种子17，而主要的制备方法为浸渍、煎煮和冷浸18。这些草药制剂含有多种植物化学物质，如生物碱、萜类化合物、黄酮类、甾体、单宁和碳水化合物19，这些成分对人体具有治疗作用。人们使用多种药用植物来治疗胃肠道疾病，例如腹泻、胃痛和痢疾20。例如，Psidium guajava 是全球最常用于治疗腹泻的植物之一。已有多种药理学和临床试验证实了其安全性，使其成为研究抗腹泻作用的良好候选药物21,22。然而，草药制剂的主要局限性在于缺乏对其有效性和安全性的系统评估，以及关于所用植物提取物成分的明确和完整信息不足23。为了验证草药制剂的有效性和安全性，需要采用一种系统性方法，结合实验和临床验证，并应有充足的体内（in vivo）和体外（in vitro）研究数据作为支持。
为了评估传统疗法在治疗腹泻方面的疗效，近几十年来主要采用小鼠和大鼠作为实验模型24,25。鉴于前文提到的主要优势，即操作简便、成本低廉、结果可重复，以及果蝇与哺乳动物之间在吸收和消化功能上的保守性，我们提出利用 D. melanogaster 作为模型来评估植物的抗腹泻活性。在 D. melanogaster 中，腹泻表型可通过多个特征进行表征，包括粪便沉积物数量增加、沉积物面积增大、颜色更浅（浓度更低）以及粪便物质总量升高26。该表型可通过多种参数进行量化：粪便沉积物数量、沉积物总面积、平均亮度以及总积分光密度（IOD）。总 IOD 定义为沉积物中的总染料含量，即排出的总粪便物质27。此前已有研究开发出用于分析 D. melanogaster 粪便沉积物的实验方法27,28。在此方法中，使用“粪便终极读取器”（T.U.R.D.）作为粪便分析工具，可检测粪便沉积物的数量、大小和亮度，从而监测果蝇的肠道生理状态。然而，该方法此前从未被用于评估果蝇中的腹泻表型。离子转运肽（ITP）基因是调控口渴与排泄的重要内分泌因子，在 D. melanogaster 中将水分稳态与摄食行为联系在一起。最近一项研究表明，ITP 的过表达会减缓食物在胃肠道中的通过速度并降低排便频率，而 ITP 的敲低则会加快食物通过速度并增加排便频率。后一种表型被该研究的作者描述为腹泻样表型29。
在本实验方案中，采用改良版的粪便排泄检测法，利用D. melanogaster的ITPi品系作为腹泻模型，评估止泻剂（即番石榴叶提取物）对果蝇胃肠道的作用。该方法的总体目标是：1）提供一种简便且可靠的评估药物和植物提取物止泻效果的方法；2）通过生物活性导向分离策略，鉴定植物提取物中产生止泻作用的活性化合物。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;化学 &amp;amp; 食品培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7002</td><td>5公斤桶</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34725-61-6</td><td>B5525-25G</td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>自然与公司</td><td>*910007</td><td>25公斤装袋</td></tr><tr><td>克罗非累默</td><td>Napo Pharmaceuticals</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>乙醇 96%</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>洛哌丁胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4762</td><td>5 克</td></tr><tr><td>Moldex</td><td>VWR</td><td>1.06757.5000</td><td>5公斤装袋子</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Dutscher</td><td>409553-CER</td><td>1 升瓶</td></tr><tr><td>糖</td><td>波莫纳流行风味</td><td>52705</td><td>1 千克装袋子</td></tr><tr><td>酵母</td><td>Dutscher</td><td>789195</td><td>10公斤装袋子</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>DWK生命科学</td><td>-</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td>Eppendorf管&amp;nbsp;&amp;nbsp;5.0 mL</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 储液罐</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>-</td><td>-</td><td>500 mL（用于提取）</td></tr><tr><td>滤纸型号</td><td>Whatman</td><td>-</td><td>3 mm chr.</td></tr><tr><td>Flowbuddy 底座</td><td>创生</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Flugs 窄口塑料瓶</td><td>创生</td><td>49-102</td><td>-</td></tr><tr><td>Flystuff 吹管</td><td>创生</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Flystuff Ultimate Flypad</td><td>创生</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Flystuff 脚踏开关</td><td>起源</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>-</td></tr><tr><td>量筒</td><td>-</td><td>-</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>不锈钢刮勺</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td>Eppendorf Reference&amp;nbsp;2</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>30000919</td><td>epT.I.P.S.&amp;nbsp;标准</td></tr><tr><td>窄型果蝇培养瓶</td><td>创生</td><td>32-120</td><td>-</td></tr><tr><td>画笔</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>格雷纳</td><td>628162</td><td>尺寸：60 × 15 mm</td></tr><tr><td>圆底烧瓶</td><td>-</td><td>-</td><td>500 mL（用于蒸发）</td></tr><tr><td>温度计</td><td>Avantor</td><td>620-0916</td><td></td></tr><tr><td>胡须</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷凝器</td><td>HUBER</td><td>小型冷却器</td><td>-</td></tr><tr><td>加热浴</td><td>B&amp;Uuml;CHI</td><td>B-490</td><td>-</td></tr><tr><td>加热板</td><td>BIOBLOCK SCIENTIFIC</td><td>-</td><td>磁力搅拌加热板</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td>-</td><td>HPP110eco</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>B&amp;Uuml;CHI</td><td>R-200</td><td>-</td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>爱普生</td><td>V850 pro</td><td>-</td></tr><tr><td>摇床</td><td>Edmund B&amp;uuml;hle</td><td>KS 10</td><td>-</td></tr><tr><td>体视显微镜双目镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td>-</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>VACUUBRAND</td><td>PC500 系列</td><td>-</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6776-1EA</td><td>康宁&amp;nbsp;LSE&amp;nbsp;涡旋混合器</td></tr><tr><td>体重秤</td><td>OHAUS Scout</td><td>SKX622</td><td>-</td></tr></tbody></table>

抗腹泻药物与植物提取物对黑腹果蝇（drosophila melanogaster）影响的评估

Assessment of The Effect of Antidiarrheal Drugs and Plant Extracts on Drosophila melanogaster

为了研究人类胃肠道生理学，生物医学科学家一直依赖模式生物。尽管许多研究人员已采用小鼠作为研究肠道功能的模型，但仅有少数报告关注 黑腹果蝇（D. melanogaster）与小鼠相比，果蝇具有多种优势，比如果蝇生命周期短、维护成本低且操作简便，并且不存在伦理问题。此外，哺乳动物的胃肠道生理学、解剖学及信号通路在果蝇中高度保守。 D. melanogaster植物提取物传统上被用于治疗腹泻和便秘。例如， 番石榴 (P. guajava）是热带地区最著名的止泻剂之一。然而，目前尚无研究评估止泻药、泻药及植物提取物在 D. melanogaster，目前尚不清楚类似效应（例如，止泻药导致哺乳动物粪便沉积更小、更集中且数量减少）是否也会在果蝇中出现。本研究探讨了由止泻药诱导的果蝇肠道运动减缓效应 P. guajava 在……中展示 D. melanogaster 表现出腹泻表型的品系。通过在食物中添加染料来监测果蝇排泄的粪便样本。本实验方案概述了含药物食物的制备方法、饲喂这些食物后果蝇粪便沉积的评估方法，以及所得数据的解读方法。

本研究显示，可通过粪便沉积物检测法来测量黑腹果蝇（D. melanogaster）的腹泻情况。通过分析多个参数，可明确区分不同表型（腹泻或非腹泻），这些参数包括粪便沉积物数量、沉积物总面积、沉积物平均面积、平均亮度以及总积分光密度（IOD）。IOD用于衡量沉积物中染料的总量，代表排泄的总粪便物质含量27。
在果蝇中敲低ITP基因可诱导腹泻表型，表现为排便频率增加，因此果蝇是研究腹泻的合适模型29。在本实验中，采用了ITPi品系（w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)），并在标准培养基中饲养。选择番石榴（Psidium guajava）叶片提取物作为抗腹泻干预手段，因为该植物在热带地区广泛用于腹泻管理。Crofelemer是一种抗腹泻药物，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于在接受抗逆转录病毒治疗的艾滋病成人患者中缓解非感染性腹泻的症状31。Crofelemer是从牛角藤（Croton lechleri Müll.Arg.）茎皮乳胶中提取的物质32。洛哌丁胺（Loperamide）是一种在全球范围内用于治疗腹泻的合成药物33。Crofelemer和洛哌丁胺均被用作潜在的阳性对照。
假设是：与饲喂普通食物的果蝇相比，饲喂P. guajava提取物、Crofelemer和洛哌丁胺（Loperamide）的果蝇腹泻表型会减轻。为验证该假设，通过比较饲喂普通食物的黑腹果蝇（D. melanogaster）与饲喂P. guajava提取物（1 g/100 mL）、Crofelemer（1 g/100 mL）或洛哌丁胺（10 mM）的果蝇在多个参数上的差异，测量了其粪便沉积情况。实验使用6至7日龄的处女雌蝇或雄蝇，每个培养皿中放置6只果蝇，共进行6次重复实验。果蝇培养24小时后，对每组进行分析。采用学生t检验比较实验组之间的显著性差异。结果显示，在处女雌蝇和雄蝇中，普通食物组的粪便沉积数量（图3A）、沉积物总面积（图3B）以及总IOD值（图3C）均显著高于饲喂P. guajava提取物（1 g/100 mL）的组别。遗憾的是，洛哌丁胺在两种性别中均未表现出作用（但已有研究证实其在D. melanogaster中具有解痉作用）34，而Crofelemer仅对雌蝇有效。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65877/65877fig03.jpg" /> 
图3: ITPi 应变分析。 的 ITPi 该品系在四种条件下进行分析：摄食正常食物、食物中添加1 g/100 mL P. guajava 提取物，1 g/100 mL 氯非勒姆，以及 10 mM 洛哌丁胺。&#160;数据以均值表示 &#177; 雌性和雄性在每种条件下的标准差（每个培养皿两侧共六个重复）。采用学生t检验进行统计分析。 t-用于比较两组的检验。 p-值显示如下：*： p &#60; 0.05; **: p &#60; 0.01; ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001. (A) 粪便排泄物的数量 ITPi 菌株在添加了 1 g/100 mL Crofelemer、10 mM 洛哌丁胺或 1 g/100 mL 的食物喂养的果蝇中进行了比较 P. guajava 提取并分析以正常食物喂养的果蝇。此外，还分析了未交配雌性和雄性果蝇在粪便沉积物数量上的差异。在两组中，以正常食物喂养的果蝇粪便沉积物数量均显著高于以1 g/100 mL食物喂养的果蝇。 P. guajava 提取。B) 粪便沉积物的总面积 ITPi 在正常食物喂养的果蝇与添加了1 g/100 mL的补充食物喂养的果蝇中进行了品系比较 P. guajava 提取物，1 g/100 mL 克罗飞雷默（Crofelemer），以及 10 mM 洛哌丁胺。在雄性和雌性果蝇中，饲喂正常食物的果蝇粪便沉积总面积显著高于饲喂含 1 g/100 mL 克罗飞雷默食物的果蝇 P. guajava 提取。C总IOD的差异 ITPi 在正常食物饲养的果蝇与添加了1 g/100 mL的补充食物饲养的果蝇之间分析了品系差异 P. guajava 提取物，1 g/100 mL 克罗飞来默，以及 10 mM 洛哌丁胺。在雄性和雌性果蝇中，摄取正常食物的个体总碘摄入量（IOD）显著高于摄取含 1 g/100 mL 克罗飞来默食物的个体 P. guajava 提取物。缩写：F = 女性；M = 男性；Crofe = 克罗飞勒默；Lope = 洛哌丁胺；Nor food = 正常饮食；P. gua ext = 番石榴 提取。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/65877fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
为了证明所观察到的排泄减少现象 P. guajava 提取组的效果归因于提取物的抑制作用，而非摄食量减少，因此我们采用了固体食物摄入的直接估算法与追踪法（DIETS）35结果显示，除雄性果蝇中洛哌丁胺组的食物消耗量低于正常水平外，其他给药组与未给药组之间的食物消耗量无显著差异。图4).
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65877/65877fig04.jpg" /> 
图4：摄食实验。 摄食实验用于测量果蝇对固体食物的摄取量。果蝇被饲喂四种不同的培养基：1 g/100 mL P. guajava 提取物、1 g/100 mL Crofelemer、10 mM 洛哌丁胺以及正常食物。每组包含20只果蝇，共设五个重复。数据以雌性和雄性果蝇在各条件下的平均值±标准差表示。采用学生t检验对两组间进行统计学分析。p值表示如下：*：p &#60; 0.05；**：p &#60; 0.01；***：p &#60; 0.001；****：p &#60; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/65877fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
P. guajava 提取物的粪便沉积物和摄食实验结果表明，该提取物是一种用于治疗果蝇腹泻的可靠药用植物。
补充图1：T.U.R.D. 开启窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：需调整设置的T.UR.D.窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：带有注释图像的T.U.R.D.窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 3.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：T.U.R.D.窗口显示已处理图像中检测到的每个斑点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 4.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图5：T.U.R.D.窗口展示每张已处理的图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 5.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图6：T.U.R.D. 窗口，显示导出各组数据的过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Figure 6.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：T.U.R.D. 软件使用快速指南。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary File 1_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表1：可用于分析的最终电子表格示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplementary Table 1_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 1：用于合并电子表格的应用程序。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65877/Supplemental Coding File.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种将药物和植物提取物喂饲黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），并通过分析果蝇粪便沉积物来评估其对胃肠道影响的方法。经药物处理的果蝇可作为进一步研究的模型。

抗腹泻药物与植物提取物对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）影响的评估

为了研究人类胃肠道生理学，生物医学科学家一直依赖模式生物。尽管许多研究人员已将小鼠用作……

我们的研究重点是传统药物（包括药用植物）的科学验证。我们致力于更深入地理解这些药物的药理作用，特别是其抗腹泻和抗菌效果。为了测试药用植物的抗腹泻作用，通常采用小鼠模型，但该过程耗时较长、成本较高，且需要大量待测植物材料。利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为模型，我们有助于通过减少实验类型以及所用植物材料的数量来改进新型抗腹泻药物的发现过程。同时，我们也有助于通过使用一种简单而有效的模型，为传统医学中抗腹泻植物的应用提供科学依据。我们的研究结果将帮助科研人员对植物提取物进行生物活性导向的分离纯化，从而发现负责抗腹泻活性的化合物。首先，将100毫升蒸馏水倒入含有4克糖和0.8克琼脂的烧杯中。在持续搅拌的同时，将混合物加热至100摄氏度。然后将混合物从热源移开，使其冷却。将温度调低以维持在80摄氏度。然后在搅拌的同时向混合物中加入7.4克面粉，随后加入2.8克酵母。接下来，将Moldex丙酸溶液加入该混合物中。然后将温度冷却至 50 摄氏度。加入番石榴（psidium guajava）植物提取液，随后加入 0.5 克溴酚蓝粉末。将制备好的食物混合物倒入培养皿中，直至每个培养皿装满。待培养皿冷却至室温后，用盖子密封，并在4°C的冰箱中保存。为准备测试样品，首先准备好二氧化碳钢瓶、带针头的二氧化碳吹枪、果蝇操作板、颜料、毛笔和显微镜以处理果蝇。选择含有至少10只黑腹果蝇（Drosophila）蛹的试管，以标准化果蝇的年龄。为了移除成虫，将小瓶倒置，并在棉塞与瓶壁之间插入一根针。使用二氧化碳吹枪麻醉成虫，直至它们在棉塞上失去意识。将小瓶口朝下对准一个装有70%乙醇的玻璃瓶，将果蝇投入其中。用棉塞密封小瓶。然后在25°C、60%湿度、12小时光照与12小时黑暗交替的光周期条件下培养。接下来，在培养开始后的8小时内，在显微镜辅助下将果蝇按未交配的雌性和雄性分开，以防止交配。雌性外生殖器可通过其浅色来识别，而雄性外生殖器则呈微红色。此外，雄性还可通过前足上的性梳来辨认。将分选好的果蝇按性别分别放入两个新的离心管中，每管一种性别，并在25°C下培养6至8天。首先将标记好的培养皿叠放在一起。将含有染色食物的培养皿倒置，使食物接触吸水纸，以吸收多余的液体。然后使用刮铲将每个培养皿中的食物均分为12等份。将一片食物转移至一个空的培养皿中。接着，使用二氧化碳麻醉果蝇，直至它们在棉塞上陷入睡眠状态。小心地将六只健康的果蝇转移至每个培养皿中。将密封的培养皿放入培养箱中。为防止果蝇在实验过程中逃逸，需用胶带将每个培养皿的上下盖固定。经过24小时的培养期后，再次使用二氧化碳麻醉果蝇。然后将果蝇转移至装有70%乙醇的容器中以进行处理。同时，丢弃培养皿中任何剩余的食物。为便于对培养皿进行定量分析，请启动Epson Scan 2软件，指定文件名并执行预览扫描。分别扫描每个培养皿的上盖和下底。使用开源图像编辑软件仔细裁剪扫描图像，以去除所有伪影和食物残渣。然后将裁剪后的图像保存为TIFF文件。接下来，启动 T.U.R.D 软件。单击“文件”以创建一个新的实验文档，为其命名，并将其保存在“分析”子文件夹中。单击“平板”选项，然后选择“添加平板”以选定用于分析的培养皿。将出现一个新窗口，显示所选平板的名称以及新的参数设置。将区块大小设置为21，偏移量设置为5，最小尺寸设置为20，最大尺寸设置为600。为确认粪便沉积检测的准确性，请导航至平板，然后点击检查所选平板，接着选择图形并查看带注释的图像。放大图像以查看沉积物计数。如有必要，取消选择不应纳入分析的沉积物。使用 T.U.R.D 软件完成分析后，通过点击果蝇数量来调整果蝇数目。通过点击“Plates”，然后选择“Edit Groups”，再点击“Add”来更改组名称。在组列中选择相应的组名称。接下来，点击“Analyze”，然后选择“Descriptive Statistics”和“Select Group”，以分别导出每个重复样本的数据。将所有生成的电子表格文件保存在同一个指定文件夹中。为了将所有数据汇编到单个电子表格中，请打开应用程序 Excel merge-v4。当提示“选择包含 CSV 文件的文件夹路径”时，输入文件夹地址，然后按两次回车键，即可在相同文件夹中创建一个新的电子表格。在包含合并数据的电子表格中添加一个新工作表，用于计算每个参数在所有重复样本中的平均值。使用 VLOOKUP 函数汇总每个参数在所有重复样本中的平均值。启动 GraphPad Prism 软件并输入数据集名称。将数据从 Excel 表格转移至 Prism 数据图表。点击“分析”以选择用于分析的数据集，然后按“确定”。选择适当的检验参数，分析 P 值。在未交配的雄性和雌性小鼠中，正常饲料组的粪便沉积数量、沉积物总面积以及积分光密度（IOD）均显著高于番石榴提取物组。对固体食物消耗的监测显示，给药组与未给药组在食物消耗量方面无显著差异。然而，摄取洛哌丁胺的雄性果蝇似乎比正常情况下摄入的食物更少。

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