Name: 循环死亡 （DCD） 肝脏循环死亡 （DCD） 后通过灌注和原位肝移植保存猪捐献 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学习使用可控温机器灌注技术保存猪DCD肝脏并进行原位肝移植的方法。该方案通过持续灌注氧气和营养液，有效减少缺血损伤，提高供肝保存质量与移植成功率，为移植生物学研究提供稳定模型。

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本研究由重点科学研究计划资助，用于支持发展 离体 中国佛山肝脏灌注系统[(2020)A007]；广东省基础与应用基础研究基金（2020B1515120031）；广州市科学研究基金（202002030201）

所有动物实验均按照《中华人民共和国科学技术部实验动物管理条例（2017年）》进行。实验使用中国台湾巴马雌性小型猪（40-45 kg）。研究方案经中国人民解放军南部战区总医院机构动物护理与使用委员会批准。猪只在移植前于实验设施中饲养1周，实验前12小时禁食但可自由饮水。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 供体获取
<ol>
	<li>麻醉与镇痛诱导：肌肉注射阿托品，剂量为0.02 mg/kg。随后肌肉注射 Zoletil 50，剂量范围为2–3.5 mg/kg，以诱导镇静。镇痛采用盐酸曲马多静脉注射，剂量为2 mg/kg。</li>
	<li>通过外侧耳缘静脉插入24 G蝶形针，以2-3 mg/kg/h的速率静脉输注丙泊酚诱导全身麻醉。</li>
	<li>将猪仰卧位固定于手术台上。进行气管插管并实施机械通气。持续监测心率和血氧饱和度 通过 将脉搏血氧仪置于尾部，将异氟烷蒸发器的浓度设定为2%。</li>
	<li>在该区域皮肤上涂抹3%碘溶液进行消毒。待碘溶液自然晾干后，用70%酒精擦拭去除。重复消毒过程三次。</li>
	<li>行正中开腹切口，并向右侧延伸。松解肝脏的韧带附着，游离胆管，在靠近十二指肠处结扎后切断。</li>
	<li>仔细分离肝动脉（HA）和门静脉（PV）周围的组织。游离腹腔干并追踪至腹主动脉。</li>
	<li>解剖腹主动脉（AA）和下腔静脉（IVC）以方便采血。静脉注射肝素钠（25,000 U）作为抗凝处理。</li>
	<li>依次插管腹主动脉和下腔静脉，将血液收集至含酸性枸橼酸葡萄糖的采血袋中，用于后续常温机械灌注（NMP）（约1800–2000 mL）。&#160;使用特定导管为肺静脉（PV）插管。将采集的血液储存在 4 °C 温度下。</li>
	<li>通过心内注射氯化钾（20 mEq）诱导心脏停搏。 
	注意：从心脏骤停开始的时间间隔记录为热缺血时间（Warm Ischemia Time, WIT）。肝脏在无任何干预的情况下经历30分钟的热缺血时间，随后进行 原位 通过腹主动脉（AA）和门静脉（PV）灌注2 L冷的高渗枸橼酸腺嘌呤溶液。</li>
	<li>切除肝脏，确保所有残留血管长度足够。保留一段腹主动脉组织用于动脉插管。为门静脉（PV）安装特定导管。</li>
	<li>将肝脏置于冰上的无菌器官袋中。结扎肝脏所有远端动脉分支，并插管胆总管。</li>
</ol>
2. 采用 DHOPE 模式启动
<ol>
	<li>将门静脉和腹主动脉的导管连接至机械灌注（MP）装置。使用 1.5 L 威斯康星大学机械灌注液（UW-MPS，参见材料表）对肝脏进行灌注，该灌注液需添加肝素钠（6250 U）和头孢西丁钠（1 g）。</li>
	<li>设定灌注参数：肝动脉（HA）采用压力控制模式，维持压力为 25 mmHg；门静脉（PV）采用流量控制模式，维持流速为 200 mL/min。通过以 1 L/min 的速率持续向灌注液中通入 100% 氧气，确保灌注液的氧饱和度。 
	注意：系统在灌注过程中会自主监测并记录灌注液温度、肝动脉与门静脉压力及流量等关键参数。</li>
	<li>将灌注模式设定为 4°C 温度条件下，对肝脏移植物进行 8 小时的灌注（图 1）。</li>
</ol>
3. 采用 NMP 模式灌注
<ol>
	<li>将机械灌注装置切换至常温机械灌注（NMP）模式。将系统温度升至 37 °C。使用 2 L 全血与机械灌注液的混合液对机器进行预充。</li>
	<li>用 1.5 L 的 4 °C 生理盐水冲洗供体，并将其置于盛有冰的容器中。更换灌注液，并将同一设备预充并设置为 NMP 模式。待肝脏完成 10 分钟的复温阶段后，将其转移至设备中图1).</li>
	<li>在放置肝脏之前，预先为门静脉和肝动脉建立持续的氧气流。维持吸入氧浓度（FiO2）为60%。</li>
	<li>将动脉灌注压设定为80/60 mmHg（收缩压/舒张压）。门静脉灌注初始设为恒定流量0.5 mL/min/g（肝重），一小时后逐步增加至0.75 mL/min/g（肝重）。</li>
	<li>在整个6小时的NMP过程中，持续监测压力、流速和温度等参数。进行器官活力检测 通过 每间隔1小时对灌流液进行一次生化评估，包括血气分析、乳酸、血糖和肝功能。</li>
</ol>
4. 受体肝切除术
<ol>
	<li>向受体猪肌肉注射 Zoletil 50（2–3.5 mg/kg）和阿托品（0.02 mg/kg）。静脉给予盐酸曲马多（2 mg/kg）以进行疼痛管理。</li>
	<li>通过静脉输注丙泊酚（2–3 mg/kg/h）诱导全身麻醉。via 将猪仰卧位固定于配备加热垫的手术台上。异氟烷蒸发器设定为 2%。</li>
	<li>行正中腹切口，并向右侧延伸。用无菌纱布覆盖大肠和小肠。放置腹部牵开器以获得充分视野。</li>
	<li>游离肝脏的韧带附着结构。分离胆管，结扎并切断。逆行解剖肝动脉至胃十二指肠动脉分叉处。使用动脉夹在胃十二指肠动脉近端夹闭肝总动脉。游离门静脉（PV）周围粘连组织，并在其远端夹闭。</li>
	<li>夹闭腔静脉上段，随后解剖膈肌侧的上段腔静脉，保留部分肝内腔静脉组织以供后续缝合。以类似方式处理下腔静脉，保留部分肝脏组织于腔静脉上。切除肝脏。</li>
	<li>通过静脉注射 500 mg 甲基泼尼松龙进行免疫抑制。</li>
</ol>
5. 原位移植物放置与血管吻合
<ol>
	<li>将供体肝脏从机械灌注装置中取出。在门静脉（PV）上安装专用导管，随后经门静脉导管灌注4 °C的冷生理盐水。再经门静脉导管灌注含5%白蛋白的4 °C冷生理盐水。此过程对于清除肝脏内血液并降低肝脏温度至关重要。</li>
	<li>将专用导管插入门静脉，并在切除受体原有肝脏前通过结扎固定，以便与供体门静脉上的匹配导管连接。同时，夹闭供体移植物的下腔静脉（图2B）。</li>
	<li>使用双头4-0单丝聚丙烯缝线行肝上腔静脉端对端吻合。</li>
	<li>通过匹配的套管连接门静脉两端以恢复血流。插入前需用肝素化生理盐水冲洗套管。间歇性开放门静脉并暂时松开下腔静脉夹，有助于冲洗残留的灌注液。</li>
	<li>松开肝上腔静脉的血管夹，使用4-0单丝聚丙烯缝线行下腔静脉端对端吻合。</li>
	<li>用10 mL肝素化生理盐水冲洗供体肝动脉，并在远端加用血管夹以防止反向出血。使用7-0单丝聚丙烯缝线行端对端吻合。</li>
	<li>在供体和受体胆道两端均插入导管，并将导管牢固缝合固定，以确保位置稳定。</li>
	<li>移除门静脉导管，使用4-0单丝聚丙烯缝线行门静脉端对端吻合。</li>
</ol>
6. 移植后的护理与监测
<ol>
	<li>继续维持受体猪的通气状态2小时。</li>
	<li>开启重症监护室的空调以提高室内温度，并使用加热垫维持猪的体温。</li>
	<li>定期采集血样，每24小时检测一次血气以及肝肾功能。</li>
	<li>用肝素盐水封管留置针。需妥善管理猪耳缘静脉的留置针，防止因猪活动导致脱落。</li>
	<li>当猪能够完全自主呼吸时，停止机械通气。</li>
	<li>将受体猪送回猪舍，置于约10 cm高的木床上直至从麻醉中苏醒。木床底部垫有毛巾，防止尿液在动物体周积聚，并通过猪舍内24小时运行的加热器维持温度。</li>
	<li>从术后第1天（POD 1）开始，以甲泼尼龙250 mg作为初始剂量进行免疫抑制治疗，随后逐渐减少剂量。</li>
	<li>术后第1天（POD 1）静脉给予镇痛药物（布托啡诺 0.01–0.05 mg/kg）；术后第2至第5天（POD2–POD5）每12小时肌内注射曲马多（100 mg/kg）。从术后第2天起，每日两次口服头孢菌素（2 mg/kg），并补充营养液。饮水不限。</li>
	<li>术后约5天移除静脉通路。</li>
	<li>观察尿量及尿液颜色，注意术后粪便颜色的变化。</li>
	<li>若猪出现持续性酸中毒、低血糖、出血征象或肝功能衰竭，应实施安乐死。</li>
	<li>在肝移植术后第5天，在深度异氟烷麻醉（5%，&#62;2.5 MAC）下通过放血实施安乐死。</li>
</ol>
7. 脊髓刺激控制猪模型的技术
<ol>
	<li>采用与上述相同的麻醉步骤。解剖腹主动脉（AA）和下腔静脉（IVC）以促进血液引流，并使用相同的肝素化方法。依次插管AA和IVC，通过心内注射氯化钾（20 mEq）迅速诱导心脏停搏。</li>
	<li>在热缺血时间（WIT）达30分钟后迅速获取供体肝脏，保留足够长度的近端肝下腔静脉组织。</li>
	<li>将肝脏移植物置于保存袋中，并浸入4 °C的威斯康星大学（UW）溶液中保存8小时。</li>
	<li>将肝脏在37 °C下进行常温机械灌注（NMP）保存6小时，同时另一组直接进行原位肝移植（OLTx）（图1）。</li>
</ol>

Orthotopic Pig Liver Transplant Preservation Using Machine Perfusion

<ol><li>de Goeij, F., Schlegel, A., Muiesan, P., Guarrera, J. V., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+oxygenated+machine+perfusion+protects+from+cholangiopathy+in+donation+after+circulatory+death+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hypothermic oxygenated machine perfusion protects from cholangiopathy in donation after circulatory death liver transplantation.</a> Hepatology. 74 (6), 3525-3528 (2021).</li>
<li>Dutkowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+trends+in+machine+perfusion+for+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Evolving trends in machine perfusion for liver transplantation.</a> Gastroenterology. 156 (6), 1542-1547 (2019).</li>
<li>Parente, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+techniques+for+liver+transplantation%3A+A+meta-analysis+of+the+first+seven+randomized-controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion techniques for liver transplantation: A meta-analysis of the first seven randomized-controlled trials.</a> J Hepatol. 79 (5), 1201-1213 (2023).</li>
<li>Schlegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+DCD+liver+transplantation+using+organs+treated+by+hypothermic+oxygenated+perfusion+before+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Outcomes of DCD liver transplantation using organs treated by hypothermic oxygenated perfusion before implantation.</a> J Hepatol. 70 (1), 50-57 (2019).</li>
<li>Zhang, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+machine+perfusion+protects+against+liver+ischemia-reperfusion+injury+during+reduced-size+liver+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transplant%22%5BJournal%5D)">Normothermic machine perfusion protects against liver ischemia-reperfusion injury during reduced-size liver transplantation in pigs.</a> Ann Transplant. 24, 9-17 (2019).</li>
<li>Minor, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+reconditioning+by+gaseous+oxygen+improves+survival+after+liver+transplantation+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic reconditioning by gaseous oxygen improves survival after liver transplantation in the pig.</a> Am J Transplant. 11 (12), 2627-2634 (2011).</li>
<li>Linares-Cervantes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictor+parameters+of+liver+viability+during+porcine+normothermic+ex+situ+liver+perfusion+in+a+model+of+liver+transplantation+with+marginal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Predictor parameters of liver viability during porcine normothermic ex situ liver perfusion in a model of liver transplantation with marginal grafts.</a> Am J Transplant. 19 (11), 2991-3005 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+partial+liver+transplantation+without+veno-venous+bypass%3A+an+effective+model+for+small-for-size+liver+graft+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Porcine partial liver transplantation without veno-venous bypass: an effective model for small-for-size liver graft injury.</a> Transplant Proc. 43 (5), 1953-1961 (2011).</li>
<li>Brockmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+reperfusion+influences+ischemia%2Freperfusion+injury+and+primary+graft+function+following+porcine+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Sequence of reperfusion influences ischemia/reperfusion injury and primary graft function following porcine liver transplantation.</a> Liver Transpl. 11 (10), 1214-1222 (2005).</li>
<li>Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+porcine+liver+procurement+and+orthotopic+transplantation+using+an+active+porto-caval+shunt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technique of porcine liver procurement and orthotopic transplantation using an active porto-caval shunt.</a> J Vis Exp. (99), e52055(2015).</li>
<li>Ceresa, C., Nasralla, D., Pollok, J. M., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+of+the+liver%3A+applications+in+transplantation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion of the liver: applications in transplantation and beyond.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 199-209 (2022).</li>
<li>Martins, P. N., Buchwald, J. E., Mergental, H., Vargas, L., Quintini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+normothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Surg%22%5BJournal%5D)">The role of normothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Int J Surg. 82, 52-60 (2020).</li>
<li>Brüggenwirth, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+dual+hypothermic+oxygenated+machine+preservation+%28DHOPE-PRO%29+in+liver+transplantation%3A+Study+protocol+for+a+stage+2%2C+prospective%2C+dual-arm%2C+safety+and+feasibility+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Prolonged dual hypothermic oxygenated machine preservation (DHOPE-PRO) in liver transplantation: Study protocol for a stage 2, prospective, dual-arm, safety and feasibility clinical trial.</a> BMJ Open Gastroenterol. 9 (1), 000842(2022).</li>
<li>Mergental, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+discarded+livers+following+viability+testing+with+normothermic+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplantation of discarded livers following viability testing with normothermic machine perfusion.</a> Nat Commun. 11 (1), 2939(2020).</li>
<li>Nasralla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+trial+of+normothermic+preservation+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation.</a> Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).</li>
<li>Melandro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+criteria+during+liver+ex-situ+normothermic+and+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Viability criteria during liver ex-situ normothermic and hypothermic perfusion.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1434(2022).</li>
<li>Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Bojko, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+current+and+emerging+trends+in+donor+graft-quality+assessment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Review of current and emerging trends in donor graft-quality assessment techniques.</a> J Clin Med. 11 (3), 487(2022).</li>
<li>OuYang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ex+vivo+liver+viability+using+a+nuclear+magnetic+resonance+relaxation+time-based+assay+in+a+porcine+machine+perfusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ex vivo liver viability using a nuclear magnetic resonance relaxation time-based assay in a porcine machine perfusion model.</a> Sci Rep. 11 (1), 4117(2021).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li>
<li>van Leeuwen, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+high-risk+donor+livers+after+ex+situ+resuscitation+and+assessment+using+combined+hypo-+and+normothermic+machine+perfusion%3A+A+prospective+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Transplantation of high-risk donor livers after ex situ resuscitation and assessment using combined hypo- and normothermic machine perfusion: A prospective clinical trial.</a> Ann Surg. 270 (5), 906-914 (2019).</li>
<li>van Leeuwen, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+hypothermic+and+normothermic+machine+perfusion+enables+safe+transplantation+of+high-risk+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Sequential hypothermic and normothermic machine perfusion enables safe transplantation of high-risk donor livers.</a> Am J Transplant. 22 (6), 1658-1670 (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肝脏MP目前在临床试验中被广泛使用，但仍需利用大型动物模型开展进一步的临床前研究5,6。猪同种异体肝移植（OLTx）面临诸多挑战，导致成功率较低。这些挑战包括供体的热缺血、解剖结构变异，以及对下腔静脉和门静脉长时间阻断的耐受性差7,8。对于来自心脏死亡捐献（DCD）供体的猪OLTx，移植阶段仍然是一个重大障碍，常因肠道充血、静脉回流不足及再灌注相关损伤而引发心律失常、休克、代谢紊乱和高钾血症等并发症9。已有多种技术被用于缓解无肝期下腔静脉血流淤滞。被动门静脉和颈静脉转流已被证明可在该阶段维持猪的血流动力学稳定10。该转流模型通过主动减压下腔静脉和门静脉，有助于更顺利地完成肝上腔静脉与门静脉的吻合。
本研究采用门静脉插管技术，直接连接受体的门静脉，从而缩短无肝期，维持血流动力学稳定。该方案描述了一种结合低温氧合血液灌注（DHOPE）与常温机械灌注（NMP）以保存心脏死亡捐献（DCD）供体肝脏的新型方法，随后进行猪异体肝移植（OLTx）。DHOPE具有更高的稳定性，且不依赖稀缺的血液资源，因此在供体肝脏的长期保存与运输方面具有广阔应用前景。目前，该方法实现的最长保存时间 离体 在苏黎世大学观察到通过NMP实现的肝脏保存时间为7天11该装置基于生物技术原理，整合了额外的透析和定期血液制品交换功能，导致成本显著增加。
WIT为30分钟的DCD肝脏在SCS保存8小时后进行NMP时表现出严重的移植物功能障碍（补充图2）。该观察结果与后续OLTx实验中肝功能指标的变化趋势一致。在SCS组中，总胆红素升高表明OLTx术后早期即出现移植物功能障碍；而在DHOPE-NMP组中，OLTx术后第4天总胆红素的升高得到显著缓解。这表明序贯式DHOPE-NMP在再灌注后维持全身血流动力学稳定方面发挥关键作用，有助于OLTx后的长期存活。
DHOPE 已被证实可提高 DCD 供体肝脏的保存质量4临床研究一致表明，DHOPE 能有效维持肝细胞中的 ATP 水平，并在低温保存期间减少线粒体氧债，从而在再灌注时减轻缺血-再灌注损伤（IRI）。长期随访研究报道，在采用 DHOPE 保存的供体肝脏移植中，胆道相关并发症的发生率有所降低。4NMP 在严格条件下运行，需在体温下使用含氧血液和营养物质5,12,13,14需要注意的是，尽管离体灌注（NMP）具有功能评估和缩短冷缺血时间等优势，但其操作复杂性、成本较高，以及需要经过NMP专项培训的专业人员，可能带来一定的实施挑战。15NMP 为评估提供了一个可靠的平台 离体 肝脏存活能力；传统的生化功能指标通常难以准确反映肝脏存活能力16,17相比之下，胆汁pH值、乳酸和血糖等较少使用的指标在反映肝脏活力方面显示出更大的潜力。目前尚无一种既定指标能够准确评估 离体 肝功能。在之前的一项研究中，采用钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA）作为磁共振成像（MRI）对比剂，用于实时监测肝脏储备功能。与单纯冷保存（SCS）的肝脏相比，DHOPE保存的肝脏在再灌注后表现出更快的MRI对比剂胆汁排泄速度。18.
由于胆道吻合术在肝移植中并发症发生率较高，被认为是具有挑战性的操作1,19。胆道组织脆弱，增加了炎症性狭窄和术后胆道梗阻的风险20。其中一头猪因胆汁渗漏死亡，可能由胆管张力过高所致。对于胆道吻合，我们采用端对端胆道支架法，主要因其具有节省时间的优势。支架的存在能有效预防术后早期胆道梗阻。此外，SCS组猪的术后进食量普遍偏低，可能与门静脉压力升高导致的胃黏膜损伤有关。因此需要进行抑酸及胃黏膜保护治疗。
其他研究强调了在心脏死亡后捐献（DCD）肝脏中，序贯采用低温机械灌注（MP）后接常温机械灌注（NMP）的策略，可减轻热缺血带来的不利影响。一项重要研究评估了联合使用NMP与DHOPE技术对高风险供体肝脏进行复苏并评估其移植可行性的效果，这些肝脏最初被认为不适合移植。该研究特别比较了灌注过程中使用的两种携氧载体：一种是基于人工血红蛋白的携氧载体（HBOC）和红细胞（RBC）21。值得注意的是，移植后一年的移植物存活率和患者存活率分别达到94%和100%。仅有一位患者（3%）出现移植后胆道病变21。
该方案介绍了一种通过序贯DHOPE-NMP模式保存猪DCD肝脏，随后进行OLTx手术的详细操作流程。该方法有望延长肝脏保存时间 离体 用于DCD移植物的肝脏灌注及OLTx稳定模型的建立。合作研究与全面的临床试验将在优化方案中发挥关键作用，最终使等待肝移植的患者受益。

肝移植仍是治疗终末期肝病和部分肝癌的唯一根治性手段。尽管在器官获取、保存、手术技术以及移植后免疫抑制治疗方面已取得显著进展，但由于合适供体器官的短缺，等待移植患者中的死亡率仍然较高。其中一项主要挑战在于如何保存来自心脏死亡后捐献（DCD）的肝脏，因为这些器官需要特殊处理以减轻缺血性损伤1。离体肝脏机械灌注为在移植前保存和评估DCD供肝提供了一种独特的方法2。临床试验已证实，无论是标准标准还是扩展标准的供体，在低温或常温条件下进行离体肝脏机械灌注均具有可行性和安全性3。尤为重要的是，在离体肝脏机械灌注过程中实施治疗干预，已显示出减轻缺血-再灌注损伤（IRI）的潜力4。
为了延长DCD肝脏移植物的保存时间并提高其质量，正在进行的动物实验旨在优化常温机械灌注（MP）设备的性能，并改进灌注方法。 离体 肝脏保存5猪同种异体肝移植（OLTx）是面向临床研究的理想模型，可用于验证机械灌注（MP）的器官保存质量。然而，供体的缺血性损伤、血流动力学不稳定以及猪 OLTx 无肝期的肠道淤血等因素共同影响着该猪模型的存活率6,7.
一种可变温控制的多功能灌注装置，集成了常温机械灌注（NMP）和低温氧合灌注（DHOPE）两种模式，用于在以下方案中保存猪的供体脑死亡后肝脏。该装置可实现延长保存 离体 DCD 肝脏的保存以及减轻供体肝脏的缺血性损伤方面优于传统的静态冷保存（SCS）。该装置可确保温度调控，支持远距离运输，并提供仿生灌注以及对供体肝脏质量进行动态且精确的评估。本方案包含了利用序贯式 DHOPE-NMP 模式进行 DCD 肝脏保存并随后实施猪同种异体原位肝移植（OLTx）的稳定模型所需的全部信息，包括灌注参数的转换、吻合技术的优化以及无肝期的操作流程。

<table><tbody><tr><td>麻醉呼吸机</td><td>Mindray,深圳</td><td>WATO EX-20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>全自动生化分析仪</td><td>&amp;nbsp;MNCHIP, 中国</td><td>&amp;nbsp;Celercare V5</td><td></td></tr><tr><td>Bama雌性小型猪&amp;nbsp;</td><td>广东 Pearl Lab Animal Sci &amp; Tech Co,Ltd（中国）&amp;nbsp;</td><td></td><td>40–45 kg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血气分析仪&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Abbott</td><td>i-STAT300</td><td></td></tr><tr><td>心电监护仪</td><td>中国深圳 Ericon 医疗设备有限公司</td><td>M-9000S</td><td></td></tr><tr><td>全自动雪花制冰机</td><td>中国常熟盛海电器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>常温机械灌注灌注液</td><td></td><td></td><td>5% 人血清白蛋白 100–150 mL,&lt;br/&gt; 全血 1.2–1.5 L,&lt;br/&gt; 2.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 21 mL,&lt;br/&gt; 10% CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 7 mL,&lt;br/&gt; 肝素 5000 U,&lt;br/&gt; 头孢西丁 1 g,&lt;br/&gt; 甲硝唑 500 mg,&lt;br/&gt; 牛磺胆酸钠 5 g,&lt;br/&gt; 短效胰岛素 72 U,&lt;br/&gt; 全肠外营养液 250–500 mL。</td></tr><tr><td>门静脉导管</td><td>金鑫科技，顺德，中国</td><td></td><td>用于定制套管（内径 6–8.5 mm）的门静脉导管</td></tr><tr><td>冷冻离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific - CN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CG8/CG4 血气检测卡</td><td>&amp;nbsp;Abbott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEM 8 检测卡</td><td>&amp;nbsp;Abbott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离体肝脏机械灌注装置</td><td>中国广东德沃海洋医疗仪器有限公司</td><td>DEVOCEAN-LIVER 2000</td><td>这是一种多模式、温度可控的仿生离体肝脏机械灌注装置，可在体外保存肝脏长达 24 小时</td></tr><tr><td>UW 冷保存液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Bridge to Life, Ltd., 美国</td><td>Belzer UW</td><td>SCS 组的肝脏保存于 UW 冷保存液中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UW 机械灌注液</td><td>Bridge to Life, Ltd., 美国</td><td>Belzer MPS</td><td>&amp;nbsp;腺嘌呤（游离碱）0.68 g,&lt;br/&gt; 氯化钙（二水合物）0.068 g,&lt;br/&gt; 葡萄糖（+）1.80 g,&lt;br/&gt; 谷胱甘肽（还原型）0.92 g,&lt;br/&gt; HEPES（游离酸）2.38 g,&lt;br/&gt; 羟乙基淀粉 50.0 g,&lt;br/&gt; 葡萄糖酸镁 1.13 g,&lt;br/&gt; 甘露醇 5.4 g,&lt;br/&gt; 磷酸二氢钾 3.4 g,&lt;br/&gt; 核糖，D(-) 0.75 g,&lt;br/&gt; 葡萄糖酸钠 17.45 g,&lt;br/&gt; 氢氧化钠 0.70 g,&lt;br/&gt; 注射用无菌水 加至 1000 mL</td></tr><tr><td>负压吸引器</td><td>SMAF</td><td>DYX-2A</td><td></td></tr></tbody></table>

通过灌注保存心脏死亡后捐献（dcd）猪肝脏及原位肝移植

Preservation of Porcine Donation after Circulatory Death (DCD) Liver by Perfusion and Orthotopic Liver Transplantation

传统的静态冷保存（SCS）会加剧DCD肝脏的缺血性损伤，导致移植受者出现严重并发症。为解决这一问题，临床上正在推进机械灌注（MP）技术在供体肝脏保存中的应用。与此同时，研究人员正致力于开发多种MP设备，并通过相关动物模型实验进行验证。有效的大型动物试验在临床应用中发挥着关键作用。然而，该领域仍面临诸多挑战 离体 DCD肝脏的保存及猪的肝移植手术。这些难点包括解决供体肝脏的长期保存、进行活力检测、减轻缺血性损伤以及缩短无肝期。使用可变温度控制的机械灌注（MP）装置，通过序贯的双低温氧合机械灌注（DHOPE）和常温机械灌注（NMP）模式，可实现DCD肝脏的长期保存。该方案通过提高DCD肝脏的质量、优化吻合技术并缩短无肝期持续时间，从而改进了猪的原位肝移植（OLTx）模型。

DCD 肝脏在移植给受体猪之前，采用 DHOPE-NMP 程序作为保护性措施。DHOPE-NMP 程序的具体步骤如下：DCD 肝脏（n = 8）在经历 30 分钟热缺血时间（WIT）后，首先在 DHOPE 中于 4°C 下保存 8 小时，随后转入 NMP 模式继续灌注 6 小时。之后，这些移植物被用于猪模型的肝移植（LT）。各组分组及实验方案的示意图见图 1。移植程序主要步骤的示意图见图 2A-D。作为对照措施，另一组肝脏移植物（n = 8）在心脏死亡后经历 30 分钟 WIT，并在 SCS 中保存 8 小时后直接移植入受体猪，作为对照组。观察发现，对照组中有三只受体猪在移植后 36 小时内死亡（补充图 1）。对照组猪只苏醒时间延长，在观察期间表现出食欲减退和活力下降。五只对照组猪存活至移植后第 5 天随访结束。然而，在接受 DHOPE-NMP 处理的实验组中，八只受体猪中有六只存活了 5 天。DHOPE-NMP 组中一只猪因移植后第 3 天发生胆汁泄漏而死亡，另一只猪因移植后 24 小时发生心脏骤停而死亡。术后通过留置深静脉导管每隔 24 小时采集血样，并检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）和总胆红素水平（图 3A,B）。
<img alt="器官保存方法：A) SCS 设置，B) NMP 设置，C) 移植可行性测试示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65879/65879fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验方案概览。 本图展示了在SCS组（使用UW冷保存液保存）和DHOPE-NMP组中，对热缺血时间（WIT）为30分钟的DCD肝脏移植物进行保存的流程，随后将移植物移植至受体猪体内。(A) 肝脏移植物在4 °C条件下连接至DHOPE系统的代表性图像。(B) 肝脏移植物在37 °C条件下连接至NMP系统的图像。(C) 描述实验流程、设置及动物分组的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65879/65879fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏移植过程示意图；手术步骤；肝切除术；血管吻合；肝动脉，门静脉。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65879/65879fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：采用机械灌注（MP）的猪原位肝移植（OLTx）模型示意图。 （A）供体肝脏的肝动脉和门静脉连接至与机械灌注装置相连的插管，胆汁流出量被实时监测。（B）游离受体肝脏，并将专用插管插入受体端的门静脉残端。（C）当供体肝脏正确就位后，进行肝上腔静脉吻合；同时夹闭肝下下腔静脉，并将供体门静脉插管与受体端对应的插管连接，以恢复门静脉血流。（D）完成肝下下腔静脉吻合，随后依次进行肝动脉和胆管的吻合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65879/65879fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肝移植结果；胆红素和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平；SCS与DHOPE-NMP方法的对比图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65879/65879fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：SCS组（n = 5）与DHOPE-NMP组（n = 6）猪OLTx术后总胆红素和ALT水平评估。 (A,B) 猪OLTx后在指定时间点的总胆红素和ALT分析。数据以均值±标准差表示。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）比较两组间的差异。DHOPE-NMP组 与. SCS 组：*P &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65879/65879fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：采用静态冷保存（SCS）组（n = 8）与DHOPE-NMP组（n = 8）后猪原位肝移植的Kaplan-Meier生存曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65879/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：DHOPE（n = 6）或SCS（n = 6）处理8小时后，在NMP期间对门静脉压力（PV压力）、血清乳酸和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的评估。 (A-C在指定时间点对NMP期间的PV压力、乳酸和ALT进行分析。数据表示为均值±标准差。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）比较两组之间的差异。DHOPE组 与. SCS 组：*P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65879/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本方案概述了利用变温控制的机械灌注（MP）技术保存供体肝脏，随后进行原位肝移植（OLTx）的猪模型建立方法。该方案旨在提高使用循环死亡后捐献（DCD）供体肝脏进行OLTx的成功率，并建立一个稳定的实验模型。

通过灌注保存心脏死亡后捐献（DCD）猪肝脏及原位肝移植

传统的静态冷保存（SCS）会加剧DCD肝脏的缺血性损伤，导致移植受者出现严重并发症。为解决……

机械灌注技术已显著提升供体肝脏质量的保存效果，尤其适用于扩展标准肝脏。通过离心泵和氧合器持续输送氧气和营养物质，可维持器官活性并监测肝功能，从而延长保存时间并提高运输成功率。在供体肝脏中应用机械灌注技术的主要挑战在于需借助复杂的设备和熟练的操作来模拟肝脏的生理条件。在脑死亡后供体（DCD）肝脏模型中，存在的局限性包括肝脏质量下降、保存时间延长以及无肝期的影响，导致实验模型的成功率较低。为克服这些挑战，我们开发了一种具有可变温度控制功能的机械灌注装置，并发现此类装置能够在最大限度减少缺血性损伤的同时有效维持肝脏保存效果。这些改进显著提高了我们脑死亡后供体肝脏移植模型的成功率，并有助于进一步推动机械灌注技术在临床中的广泛应用。在手术台上将麻醉后的猪仰卧位固定，对皮肤进行消毒后，从正中线开始行腹正中切口，并向右侧横向延伸。仔细分离肝动脉和门静脉周围的组织。随后游离腹腔干，并沿其追踪至腹主动脉。解剖腹主动脉和下腔静脉以方便采血。依次插管腹主动脉和下腔静脉。将血液收集至含酸性枸橼酸葡萄糖的采血袋中以供后续使用，然后为门静脉安装特定导管。接下来，在诱导动物心脏停搏后，切除肝脏。保留一段腹主动脉组织用于动脉插管。将肝脏置于无菌器官袋中，并放置于冰上。在插管胆总管之前，结扎肝脏所有远端动脉分支。将门静脉和腹主动脉的导管连接至机器灌注装置。用 1.5 升灌注液对肝脏进行灌注。将灌注温度设置为4摄氏度，时间为8小时，然后设置灌注参数，使肝动脉处于25毫米汞柱的压力控制下，门静脉处于每分钟200毫升的流量控制下。当设备处于常温机械灌注模式时，在启动前将系统温度升至37摄氏度。设备预热10分钟后，将猪供体肝脏转移至设备中。设定动脉灌注压力和门静脉灌注。在第一小时后，将门静脉灌注压力增加至0.75毫升/分钟/克。从装置中取出供体肝脏后，将导管插入门静脉，通过门静脉导管依次进行灌注。接下来，将一根专用导管插入受体肝脏的门静脉，并使用双头4-0单丝聚丙烯缝线将导管结扎固定，使其与供体门静脉上的对应导管相连。使用双头4-0单丝聚丙烯缝线，行肝上腔静脉端对端吻合。通过匹配的套管连接门静脉两端，以恢复血流。在移除肝上腔静脉的血管夹后，使用4-0单丝聚丙烯缝线行下腔静脉端对端吻合。用10毫升肝素化生理盐水冲洗供体肝动脉，并在远端放置另一把 bulldog 血管夹以防止反向出血。最后，拔除门静脉导管后，使用4-0单丝聚丙烯缝线吻合门静脉。

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科研

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生物工程

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