Name: 调幅电形成评估生物细胞的机械疲劳 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用调幅电形成技术评估人红细胞的机械疲劳特性。该方法通过循环加载测量细胞膜形变与生物力学变化，为研究血细胞损伤机制及疾病中细胞寿命缩短提供新工具。

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本研究由美国国家科学基金会/机械与材料创新部资助，项目包括基于血红蛋白的人工氧载体的力学生物学（#1941655）以及健康与病变红细胞的动态与疲劳分析（#1635312）。

去标识化的人全血通过商业途径获得。涉及血液样本的操作在生物安全二级实验室中进行，并遵循佛罗里达大西洋大学机构生物安全委员会批准的实验方案。
1. 微流控装置的制备
<ol>
	<li>将用于微流控通道设计的 SU-8 母版硅片用胶带固定在 14 cm 塑料培养皿内侧，并用 N2 气体清洁。</li>
	<li>在纸杯中称取 60 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底和 6 g PDMS 固化剂，用木刮刀混合两组分，直至混合物呈乳白色。</li>
	<li>将 PDMS 混合物倒入含有硅片的塑料培养皿中。将培养皿放入带有三通旋塞的真空干燥器中，旋转旋塞阀门使真空与干燥器腔体连通，以去除 PDMS 中的气泡。</li>
	<li>通过调节旋塞阀门，使干燥器腔体与外界环境连通，约每 5 分钟重新引入一次空气。重复此过程，直至通道结构中的所有气泡均被去除。</li>
	<li>将培养皿置于 70 ˚C 烤箱中加热 4 小时。时间结束后取出培养皿，使其冷却至室温，然后放置在切割垫上。</li>
	<li>使用手术刀切下硅片上方的 PDMS 部分。将切下的 PDMS 夹在两层实验室包裹膜之间。微通道凹陷与半透明膜之间形成的间隙有助于识别微流控通道的位置及其相应的进样口和出样口。</li>
	<li>使用剃刀片从大块 PDMS 中切出单个通道。使用与两种尺寸相对应的活检打孔器，分别打出 3 mm 的进样孔和 1.5 mm 的出样孔（图 1A）。</li>
	<li>将打孔后的通道以通道面朝上的方向放置在洁净的载玻片上。将一块尺寸为 20 mm × 15 mm、带有薄膜氧化铟锡（ITO）叉指电极的玻璃基底也放置在同一载玻片上，电极面朝上。</li>
	<li>小心地将带有 PDMS 和基底的载玻片放入等离子清洗仪中。关闭气体阀门，打开泵开关，等待 2 分钟，使传感器读数达到 600 – 800 mTorr。</li>
	<li>打开电源开关并等待 30 秒。将射频（RF）功率旋钮从低调至高，再等待 1 分钟。</li>
	<li>然后按相反顺序操作：将射频旋钮调回低档，关闭电源开关，关闭泵开关，并打开气体阀门。</li>
	<li>在等离子清洗仪腔体打开后立即取出，提起并旋转 PDMS，使其通道面朝下（180˚），将通道面放置在 ITO 基底上方。键合过程即开始。</li>
	<li>使用镊子轻轻按压 PDMS 的四个角约 3 秒。避免按压通道本身。 
	注意：当两个经处理的表面发生物理接触时，键合过程会自发进行。</li>
	<li>将预润湿介质装入带有 23 G 针头的 1 mL 注射器中。将针头垂直插入进样孔，缓慢释放介质以润湿通道。操作应缓慢，避免引入气泡。孵育至少 3 分钟。</li>
	<li>使用 10 µL 移液器吸头移除预润湿介质。通过将介电电泳（DEP）介质注入通道，用 DEP 介质清洗通道 3 次。始终保持通道处于湿润状态。</li>
</ol>
2. 测试夹具
注意：测试夹具使用 3D CAD 软件设计，包括一个底座单元和一个顶部单元（图 1B）。随后，使用三轴数控铣床进行加工，标准公差约为 ± 0.005 英寸。使用电子卡尺（未示出）检查测试夹具的尺寸。体外生物力学测试无需夹具无菌。
<ol>
	<li>将导线预先焊接到两组弹簧活塞连接器的焊杯端。</li>
	<li>将弹簧活塞连接器插入上部单元，并滴加一滴环氧胶实现永久固定。</li>
</ol>
3. 电变形工作缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制 DEP 介质时，使用天平称取 12.75 g 蔗糖和 0.45 g 葡萄糖。</li>
	<li>将两种粉末溶于一个容器中，加入 150 mL 去离子水（DI 水）和 3.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>使用低量程电导率仪测量电导率，并确保其值为 0.04 S/m（图 2）。 
	注意：可使用不同的电导率值，这可能会改变最终介电泳力（DEP 力）的符号和大小11。然而，电致变形需要正向介电泳力。</li>
	<li>使用渗透压计确认渗透压处于血浆正常范围，即 275 至 295 mOsm/kg 水（图 3）。4 ˚C 下保存。DEP 介质现已配制完成。</li>
	<li>在 15 mL 离心管中，将 0.5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶于 10 mL DEP 介质中，充分混匀。装置的预冲介质现已配制完成。</li>
</ol>
4. 细胞悬液的制备
<ol>
	<li>取20 µL全血，加入1 mL PBS，以268 × g 离心3分钟，洗涤血液。弃去上清液。</li>
	<li>将红细胞重悬于1 mL PBS中，轻轻吹打混匀。以268 × g 离心3分钟洗涤红细胞，弃去上清液。</li>
	<li>使用10 µL微量移液器吸取5 µL红细胞沉淀，充分排入1 mL DEP培养基中。以268 × g 离心3分钟洗涤细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将红细胞重悬于1 mL DEP培养基中，轻轻吹打混匀。</li>
	<li>以268 × g 离心3分钟洗涤红细胞，弃去上清液。将2 µL红细胞沉淀移入500 µL DEP培养基中。此时细胞悬液的浓度范围为1 - 6.2 × 104 个细胞/µL12，可使用标准细胞计数板进行确认。</li>
</ol>
5. 电致变形装置与疲劳测试
<ol>
	<li>将微流控装置放入测试夹具的底部。将夹具的上部与装置对齐，并使用两组尼龙螺丝和螺母将两部分组装在一起（图4）。</li>
	<li>将测试夹具放置在显微镜载物台上。在显微镜下定位一组目标电极。</li>
	<li>将与所定位电极组相对应的一对电极导线连接至函数发生器的输出端（图4）。</li>
	<li>从微流控通道的3 mm进样口移除5 µL介电泳介质。使用10 µL移液枪头缓慢将5 µL细胞悬液加载至进样口。</li>
	<li>静置1分钟使细胞沉降。如有必要，向进样口添加额外的介电泳介质以推动细胞进入通道。</li>
	<li>在20倍放大倍数下观察通道。使用414/46 nm带通滤光片以增强成像对比度。</li>
	<li>按下正弦按钮，设置一个频率为3 MHz、幅值为2 VRMS的正弦波。按下调制按钮以启用调制功能。通过按下类型选项将波形模式更改为ASK。</li>
	<li>将调制频率设置为250 mHz，对应4秒的加载-卸载周期（图5A）。开启函数发生器的输出。</li>
	<li>每隔10分钟以每秒30帧（fps）的速度录制一段1分钟的视频。</li>
</ol>
6. 红细胞变形特性的表征
<ol>
	<li>使用视频编辑应用程序，通过按 Ctrl+O 打开上一步骤中记录的 .avi 文件。利用时间轴选择感兴趣的帧，并通过按键盘上的 Home 键然后按 End 键，将选区的起始帧和结束帧设置为相同。</li>
	<li>导出图像帧。选择输出格式为 JPEG，然后按 OK。</li>
	<li>打开 ImageJ 应用程序并加载上一步保存的图像。首先按 分析 &#62; 设置测量值，并确保勾选 面积、周长 和 拟合椭圆 的复选框，然后按 OK。</li>
	<li>接下来，通过选择 图像 &#62; 类型 &#62; 8 位 将图像转换为灰度图像。</li>
	<li>然后使用 图像 &#62; 调整 &#62; 阈值 将图像转换为二值图像。在“阈值”对话框中，根据需要调整两个滑块。点击 应用，然后关闭“阈值”对话框。</li>
	<li>选择 分析 &#62; 工具 &#62; ROI 管理器。在 ROI 管理器中，勾选标有 显示全部 的复选框。请勿关闭此窗口。</li>
	<li>选择 魔棒（描迹）工具，在图像中选择一个合适的细胞，然后按键盘上的 T 键。所选细胞将被编号。可再次选择新的细胞。选择所有需要测量的合适细胞。合适的细胞是指与其他细胞分离的细胞。在单个视野中，这些细胞的数量可能在 50 到 200 个之间。</li>
	<li>返回 ROI 管理器窗口并点击 测量。这将打开“结果”窗口。标有“主轴”和“次轴”的列分别为拟合椭圆的长轴和短轴长度（单位：像素）。选择 文件 &#62; 另存为，将测量结果以 CSV 格式文件导出。</li>
	<li>使用任何合适的计算分析软件，计算主轴与次轴的商值。</li>
</ol>

Mechanical Fatigue Testing of RBCs by Amplitude-Modulated Electrodeformation

<ol><li>Kim, Y., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+techniques+for+red+blood+cell+deformability%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell%E2%80%94An+Overview+of+Studies+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances.</a> Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).</li>
<li>Safeukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+sensing+and+sequestration+of+spherocytic+erythrocytes+by+the+human+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).</li>
<li>Naghedi-Baghdar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diet+on+blood+viscosity+in+healthy+humans%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+physician%22%5BJournal%5D)">Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review.</a> Electronic physician. 10 (3), 6563(2018).</li>
<li>Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+red+cell+lifespan+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Measurement of red cell lifespan and aging.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).</li>
<li>Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+measuring+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Technologies for measuring red blood cell deformability.</a> Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).</li>
<li>Kim, J., Lee, H., Shin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+measurement+of+red+blood+cell+deformability%3A+A+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review.</a> Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).</li>
<li>Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+diversity+of+osmotic+gradient+deformability+of+red+blood+cells+in+human+and+seven+vertebrate+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species.</a> Cells. 11 (8), 1351(2022).</li>
<li>Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformation+measurement+of+individual+cells+in+large+populations+using+a+single-cell+microchamber+array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173702(2012).</li>
<li>Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation and analysis.</a> Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).</li>
<li>Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyDEP%3A+a+new+computational+tool+for+dielectric+modeling+of+particles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells.</a> Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).</li>
<li>Haywood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+full+blood+count%5BTitle%5D)+AND+%22InnovAiT%22%5BJournal%5D)">Interpreting the full blood count.</a> InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+fatigue+of+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanical fatigue of human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+for+single-cell+characterization+of+impaired+deformability+in+red+blood+cells+under+recurrent+episodes+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过使用ASK OOK调制的介电泳力诱导正弦波，可对红细胞（RBCs）进行长时间的机械疲劳测试。在本实验方案中，我们将体外疲劳测试时间限制为1小时，以避免可能对细胞变形能力产生不利的代谢影响。可利用ASK调制的电极变形技术编程设定全面的疲劳测试条件。加载频率、振幅和加载速率等参数均可进行编程设置。可通过将加载频率设定为不同数值，来确定疲劳对加载频率的依赖性，以及循环加载与静态加载之间的差异13。
通过使用不同的电压水平，可以轻松调节拉伸程度，以适应小形变或大形变。然而，当采用高电压水平引起大形变时，需注意电致形变会导致红细胞呈现火焰状（图6，步骤3）。此时，若使用椭圆模型拟合细胞形状，会截去细胞的尖端部分，从而引入误差。在此情况下，特别是在利用电致形变提取细胞膜剪切黏弹性参数时，可采用两种策略：（i）使用真实细胞形状的计算模型，相比简单的解析椭圆模型可提供更准确的结果；（ii）采用较低的电压水平拉伸细胞，使细胞形状能够被椭圆良好拟合。
<p class="jove_c...

红细胞（RBC）是人体中最可变形的细胞1。其变形能力与其携氧功能直接相关。红细胞变形能力降低已被发现与多种红细胞疾病的发病机制相关2。变形能力的测量有助于我们更好地理解与红细胞相关的疾病3。正常红细胞的寿命可在70至140天之间变化4。因此，测量其变形能力如何随着衰老过程而下降非常重要，例如，由于循环剪切应力导致的疲劳行为3。
高通量测量红细胞（RBC）变形能力具有挑战性，因为施加在单个细胞上的力处于皮牛顿量级（~10-12 N）。在过去十年中，已开发出多种技术用于测量细胞变形能力5。在单细胞水平上对红细胞进行变形测量可通过微管吸吮法和光镊技术实现，而群体分析则采用渗透梯度变形指数测定法（ektacytometry）。变形指数测定分析可提供大量数据，有助于诊断血液系统疾病6,7。红细胞的变形能力也可通过胶体探针原子力显微镜结合粘弹性理论进行分析。该方法通过计算分析，综合考虑时间依赖性和稳态响应，估算红细胞的弹性模量。单个红细胞的变形能力还可利用单细胞微腔阵列法进行测量。该方法通过膜和胞质荧光标记物对每个细胞进行分析，为红细胞变形能力以及复杂红细胞群体中细胞特征分布提供信息，从而有助于检测血液系统疾病8。
疲劳是导致工程材料和生物材料性能退化的一个关键因素。疲劳测试能够对承受循环载荷的结构的完整性与耐久性进行定量分析。长期以来，由于缺乏一种通用、易于实施、高通量且定量的方法来实现细胞膜的周期性形变，生物细胞疲劳的研究一直受到限制。通过在微流控环境中应用电信号调制与电致形变技术，这一难题得以解决。本文采用幅度键控（ASK）这一数字调制方式，具体通过开关键控（OOK）调制实现。所谓“键控”，是指通过信道传输数字信号，其运行需依赖正弦波载波信号9。开与关的时间可设置为相等。在开键控期间，红细胞在暴露于非均匀电场产生的外部电致形变力（Fdep）时进入形变状态10；在关键控期间，红细胞则处于松弛状态。我们观察到红细胞的疲劳现象，即随着加载周期的增加，其延展能力逐渐下降。红细胞因疲劳导致的变形性丧失，可为血液循环过程中细胞膜累积损伤提供重要线索，有助于进一步探究细胞疲劳与疾病状态之间的关联。
本文提供了通过ASK调制电致变形技术在微流控装置中实施红细胞疲劳测试的逐步操作流程，以及系统设置，包括微流控装置、力学加载和显微成像，用于表征红细胞机械变形能力的逐步退化过程。

<table><tbody><tr><td>天平</td><td>ViBRA</td><td>HT-224R</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>BRIGHTLINE</td><td>414/46 BrightLine HC</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;带Luer-Lok&amp;trade;接头的一次性注射器，1 mL</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>带推杆系统的活检穿孔器，1.5 mm</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>12-460-403</td><td></td></tr><tr><td>带推杆系统的活检穿孔器，3 mm</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>12-460-407</td><td>直径1.5 mm和3 mm</td></tr><tr><td>钝头针，23号</td><td>BSTEAN</td><td>X001308N97</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>RMBIO</td><td>BSA-BSH</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>SCILOGEX</td><td>911015119999</td><td></td></tr><tr><td>50 mL锥形管</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>MDX01455</td><td>MilliporeSigma&amp;trade;</td></tr><tr><td>EC低电导率仪</td><td>ecoTestr</td><td>358/03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp; &amp;nbsp;带 snap-cap 的微量离心管</td><td>www.eppendorf.com</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft&amp;nbsp;</td><td></td><td>绘图</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>SIGLENT</td><td>SDG830</td><td></td></tr><tr><td>玻璃/ITO电极基底</td><td>OSSILA</td><td>S161</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>IX81 - SN9E07015</td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>QUINCY LAB (QL)</td><td>MODEL 30GCE</td><td>数字型号</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>绘图</td></tr><tr><td>微渗透压计 - 型号 3300</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>S/N: 03050397P</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm实验室封口膜</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>FALCON</td><td>SKU=351006</td><td>ICSI/活检皿 50*9 mm</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>LONZA</td><td>04-479Q</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick plasma PDCOOL</td><td>NC0301989</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systemes</td><td></td><td>CAD软件</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>50-188-2419</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>SPBEL-ART</td><td>F42400-2121</td><td></td></tr><tr><td>木制刮勺</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>NC0304136</td><td>木质压舌板 NS 6&quot;</td></tr></tbody></table>

调幅电变形法评估生物细胞的力学疲劳

Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells

红细胞（RBC）以其显著的变形能力而著称。在通过微循环时，它们会反复经历显著的形变。生理老化红细胞的变形能力会降低。现有的测量细胞变形能力的技术难以用于测量疲劳，即细胞膜在循环载荷作用下逐渐发生的退化。本文提出一种利用基于幅移键控（ASK）调制的电致变形技术，在微流控通道中评估红细胞在循环剪切应力下机械退化的实验方案。简言之，通过信号发生器向微流控通道内的叉指电极施加射频范围内的低电压交流电，使悬浮的红细胞响应电场并表现出正向介电泳（DEP）效应，从而被驱动至电极边缘。随后，由于作用于细胞两半部分的电力，细胞被拉伸，产生单轴拉伸，即电致变形。通过调节激励波形的幅值，可方便地调控剪切应力水平及相应的形变程度，从而实现对红细胞在小形变和大形变条件下非线性变形能力的高通量定量分析。采用ASK策略对激励波形进行调制，可实现具有可编程加载速率和频率的循环电致变形，为红细胞疲劳特性的表征提供了便捷手段。本研究建立的ASK调制电致变形方法首次实现了对红细胞在循环载荷下疲劳效应的直接测量。该方法可作为通用生物力学测试工具，用于分析其他细胞类型及疾病状态下细胞的变形能力与疲劳特性，并可与调控细胞微环境（如氧张力及生物化学信号）的策略相结合。

当将细胞悬液注入微流控通道时，可观察到细胞分布相对均匀。在函数发生器输出信号（例如简单的正弦波或ASK的键控开启相位）作用下，薄膜叉指电极产生非均匀的交变电场。悬浮细胞自发响应此电刺激，表现出正向介电泳（DEP）行为，即向电场强度更高的电极边缘移动。因此，细胞沿电极边缘排列，并因电致变形而被拉伸。在键控开启相位下，红细胞因电致变形而被拉伸；在键控关闭相位下，红细胞则处于松弛状态（图5B）。在本实验方案中，保持细胞的离散性至关重要。按照本方案所述的稀释倍数，正常红细胞悬液的浓度范围为1 - 6.2 × 104 个细胞/µL。在此浓度范围内，我们能够在实现高通量细胞测量的同时，最大限度地减少因正向介电泳效应导致的细胞聚集。
在1小时疲劳测试期间追踪单个红细胞时，我们观察到细胞变形程度逐渐降低（图5C）。通过使用开源成像软件，将单个红细胞拟合为椭圆，并以椭圆长轴与短轴的比值来量化其变形能力（图6</stro...

本文介绍了一种采用振幅调制电变形方法对人红细胞进行机械疲劳测试的实验方案。该通用方法可用于测量悬浮状态下生物细胞在周期性形变过程中形态学和生物力学特性的系统性变化。

红细胞（RBCs）以其显著的变形能力而著称。它们在通过……时会反复发生显著的形变。

我们的研究聚焦于循环细胞（如人类红细胞）的细胞生物力学。我们利用电动力学、微流控技术和材料科学，探究细胞膜损伤的力学成因，以及某些疾病中血细胞寿命缩短的潜在机制。生物细胞的疲劳研究具有挑战性。该方法需要对细胞膜施加循环载荷，并追踪单个细胞的形变情况。通过使用幅移键控（amplitude-shift keying, ASK）来调制红细胞的电致变形行为，我们能够量化细胞变形能力的变化与加载周期之间的对应关系。我们首次证明，仅通过循环拉伸即可导致红细胞膜的降解。本方案利用介电电泳将细胞移动至电极边缘，以进行电极形变测量。该方法无需任何稳定技术，可直接用于细胞悬液。采用叉指微电极可使我们在单个视野中同时测量数十个细胞。为配制介电泳（DEP）介质，使用天平称取12.75克蔗糖和0.45克葡萄糖。将两种粉末溶解于150毫升去离子水与3.5毫升PBS的混合溶液中。使用低电导率测试仪测量溶液电导率，确保其为0.04西门子每米。使用渗透压计确认渗透压处于血浆正常范围内。将配制好的 DEP 培养基在 4 摄氏度下保存。在 15 毫升离心管中，将 0.5 克牛血清白蛋白溶解于 10 毫升 DEP 培养基中，并使用涡旋振荡器充分混匀，以制备装置的预处理培养基。首先，将用于微流控通道设计的SU-8模具硅片用胶带固定在直径14厘米的塑料培养皿内侧，并用氮气清洁。在纸杯中称取适量的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂和PDMS固化剂。使用木制刮刀将两者混合，直至混合物变为乳白色浑浊状。将PDMS混合物倒入含有硅片的塑料培养皿中。然后将培养皿放入配备三通旋塞的真空干燥器中。旋转旋塞阀门，使真空与干燥室连通，以去除混合物中的气泡。待通道结构中的所有气泡完全排出后，将培养皿置于70摄氏度的烘箱中加热四小时。待培养皿冷却至室温后，将其放置于切割垫上。使用手术刀，切下PDMS在硅片上方的相应部分。将切割好的PDMS置于两层实验室包装膜之间。微通道凹槽与薄膜之间的间隙有助于定位微流控通道的入口和出口。接着，使用剃刀刀片从大块PDMS中切出单个通道。使用相应的活检打孔器，在通道上制作合适的进样口和出样口。将整个打孔后的通道放置在干净的载玻片上，确保通道面朝上。将一块带有薄膜氧化铟锡（即 ITO）叉指电极的玻璃基底放在同一载玻片上，电极面朝上。然后将载玻片轻轻放入等离子清洗机中。关闭气体阀门并启动真空泵，等待两分钟，使传感器读数达到 600 至 800 毫托。接着打开电源开关，等待 30 秒后，将射频功率旋钮从低调至高，并等待一分钟。然后关闭设备时，需按照相反的顺序操作。在打开等离子清洗仪腔室后，立即提起PDMS并旋转180度，使带有微通道的一面朝下。将该面置于ITO基底上方，以启动键合过程。使用镊子轻轻按压 PDMS 的四个角，持续约三秒钟。用 23 号针头将 1 毫升注射器吸取润洗液。将针头垂直插入入口孔中，缓慢而小心地注入润洗液以润湿通道，注意避免引入气泡。孵育至少三分钟后，使用10微升移液枪头移除初代培养基。最后，通过将介电电泳培养基注入通道，重复洗涤三次。开始洗涤时，取20微升全血与1毫升PBS混合，在268×g条件下离心三分钟。然后弃去上清液。用1 mL PBS通过轻柔吹打重悬所得的红细胞（RBCs）。再次洗涤RBCs，并如前所述弃去上清液。使用10微升微量移液器吸头，吸取5微升红细胞沉淀，并将其完全排入1毫升介电电泳（DEP）培养基中。按照演示方法洗涤细胞，并弃去上清液。通过轻柔吹打，将沉淀的红细胞重悬于1毫升DEP培养基中。洗涤细胞并弃去上清液后，用移液器将两微升红细胞沉淀加入500微升DEP培养基中。使用标准细胞计数板确认所得细胞悬液的浓度。首先，将微流控装置放入测试夹具的底部。将夹具的上部对准设备，并使用两组尼龙螺丝和螺母将两部分组装在一起。将测试夹具放置在显微镜载物台上。在显微镜下找到一组所需电极，将与该电极组相对应的一对电极导线连接至函数发生器的输出端口。从微流控通道的三毫米入口处移除五微升介电电泳（DEP）介质。使用10微升移液枪头，缓慢将五微升制备好的红细胞（RBC）悬液加入入口，静置细胞一分钟。在20倍放大倍数下观察通道。按下正弦按钮，设置一个均方根幅度为两伏、频率为三兆赫兹的正弦波。按下调制按钮以启用调制功能。按下类型选项，将波形模式更改为幅移键控（ASK）。将调制频率设置为250毫赫兹，对应四秒的加载/卸载周期。打开信号发生器的输出，每10分钟以每秒30帧的速度记录一段时长一分钟的视频。红细胞在电刺激下自发地向电场强度较高的电极边缘移动。在通电相位下，红细胞因电致变形而被拉伸；而在断电相位下，红细胞则发生松弛。在持续一小时的疲劳测试中追踪单个红细胞时，可观察到细胞变形程度逐渐降低。

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调幅电变形法评估生物细胞的力学疲劳

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