用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

我们的实验室致力于研究宿主与病原体之间的相互作用，以及感染后免疫细胞的动态变化。通过采用一种可靠的细胞培养模型，我们希望更贴近地模拟体内组织水平上发生的复杂相互作用。一些已发表的关于牛代际传递现象的文献缺乏必要的实验细节，导致该方案难以被轻易重复，使缺乏经验的研究人员在应用时面临挑战。

本模型的优势在于我们提供了一套极为详细的实验方案，可供初学者研究人员成功使用。构建Transwell单层细胞模型可实现与免疫细胞的共培养，从而揭示组织与病原体相互作用的机制，同时维持类似体内组织的结构特征。

这种多功能模型对于研究多种牛类疾病具有重要价值，其复杂性超越了单细胞模型。本实验室将采用该模型来探究影响隐孢子虫感染易感性的免疫因素。该模型将有助于在保持组织结构和免疫细胞微环境的前提下，比较成年牛与犊牛之间的差异。

本研究的成果对人类健康具有直接的转化潜力。首先，将细胞培养小室放入24孔组织培养适配器板中。用100 µL基底膜细胞外基质（BME）在类肠器官生长培养基中预包被小室的顶侧。

加载一个额外的插入物，用于在屏障完整性测量期间作为对照。随后，将包被的插入物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时。孵育完成后，吸除3D肠类器官培养基。

用一毫升冰浴洗涤液收获牛回肠类器官。使用细胞刮棒刮下类器官球状结构，并将其收集至一个15毫升锥形管中。用一毫升移液枪头反复吹打30次，以产生类器官碎片。

接下来，使用200微升枪头进一步吹打约40次，以分散类肠体碎片。用预冷的洗涤培养基将管内液体体积补至10毫升。然后在室温下以300 ×g离心5分钟。

小心吸除上清液，包括 BME 层。接着，每四个类球体结构，用一毫升预热的 TrypLE Express 酶重新悬浮沉淀。将混合物转移至 24 孔板中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 10 分钟。

使用1毫升移液器轻轻吹打混合物，以进一步解离类肠体。然后使用200微升移液器吹打混合物，将组织碎片解离为单细胞。用装有无菌22号针头的3毫升注射器吸取并滴加细胞悬液4次，以获得单细胞悬液。

使用显微镜监测细胞解离过程，直至80%的肠类器官分解为单个细胞。现在将细胞悬液收集至15毫升锥形管中。加入四倍体积的FBS洗涤培养基以终止反应。

随后将类肠组织通过预包被的40微米细胞筛两次，过滤至50毫升锥形管中。以300 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除离解后的牛回肠类肠组织细胞悬液在离心管中的上清液。

用少量类器官生长培养基重悬沉淀。接下来，采用台盼蓝染色排斥法并结合血细胞计数板测定细胞活力。小心去除细胞培养小室中多余的包被溶液。

在预先包被的培养小室的顶端表面接种200微升单细胞悬液。随后，在小室的基底侧加入700微升含FBS的完全培养基。将培养板以“8”字形移动约10次，使细胞在小室表面均匀分布。

然后将培养板置于生物安全柜内的板式加热器上，放置10分钟。将培养板在37°C、5%二氧化碳条件下孵育48小时。孵育结束后，用新鲜的肠类器官生长培养基更换顶端和基底端的培养基。

第二天，移除顶侧和基底外侧区室中的培养基。用 PBS 小心清洗小室，并更换为仅添加抑制剂的类肠器官分化培养基。接种的牛肠隐窝培养数小时后即可观察到类肠体的形成。

两天后，类球体的管腔结构清晰，第4天可观察到出芽结构。第7天时观察到成熟的肠类器官。对培养7天的三维肠类器官进行免疫染色，结果显示存在多种细胞谱系。

E-钙黏蛋白蛋白定位于黏附连接处。类肠体对肠内分泌细胞和产生溶菌酶的潘氏细胞呈阳性。在不到一周的培养时间内观察到融合的二维单层细胞。

首先，从培养箱中取出含有二维牛回肠类器官单层的Transwell培养板。将培养板置于生物安全柜中，于室温下平衡数分钟。按照制造商说明，确保STX2电极已完成预处理，并将伏欧表校准至1,000欧姆。

将探针的较长端插入Transwell上皮细胞培养的基底侧室，较短端插入顶侧室。待装置稳定后，对每个Transwell小室进行三次跨上皮电阻测量，包括无细胞的小室。计算每个小室测量值的平均值。

用实验孔的平均测量值减去空白孔的平均测量值，然后乘以小室的表面积，以确定上皮屏障的电阻。在培养不到一周的时间内即可观察到融合的二维单层细胞。经上皮电阻（TEER）测量显示，数值在七天内持续上升，随后在第12天开始下降。

染色后的二维单层细胞共聚焦显微镜图像显示了DAPI细胞核染色、E-钙黏蛋白以及F-肌动蛋白染色的定位。细胞呈现出分化特征，包含肠内分泌细胞、潘氏细胞和肠上皮细胞谱系。对单层细胞的顶端刺激可导致细胞因子产生增加。