Name: 生成用于转化生物医学研究的牛原代肠源二维单层培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习建立牛原代肠源二维单层培养系统，用于研究胃肠道组织生理与病理机制。该模型支持免疫细胞共培养，可稳定形成紧密上皮屏障，为转化医学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢中西部大学细胞与分子核心设施的使用支持。&#160;本研究由美国农业部国家食品与农业研究所研究项目（动物健康与生产及动物产品：动物健康与疾病，项目编号1025812）资助。本出版物中所述的研究发现和结论尚未由美国农业部正式发布，不应被解释为代表该机构的任何决定或政策。

所有实验方案均遵循机构和国家关于动物福利的指南和法规。
1. 试剂准备
注意：本研究中所用试剂的储备浓度和终浓度列于表1中。
<ol>
	<li>准备样本收集缓冲液：将 1 L 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）与青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、两性霉素 B（25 µg/mL）和卡泊芬净（2.5 µg/mL）混合。将储备液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备解离试剂 #1：将 18.55 mL 样本收集缓冲液（如步骤 1.1 所述）、1.422 mL 乙二胺四乙酸（EDTA，0.422 M/pH 7.4）、20 µL 1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）溶液和 4 µL Y-27632 溶液（5000 倍稀释液/50 mM）混合。将溶液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备解离试剂 #2：将 18.57 mL 收集缓冲液（如步骤 1.1 所述）、1.422 mL EDTA（0.422 M/pH 7.4）和 4 µL Y-27632 溶液（5000 倍稀释液/50 mM）混合。将溶液储存于 37 °C。</li>
	<li>准备肠类器官生长培养基储备液：将 9.875 mL 添加补充剂的类器官生长培养基、100 µL 青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、5 µL 庆大霉素（25 µg/mL）和 20 µL 卡泊芬净（2.5 µg/mL）混合。将溶液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备肠类器官分化培养基储备液：将 10 mL 添加补充剂的类器官分化培养基、100 µL 青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、5 µL 庆大霉素（25 µg/mL）和 20 µL 卡泊芬净（2.5 µg/mL）混合。将溶液储存于 -20 °C。</li>
	<li>准备洗涤培养基：将 48.45 mL DMEM/F-12 1.1 培养基（含 L-谷氨酰胺，不含 HEPES）、1 mL 不含维生素 A 的 B-27 补充剂（50 倍浓缩液）、500 µL 青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、25 µL 庆大霉素（50 mg/mL 储备液）和 25 µL 卡泊芬净（5 mg/mL 储备液）混合。将溶液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备包被缓冲液：将 25 mL 不含抑制剂的 DMEM:F12 完全培养基与 25 mg 牛血清白蛋白（BSA）混合。将溶液储存于 4 °C。</li>
</ol>
2. 从完整组织中分离肠隐窝（图1）
注意：牛小肠类器官由来自当地肉牛加工企业健康成年荷斯坦阉牛（&#62;2岁）的回肠组织制备而成。本系列实验使用了一头供体动物。
<ol>
	<li>肠道组织样本的制备
	<ol>
		<li>将收获的约10英寸（25 cm）长的肠道组织样本置于约400 mL冰冷的收集缓冲液（PBS+抗生素/抗真菌剂）中，并在冰上保存，运送到实验室。</li>
		<li>使用手术剪刀（例如Mayo剪刀）和镊子（例如Adson镊子），去除肠道组织样本上的多余脂肪和肠系膜。</li>
		<li>将组织切成两个相等的部分。</li>
		<li>用手术剪刀纵向剪开组织，并用无菌PBS冲洗组织。</li>
		<li>使用无菌玻璃显微镜载玻片的边缘轻轻去除肠道样本的黏液层，并用新鲜PBS冲洗组织。 
		注意：此步骤有助于去除绒毛，提高后续步骤中隐窝组分的纯度。</li>
		<li>对于每段5英寸（13 cm）的组织，先将其切成两段2.5英寸（6.5 cm）的片段，再将每段进一步切成约4个大小相近的小块，以促进组织解离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠道组织的解离
	<ol>
		<li>在无菌50 mL锥形管中准备20 mL组织解离试剂#1，并将小块组织样本加入该锥形管中，直至体积排开使液面从20 mL刻度上升至35 mL刻度。</li>
		<li>对剩余的小肠组织样本片段重复上述步骤。</li>
		<li>用封口膜密封锥形管，并手动轻轻振荡10次。 
		注意：在整个实验过程中，手动振荡应有意识地进行，但动作需轻柔。</li>
		<li>将锥形管水平放置于装有冰的容器中，并置于轨道摇床上。</li>
		<li>在冰上以80转/分钟（rpm）的速度振荡30分钟，每隔10分钟手动振荡一次锥形管。</li>
		<li>在另一50 mL锥形管中准备20 mL预热（37 °C）的组织解离试剂#2（配制方法同上，但不含DTT）。将含有解离试剂#1的锥形管中的组织样本转移至含有解离试剂#2的锥形管中。</li>
		<li>用封口膜密封锥形管，并手动振荡10次。</li>
		<li>将锥形管放入预热（37 °C）的摇床水浴中，倾斜约60°角，以150 rpm振荡10分钟，在5分钟和10分钟孵育结束时各手动振荡一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>隐窝片段的分离
	<ol>
		<li>标记10个无菌锥形管，编号为#1至#10。向每个标记好的锥形管中加入20 mL无菌冰冷PBS。</li>
		<li>将含有解离试剂#2的锥形管中的组织片段转移至一个新的无菌50 mL锥形管中，该管内含有冰冷PBS #1。</li>
		<li>手动振荡锥形管10次。</li>
		<li>用封口膜密封锥形管并水平置于冰上。在轨道摇床上以80 rpm振荡10分钟。10分钟后，手动振荡锥形管#1共10次。此为第一次洗涤（Wash #1）。</li>
		<li>使用手术镊子轻轻将组织样本转移至锥形管#2中。</li>
		<li>重复步骤2.3.2–2.3.4，此为第二次洗涤（Wash #2）。</li>
		<li>重复洗涤操作，直至完成第10次洗涤（Wash #10）。</li>
		<li>每次洗涤后的上清液中含有可用于类肠体生成的隐窝。将含有上清液的试管在4 °C保存，直至完成全部10次洗涤。</li>
		<li>完成第10次洗涤并弃去组织残渣后，将锥形管#6–#10的上清液在4 °C条件下以400 × g离心2分钟，以沉淀分离出的隐窝。 
		注意：第6–10次洗涤的上清液含有最纯净的完整隐窝组分，碎片和单细胞较少。因此，建议仅使用这些组分进行类肠体培养，而前几次洗涤（#2–#5）的上清液应弃去。</li>
		<li>弃去上清液，向沉淀的隐窝中加入4 mL新鲜冰冷PBS，不要重悬（此操作有助于保持隐窝片段完整，直至显微镜观察）。</li>
		<li>通过显微镜评估锥形管#6–#10中解离隐窝的纯度。
		<ol>
			<li>向384孔板中每孔加入50 µL PBS。</li>
			<li>向PBS中加入10 µL隐窝悬液，使用40倍物镜观察隐窝的纯度、完整性并进行计数。 
			注意：在孔板底部画一个十字有助于计数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 离体 牛回肠类器官的生成与传代图2)
注意：将使用锥形管中纯度最高、结构完整的肠隐窝进行后续检测。在涉及隐窝和肠类器官的所有操作步骤中，移液枪头、细胞刮刀和试管必须预先用包被缓冲液处理，且应避免产生气泡，以防止隐窝损失。除非另有说明，应使用1000 µL移液枪头，以避免破坏隐窝碎片。
<ol>
	<li>从隐窝片段生成类肠体
	<ol>
		<li>将最纯净的隐窝组分（通常为第6–10组）合并至一个锥形管中。</li>
		<li>在4 °C条件下，以400 × g离心含有隐窝的锥形管2分钟。</li>
		<li>用移液器吸弃上清液，并将隐窝沉淀重悬于洗涤培养基中。</li>
		<li>按步骤3.1.2进行离心，倾去上清液后向隐窝沉淀中加入2 mL洗涤培养基。</li>
		<li>按步骤2.3.11.1所述方法计数隐窝数量。</li>
		<li>按步骤3.1.2条件离心以收集隐窝沉淀，弃去上清液，将沉淀重悬于冰上预冷的100%低生长因子基底膜细胞外基质（BME）中，使隐窝浓度约为400个/100 µL。 
		注：BME需在4 °C条件下充分解冻，温度变化会影响其黏稠度。可使用冷却块和预冷的移液器吸头防止BME过早凝固。
		<ol>
			<li>若使用其他类型的基底膜基质，在制备凝胶滴时可能需要对BME进行稀释。请参考所用BME产品的制造商说明书。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>上下吹打，使隐窝在BME中充分悬浮。</li>
		<li>在设定为37 °C的加热板上，将50 µL隐窝-BME悬液缓慢滴加至6孔组织培养板中，每孔最多可加8个凝胶滴。 
		注：6孔板必须在接种前于37 °C培养箱中预热过夜。</li>
		<li>将6孔板置于加热板上保持1分钟，然后小心转移至37 °C、5% CO2培养箱中。</li>
		<li>2分钟后，将6孔板&#160;翻转，使盖子朝下，继续孵育30分钟，以使凝胶滴充分聚合。</li>
		<li>30分钟后，小心向含凝胶滴的孔中加入3 mL室温（RT）类肠体生长培养基，培养基中需添加10 µM SB202190、0.5 µM LY2157299和10 µM Y-27632。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
		<li>每2–3天更换一次培养基，使用含抑制剂的新鲜类肠体生长培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类肠体传代
	<ol>
		<li>培养7–10天后，确认隐窝已形成具有多个出芽结构的三维类肠体（如图2E所示），即可进行传代。</li>
		<li>弃去含凝胶滴孔中的培养基。</li>
		<li>每孔含4个凝胶滴时，向每孔加入1 mL冰上预冷的非酶细胞解离液，并添加10 µM Y-27632。</li>
		<li>使用预包被的细胞刮刀，轻轻将凝胶滴从组织培养板上刮下。</li>
		<li>将类肠体收集至15 mL锥形管中，上下吹打10次进行重悬。</li>
		<li>将含有破碎类肠体的锥形管置于室温下，以80 rpm在旋转摇床上孵育10分钟。</li>
		<li>向类肠体中加入10 mL冰上预冷的洗涤培养基（含10 µM Y-27632）。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL新鲜洗涤培养基中，并转移至新的15 mL锥形管。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL类肠体生长培养基中，置于1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将类肠体沉淀重悬于冰上预冷的100% BME中，并继续执行步骤3.1.6–3.1.13。</li>
		<li>每7天进行一次类肠体再传代。扩增时间可能因密度、活力及出芽数量而异。当出现多个出芽结构并形成较大类肠体时，表明需要进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类肠体的冷冻保存
	<ol>
		<li>进行冷冻保存时，确保类肠体在培养中传代不超过五次。 
		注：此建议尚未经过实验验证，而是基于作者观察到后期传代的类肠体活力下降且实验结果不稳定。</li>
		<li>收获类肠体时，使用步骤3.2.2–3.2.9中所述的解离缓冲液。 
		注：使用5 mL移液器对类肠体进行机械性解离。</li>
		<li>按步骤2.3.11.1所述方法计数类肠体片段数量。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心锥形管5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将类肠体片段重悬于含10 µM Y-27632的冷冻保存培养基中，调整浓度至约2000个类肠体片段/mL，并分装1 mL至预先标记的冻存管中。</li>
		<li>将冻存管放入程序降温盒中，于-80 °C过夜保存。</li>
		<li>次日将冻存管转移至液氮气相中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠隐窝片段的复苏
	<ol>
		<li>将6孔板提前一夜放入培养箱中预热。</li>
		<li>用5 mL包被培养基预包被一个5 mL离心管。</li>
		<li>从液氮储存中取出冻存管。</li>
		<li>一旦解冻，立即把隐窝从冻存管转移至预包被的5 mL离心管中。用洗涤培养基冲洗冻存管，并将冲洗液加入5 mL离心管中。避免产生气泡。</li>
		<li>用洗涤培养基补足体积至5 mL，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>离心过程中，用包被培养基预包被一个1.5 mL离心管。</li>
		<li>离心结束后，倾去上清液，将沉淀用管中残留的液体重悬，转移至预包被的1.5 mL离心管中。用洗涤培养基冲洗原5 mL离心管，并将冲洗液一并转移至1.5 mL离心管中。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>用类肠体生长培养基补足体积至1.5 mL。</li>
		<li>按上述条件（步骤3.4.7）再次离心，并小心吸弃上清液。</li>
		<li>将BME从4 °C取出，置于冰或冰块上。</li>
		<li>将类肠体沉淀重悬于冰上预冷的100% BME中，并继续执行步骤3.1.6–3.1.12。</li>
		<li>每2–3天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 由三维肠类器官生成并评估二维单层细胞
注意：同上，所有涉及隐窝和肠类器官的步骤中，移液器吸头、细胞刮刀和试管均应预先用包被缓冲液进行包被，操作过程中应避免产生气泡，以防止隐窝丢失。
<ol>
	<li>用于二维单层细胞形成的 transwell 小室的制备
	<ol>
		<li>将小室插入24孔细胞培养板中&#160;培养适配板和&#160;预先包被1 µm PET的顶端面&#160;24孔细胞培养小室中加入100 µL在类肠器官生长培养基中按1:15稀释的BME。进行屏障完整性检测时，务必额外包被一个用作对照的小室。</li>
		<li>将包被好的小室放入24孔组织培养适配板中，并置于培养箱内。 
		注意：Transwell 小室必须使用特定的适配器或配套的组织培养板。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育培养小室2 孵育1小时以使聚合反应进行。 
		注意：若不立即使用，BME包被的transwell小室可用封口膜密封，并于4 °C保存最多1周。</li>
		<li>孵育结束时，吸除三维肠类器官培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维肠类器官的解离
	<ol>
		<li>从冻存的类肠体片段中生成二维类肠体单层细胞，这些片段已按照上文3.1节所述方法复苏、接种并培养形成三维类肠体。将解冻后的类肠体至少传代两次，最后一次传代后需培养至少5天，再进行处理以生成二维单层培养物。</li>
		<li>通过向类肠体穹顶中加入含10 µM Y-27632的冰洗液培养基来收获类肠体（每4个穹顶使用约1 mL解离缓冲液）</li>
		<li>用细胞刮刀将类器官刮下，并收集至15 mL锥形管中。</li>
		<li>使用1 mL移液枪头吹打30次，以产生类肠体碎片。</li>
		<li>用200 µL移液器吸头吹打40次，以进一步分散类肠体碎片。</li>
		<li>将含有类肠体片段的15 mL离心管用预冷的洗涤培养基定容至10 mL。</li>
		<li>将锥形管以 300 x g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，包括BME层，注意不要扰动肠类器官沉淀。 
		注意：BME 层将呈现为紧邻沉淀物上方的一层浑浊的胶状层。</li>
		<li>每4个类胚体，用1 mL预热的含10 µM Y-27632的TrypLE Express酶重悬沉淀。</li>
		<li>将类肠器官-TrypLE混合物加入24孔板中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 10 分钟。</li>
		<li>孵育10分钟后，使用1 mL移液器将类肠体-TrypLE混合物吹打40次，以进一步破碎类肠体。</li>
		<li>然后，使用 200 µL 移液器将组织碎片吹打 40 次，以将其解离为单细胞。</li>
		<li>使用带有无菌22号针头的3 mL或5 mL注射器，将细胞悬液反复吹打4次，以获得单细胞悬液。</li>
		<li>按照步骤2.3.11.1中所述，通过显微镜监测细胞解离情况，直至80%的肠类器官被解离为单个细胞。</li>
		<li>将细胞悬液收集至15 mL锥形管中，加入4倍体积含10% FBS的洗涤培养基以终止酶反应。</li>
		<li>将类肠体通过预包被的40 µm细胞滤网过滤两次，收集至50 mL锥形管中。</li>
		<li>通过在300 x g下离心锥形管，使单细胞沉淀 g 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transwell 小室中的二维单层细胞接种。
	<ol>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于少量（约600 µL）添加了20%胎牛血清（FBS）的类器官生长培养基中，室温下进行。</li>
		<li>使用台盼蓝染色排除法、血细胞计数板或自动细胞计数仪测定类肠体细胞密度和活力。预期平均活力为75%。</li>
		<li>在接种细胞前，小心移除步骤1.3中施加到细胞培养小室上的多余包被液。</li>
		<li>将单细胞以1 × 10⁵的密度接种5 在预包被的细胞培养小室的顶端表面，每孔以200 µL体积接种细胞。</li>
		<li>向细胞培养小室的基底侧加入700 µL含20% FBS的完全培养基。</li>
		<li>以数字“8”字形移动培养板10次，使细胞在小室中均匀分布。</li>
		<li>在生物安全柜中将培养板置于板式加热器上保温10分钟。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育培养板2.</li>
		<li>48小时后，将顶腔和基底腔中的培养基更换为新鲜的类肠器官生长培养基，该培养基需添加20%胎牛血清（FBS）和抑制剂。</li>
		<li>第三天，移除顶端和基底外侧区室中的培养基，用1×PBS小心清洗小室，并更换为仅添加抑制剂的类肠器官分化培养基。</li>
		<li>每隔2-3天更换两个隔室中的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>上皮屏障完整性和单层细胞融合度的定量测量 
	注意：可使用上皮细胞伏特计测量跨上皮电阻（TEER）以评估屏障完整性。
	<ol>
		<li>从培养箱中取出Transwell培养板，置于生物安全柜中，室温平衡数分钟。</li>
		<li>确保STX2电极已根据制造商说明进行预处理，并将伏特欧姆表校准至1000Ω。</li>
		<li>将探针的长端插入Transwell上皮细胞培养装置的基底外侧室，短端插入顶室。注意避免破坏单层细胞或损伤插入物。</li>
		<li>待状态稳定后，对每个Transwell小室进行3次TEER测量，包括无细胞的小室。对每个小室的测量值取平均值。</li>
		<li>通过减去空白对照的平均测量值来计算校正后的 TEER 值&#160;良好&#160;从实验孔的平均测量值计算，然后乘以小室的表面积，以确定上皮屏障的电阻（TEER [Ω·cm²]）2] = [Rcell 层 - Rblank] × 面积)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Establishment of a 2D Monolayer from 3D Bovine Ileal Enteroid Culture

<ol><li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReza+Khorramizadeh%2C+M+%22Animal+Biotechnology%22">Animal Biotechnology</a>. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).</li>
<li>Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+use+of+animal+models+to+advance+scientific+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Innovative use of animal models to advance scientific research.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).</li>
<li>Hamernik, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farm+animals+are+important+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Farm animals are important biomedical models.</a> Animal Frontiers. 9 (3), (2019).</li>
<li>Ribitsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%3A+To+do+or+not+to+do%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972(2020).</li>
<li>Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+model+systems+and+tools+for+basic+and+translational+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology.</a> Genome Medicine. 10 (1), 73(2018).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Roth, J. A., Tuggle, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Livestock+models+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Livestock models in translational medicine.</a> ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+bovine+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the bovine immune response.</a> Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).</li>
<li>Potter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immune+system+of+the+gastrointestinal+tract%3A+maintaining+balance+between+the+good+and+the+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+Study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D-+and+3D-based+intestinal+stem+cell+cultures+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine.</a> Cells. 7 (12), 225(2018).</li>
<li>Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+-+New+models+for+host-helminth+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Organoids - New models for host-helminth interactions.</a> Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).</li>
<li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 43(2021).</li>
<li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54(2018).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+three-dimensional+%283D%29+expansion+of+bovine+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115(2021).</li>
<li>Töpfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+colon+organoids%3A+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical%2C+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42(2005).</li>
<li>Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-vitro+model+for+studying+the+interaction+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+other+enteropathogens+with+bovine+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment%3A+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).</li>
<li>Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cattle+breed+and+basal+diet+on+digestibility%2C+rumen+bacterial+communities%2C+and+eating+and+rumination+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity.</a> Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114(2020).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本文介绍了一种用于研究肠道生理学和肠道疾病的、具有生理相关性的模型。已有多个研究团队描述了牛肠类器官培养体系的建立，包括二维单层培养16,19,20,21,22,23,24。尽管单层培养在技术上并不明显困难，但其中若干分钟内的操作步骤对于稳定建立成功的培养体系至关重要。因此，对于类器官研究领域的新手研究人员而言，仅依据已发表文献中简要描述的方法来重复二维单层培养可能具有挑战性。本文所述方案在上述方案及其他物种相关方案的基础上进行了优化，提供了在Transwell小室上建立单层培养的逐步操作指南，具有高度可重复性。
本方案可根据实验设计的具体目标或试剂的可获得性进行简便调整。事实上，根据其他文献所述24，按照本方案操作，即使以较低的细胞密度（例如 2.5 × 104）接种单层细胞，或在无胎牛血清（FBS）条件下培养，也能成功建立培养体系。然而，改变这些参数可能需要延长培养时间，以形成融合单层。因此，若实验设计中的其他关键因素（如与免疫细胞共培养）要求特定的实验时间进程，则可按需调整接种密度。尽管可用于生成三维肠类器官和二维单层细胞的其他基底膜制剂可替代本方案中所使用的制剂，但需进行一定优化，以确定基底膜与培养基的最佳比例。
在所述方法中使用Transwell小室相较于在传统塑料器皿上进行单层培养以及三维肠类器官培养具有诸多优势。与标准组织培养板相比，使用Transwell进行单层培养可促进细胞分化和有序排列，使其结构更接近肠道隐窝14,25。肠上皮屏障在阻止毒素和微生物向体内易位的同时促进营养物质吸收，具有至关重要的作用。因此，理解肠道屏障完整性在健康状态下的功能，以及在肠道疾病期间或对化合物暴露后的变化，显得尤为关键。与三维肠类器官培养不同，将Transwell上的单层细胞与跨上皮电阻（TEER）测量相结合，可实现对肠道屏障完整性的客观评估，如本文所示14,25。在Transwell上构建二维单层细胞还允许与免疫细胞或间质细胞等相关细胞类型进行共培养，从而能够表征肠细胞与组织微环境中其他细胞之间的关键相互作用，而这是三维培养无法实现的。暴露单层细胞的顶膜面不仅便于对病原体和化合物进行实验处理并收集管腔产物，还可用于研究肠道生理学和疾病的其他方面，包括肠道微生物群以及分子吸收或转运生理学的研究13。对单层细胞顶膜面和基底膜面进行独立调控，是Transwell模型相较于三维肠类器官模型的显著优势。
经过多次预实验，我们确定了对本方案成功至关重要的几个关键步骤。虽然完整的肠组织样本可在4°C下冷藏过夜并于次日处理，但组织解离和隐窝片段的分离步骤必须尽快进行，以防止分离出的隐窝组分发生解体。完成PBS洗涤后，将隐窝在洗涤液中离心有助于防止隐窝破裂，具体操作详见步骤2.3.10。在传代类肠体或收获类肠体用于单层培养时，必须将类肠体从基底膜提取物（BME）凝胶圆顶中充分分离。洗涤液必须保持冰冻状态，以促进BME的溶解。相反，使用预热的TrypLE并对接种的细胞悬液进行两次过滤，有助于获得形成单层所需的单细胞。最后，手动以“8”字形轻轻晃动培养板，可帮助单细胞在Transwell小室中均匀分布。
本方案的一个重要局限性在于，二维单层细胞是由来自一头成年荷斯坦公牛（&#62;2岁）的肠类器官储备系所生成的。由于犊牛的胃肠道处于发育成熟阶段，可能需要对本方案进行轻微调整，才能获得最佳结果。文献中已报道不同牛品种在肠道生理上存在品种特异性差异26。尽管目前尚不清楚这些差异是否会影响肠类器官及其后续单层细胞的生成，但我们推测即使存在影响，也仅需对本方案进行微小修改即可。此外，二维培养模型本身存在一些固有缺点。与三维肠类器官模型相比，二维培养可能缺乏部分肠道组织结构和细胞多样性，并在二维培养的扩增过程中带来一定的限制和挑战13。然而，已有研究证明某些单层细胞能够模拟预期的隐窝结构组织27，并且通过建立气液界面的二维培养体系，部分局限性甚至可能得以克服。尽管如此，在应用该模型前，仍应充分考虑其局限性，以判断其是否适用于拟研究的科学问题。
本方案描述了一种优化的培养系统，该系统利用牛回肠来源的肠类器官在Transwell小室上形成单层细胞，以模拟牛的胃肠道。该高通量培养系统具有广泛的应用前景，从传染病研究到药物发现及再生医学领域均有涉及，有望前所未有地推动对动物和人类健康均有益的预防和治疗策略的开发。

动物模型在研究中发挥着关键作用，有助于加深我们对疾病病理生理学以及感染过程中宿主免疫反应动态变化的理解，并支持新型预防和治疗策略的开发1,2,3,4这些模型支持动物研究中的科学发现与进步，对人类健康研究的发展至关重要。数十年来，啮齿类动物模型一直是人类疾病免疫机制和基础生物学研究进展的基石。3,5,6,7尽管啮齿类动物模型在筛选和早期研发研究中至关重要，但大型动物模型在人类疾病研究中提供了更相关的比较，适用于早期发现和后期开发研究，包括治疗有效性和安全性测试1,3,4,5与啮齿类动物模型相比，家畜模型在某些疾病（包括隐孢子虫病、沙门氏菌病、结核病、呼吸道合胞病毒和布鲁氏菌病）向人类应用的更高效转化方面具有明显优势1,7,8事实上，这些疾病以及其他一些疾病会在牛体内自发产生，而牛在疾病发病机制和免疫过程方面与人类具有多个相似之处。作为远交群体，牛能够模拟影响人类免疫反应的遗传和环境异质性。5,8,9,10通过首先采用复杂的培养系统，然后实施相关策略，可将牛模型在传染病研究中的优势最大化 体内 逐步开展研究。最初使用高度复杂的牛源性培养系统可显著减少活体动物实验的数量，同时提高转化研究和应用研究成功的可能性。培养模型应在器官水平上重现疾病过程，以实现最佳的预测有效性，并在空间和功能上保留天然组织微环境。
黏膜免疫反应是一个多层面的系统，由胃肠道上皮细胞形成的高效屏障以及位于黏膜表面下方的多种免疫细胞群体共同构成11。这一高度复杂的系统在感染过程中对维持胃肠道稳态以及启动针对肠道病原体的免疫防御至关重要11。肠上皮细胞与下方固有免疫细胞之间的相互作用，可启动针对致病微生物的保护性免疫应答。因此，为深入研究宿主与肠道病原体之间的相互作用，需要具有相似复杂程度的培养系统，这类系统在理解肠道生理学以及药物发现与开发方面也极为有效12,13。类器官是一种稳定的培养系统，能够模拟来源组织的结构与功能14,15。这些模型的多细胞性使其可用于研究多种细胞群体在肠道健康与疾病中的作用及其细胞间相互作用12,14。然而，目前人类来源的类器官模型在研究中受到限制，主要由于难以获得足量且质量稳定的原代人肠上皮细胞，且细胞在培养中的存活率有限。永生化细胞系虽可稳定获得大量同质性培养物，但转化细胞本身缺乏非转化上皮细胞所具有的多样性与功能复杂性16,17。使用牛源组织建立培养模型来研究胃肠道疾病与生理学的优势在于：可从健康供体稳定获取组织样本，细胞存活率更高，并且仅在非永生化组织中才能实现更丰富的细胞多样性。比较性组织转录组学及肠道类器官的特征分析显示，人类与牛在保守的直系同源基因及细胞潜能方面具有相似性18。因此，牛源类器官培养系统在研究人类肠道疾病方面可能具有优势，其研究成果可更便捷地转化为人类医学应用 
本文所述方案详细介绍了一种利用牛源肠类器官衍生的二维原代细胞培养系统，用于评估宿主对肠道病原体或化合物的反应以及肠道生理功能的有效平台。与三维类器官不同，该系统在transwell小室上构建的二维培养模型可实现肠道细胞与免疫细胞或间质细胞的共培养，从而研究组织水平的动态相互作用。此模型具有生理相关性，在生物医学研究、药物开发和功效测试中具有广泛应用，有助于促进牛群及人类的健康与进步。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 吸头&amp;nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-S</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m PET 24孔细胞培养插件&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>353104</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-1250RK-S</td><td></td></tr><tr><td>22 G针头</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m细胞滤筛&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>30075307</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309647</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白-18（C-04）</td><td>Abcam</td><td>AB668-1001</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12-587-010</td><td></td></tr><tr><td>Belysa 软件</td><td>Luminex</td><td>40-122</td><td>免疫测定曲线拟合软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher 生物试剂</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>醋酸卡泊芬净</td><td>Selleckchem</td><td>S3073</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>嗜铬粒蛋白A (E-5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271738</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-C</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>海王科学</td><td>3471.X</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Ultimatrix RGF BME&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BME001-05</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 1.1 培养基（含 L-谷氨酰胺，不含 HEPES）</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.01</td><td></td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白&amp;nbsp;</td><td>细胞信号技术公司</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>康宁</td><td>MT35070CV</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-07</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 555&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult 类器官分化培养基（人源）</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0214</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult 类器官生长培养基（人源）</td><td>StemCell Technologies</td><td>0-6010</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700&amp;nbsp;</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299（Galunisertib）</td><td>Selleckchem</td><td>S2230</td><td></td></tr><tr><td>MAGPIX 系统</td><td>Luminex</td><td>Magpix 系统</td><td>紧凑型复用单元</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX 牛细胞因子/趋化因子磁珠检测面板</td><td>MilliporeSigma</td><td>BCYT1-33K</td><td>基于微球的多重检测法&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>非酶细胞解离液&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2103</td><td></td></tr><tr><td>NutriFreeze D10 冷冻保存培养基&amp;nbsp;</td><td>生物工业公司</td><td>05-713-1B</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床平台</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88880021</td><td></td></tr><tr><td>Pam3Csk4</td><td>invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>dot scientific inc.</td><td>#HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-FITC&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5782/12U</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass 抗荧光淬灭剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>兔抗人溶菌酶（EC3.2.1.17）</td><td>安捷伦科技</td><td>A009902-2</td><td></td></tr><tr><td>SB202190（FHPI）</td><td>Selleckchem</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MaxQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>VWR</td><td>BDH7465-2</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Teknova</td><td>S6525</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染料&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express 酶&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr><tr><td>伏特欧姆表&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Millicell ERS-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

类器官细胞培养系统能够重现组织中观察到的复杂性，因此在研究宿主-病原体相互作用、评估药物有效性和毒性以及组织生物工程方面具有重要价值。然而，由于这些模型具有三维（3D）结构特性，其在上述应用中可能受到限制。例如，利用3D肠类器官培养系统研究消化系统疾病时，因肠腔及其分泌物质难以接触而面临挑战。事实上，对3D类器官进行病原体刺激通常需要通过腔内显微注射、机械破坏3D结构或构建顶膜外翻型肠类器官来实现。此外，这些类器官难以与免疫细胞和间质细胞共培养，从而限制了对病理生理动态过程的深入机制分析。为克服这些问题，我们优化了一种基于牛原代细胞的二维（2D）肠类器官衍生单层培养系统，可实现与其他相关细胞类型的共培养。从健康成年牛分离的回肠隐窝细胞被用于生成3D类器官，并可冷冻保存以供后续使用。将复苏后的3D肠类器官经传代并解离为单细胞，接种于基底膜提取物包被的Transwell细胞培养小室上，从而形成暴露顶膜表面的2D单层结构。通过免疫荧光显微镜观察及跨上皮电阻测量，对肠单层细胞的极性、细胞分化状态和屏障功能进行了表征。对单层顶膜表面进行刺激后，可在顶膜和基底两侧均检测到细胞因子的分泌，表明该单层具备预期的功能活性。所述的2D肠类器官衍生单层模型在研究宿主-病原体相互作用和肠道生理学、药物开发以及再生医学领域具有广阔的应用前景。

生成二维肠类器官衍生单层细胞的第一步是准备收获的肠组织片段（图1A），以便进行组织解离。首先去除组织上附着的脂肪和肠系膜（图1B），然后沿纵向切开组织以暴露肠腔表面，再用玻璃载玻片轻轻刮除肠道的黏液层。将收获的肠段进一步切割成更小的组织块（图1C），以提高解离效率。随后通过一系列含有螯合缓冲液（图1D、E）和PBS的洗涤步骤，将隐窝从下方的黏膜下层组织中解离出来。分离得到的肠隐窝（图1F）被包埋于基底膜基质的小滴中形成穹顶状结构（图2A），并在培养数天后形成三维肠类器官。从一段10英寸的牛回肠组织中，大约可分离出90万个隐窝用于类器官形成。接种后仅数小时，隐窝即开始伸长并发育为肠球状结构（图2B）。培养2天后可观察到清晰的腔体结构（图2C），并在第4天左右出现出芽样结构（图2D）。至第7天，成熟的肠类器官已形成（图2E）。对培养7天的三维肠类器官进行免疫荧光染色显示存在多种细胞谱系。共聚焦显微镜图像（图3）显示DAPI核染色、黏附连接处的E-钙黏蛋白（E-cadherin）、显示内分泌细胞存在的嗜铬粒蛋白A（Chr-A）、显示潘氏细胞的溶菌酶（LYZ），以及代表肠上皮吸收细胞的细胞角蛋白18（CK-18）。在培养7–10天后，应传代肠类器官以促进进一步扩增并防止过度拥挤。最佳传代时间确定为初次原代隐窝分离后的7–10天，具体时间最终取决于类器官在培养中的健康状况和生长速度。为获得理想的类器官形态和存活率（如图2E所示），推荐的接种密度为每个穹顶400个隐窝。肠类器官易于冷冻保存，冻存后的类器官片段在解冻后经过两次传代即可完全恢复，可用于后续实验。值得注意的是，在进行冷冻保存前，建议至少对原代隐窝培养物进行两次传代。
为了制备二维肠类器官来源的单层细胞，需收获三维肠类器官，并通过一系列步骤，在解离溶液存在下进行机械吹打（图4A），使其解离为单个细胞。随后可将这些单细胞接种于已预先包被基底膜基质-培养基溶液的Transwell小室中。平均而言，四个三维肠类器官穹顶可接种四个Transwell小室。因此，所处理的三维肠类器官数量取决于实验所需的Transwell小室数量。以1 × 105的接种密度接种单细胞，并在含20%胎牛血清（FBS）的条件下进行初始培养（图4B-D），可在不到1周的时间内形成融合的单层细胞。可通过光学显微镜随时间观察二维单层细胞在培养过程中的逐步融合情况（图4E，F）。跨上皮电阻（TEER）测量可用于确认细胞融合状态，并表征上皮屏障完整性的动态变化以及对实验刺激的响应（图5A）。通常情况下，培养7天后，接近100%融合的单层细胞对应的TEER值约为1500 Ω·cm2。对二维肠类器官单层细胞TEER值的纵向评估显示，TEER值在7天内持续上升，平均最大值达到1546 Ω·cm2，随后开始下降，至第12天时最低值为11.5 Ω·cm2（图5B）。对已分化单层细胞进行免疫荧光标记表明，采用本方案可形成完整、有序且具有极性的肠上皮细胞层（图6）。对染色后的二维单层细胞进行共聚焦显微镜观察，可见DAPI核染色、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和F-肌动蛋白（F-actin）的定位（图6A-D）。二维单层细胞的荧光显微镜图像显示其具备分化肠上皮细胞的典型特征：嗜铬粒蛋白A（Chr-A）染色显示肠内分泌细胞的存在，溶菌酶（LYZ）染色显示潘氏细胞，细胞角蛋白18（CK-18）染色则提示肠上皮吸收细胞谱系（图6E-L）。Z轴层扫建模显示二维单层细胞培养具有预期的极性结构：F-肌动蛋白特征性地沉积于分化肠上皮细胞顶面微绒毛区域，而E-钙黏蛋白作为一种位于上皮细胞间黏附连接处的蛋白，也呈现出规律分布（图6M）。
可通过从顶端加入不同组分（包括Toll样受体（TLR）配体或病原体）对单层细胞进行刺激，随后定量分析从顶端和基底室收集的细胞培养上清液中的细胞因子，以评估单层细胞的功能。事实上，当在培养第4天使用TLR 1/2激动剂Pam3csk4对单层细胞顶端进行24小时刺激后，与未处理的单层细胞相比，两个室中均观察到细胞因子产生的增加（图7A、B）。
<img alt="组织处理与隐窝解离示意图：牛回肠、去脂组织、隐窝片段结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从健康成年牛中分离肠道隐窝。 图像展示组织处理过程：（A）完整的成年牛回肠，（B）去脂回肠，（C）将回肠在冰上磷酸盐缓冲液（PBS）中切成2.5英寸（6.3 cm）长的片段，（D）回肠组织片段置于解离缓冲液#1中，4 °C孵育，（E）在37 °C摇床水浴中置于解离缓冲液2中，以及（F）分离得到的回肠隐窝片段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="7天内类器官的3D发育，显微镜图像，类肠器官在穹顶中接种，细胞生长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：牛原代3D回肠类肠器官在基底膜基质中的发育。 代表性图像显示（A）在6孔组织培养板中形成的3D类肠器官穹顶，以及（B-E）培养第0、2、4和7天的3D类肠器官发育情况。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三维肠道类器官免疫荧光染色，显示细胞核、F-actin、CK-18、E-cad及合并图像示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：三维肠道类器官显示上皮细胞谱系染色结果。 培养7天后的三维类器官代表性图像显示细胞核染色、F-actin、细胞角蛋白-18（CK-18）、嗜铬粒蛋白A（Chr-A）、E-钙黏蛋白（E-cad）、溶菌酶（Lyz）以及图像叠加（Merge）结果。比例尺为50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="二维单层培养物生成、显微镜图像；细胞密度变化、实验结果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：由回肠类器官建立二维类器官来源单层培养物。 代表性图像显示：(A) 类器官解离液中准备接种单层培养的三维类器官片段；在Transwell小室上以1 × 105的接种密度接种单个细胞后，于第0天分别使用(B) 明场、(C) 相差和(D) 亮场显微镜成像；以及在第5天于Transwell小室上形成的单层细胞，分别使用(E) 相差和(F) 亮场显微镜成像。放大倍数为40倍，比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="2D 肠类器官单层培养物的跨上皮电阻测量示意图；图表显示 12 天内的 TEER 值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：跨孔插入物上 2D 肠类器官来源单层细胞的跨上皮电阻力（TEER）测量。（A）使用伏欧表的 STX2 筷子式电极测量 2D 肠上皮细胞（IEC）单层的 TEER 值的示意图；（B）细胞培养中 2D 单层 TEER 值连续 12 天的纵向监测。每个数据点代表来自两个技术重复样本的平均 TEER 值及其标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="2D 肠上皮细胞单层标记物；E-钙黏蛋白、F-肌动蛋白、溶菌酶；荧光显微镜；细胞分化" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6:经转染小室插件上分化的 2D 类肠体衍生单层细胞形成极化肠上皮层. (A-M) 转染小室中培养5天后，源自二维肠类器官的单层细胞的代表性免疫荧光图像，显示（A细胞核（蓝色），（B) E-钙黏蛋白（红色），(CF-actin（绿色）和（D3 张图像的叠加（合并），（E,I) 核染色剂，(F)嗜铬粒蛋白A，(J细胞角蛋白-18，G,K) 溶菌酶，以及 (H,L) 图像合并。MZ轴堆叠成像显示二维单层细胞片中相同上皮细胞标志蛋白的分布。图像来自2个生物学重复。比例尺 = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="IL-1α 和 IL-8 水平；柱状图；顶端、基底部位；未处理组与 Pam3csk4 处理组比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图 7：转插装置中培养的牛原代二维肠类器官来源单层细胞具有功能活性。 在培养第5天时，未经处理或经 Pam3csk4 刺激24小时后，转插装置中二维单层细胞顶端和基底侧细胞培养上清中（A）IL-1α 和（B）IL-8 的分泌情况。数据代表来自一只动物隐窝冻存细胞系所获得的单层细胞以及三次独立实验的平均细胞因子水平及其标准误（SEM）。细胞因子采用基于微球的多重检测法（材料表）按照生产商说明书进行定量，并使用紧凑型多重分析仪（材料表）及免疫分析曲线拟合软件（材料表）进行检测与分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：试剂的储备液浓度与终浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。

类器官细胞培养系统能够重现组织中观察到的复杂性，因此在研究宿主-病原体相互作用、评估药物反应及疾病建模等方面具有重要应用价值。

我们的实验室致力于研究宿主与病原体之间的相互作用，以及感染后免疫细胞的动态变化。通过采用一种可靠的细胞培养模型，我们希望更贴近地模拟体内组织水平上发生的复杂相互作用。一些已发表的关于牛代际传递现象的文献缺乏必要的实验细节，导致该方案难以被轻易重复，使缺乏经验的研究人员在应用时面临挑战。本模型的优势在于我们提供了一套极为详细的实验方案，可供初学者研究人员成功使用。构建Transwell单层细胞模型可实现与免疫细胞的共培养，从而揭示组织与病原体相互作用的机制，同时维持类似体内组织的结构特征。这种多功能模型对于研究多种牛类疾病具有重要价值，其复杂性超越了单细胞模型。本实验室将采用该模型来探究影响隐孢子虫感染易感性的免疫因素。该模型将有助于在保持组织结构和免疫细胞微环境的前提下，比较成年牛与犊牛之间的差异。本研究的成果对人类健康具有直接的转化潜力。首先，将细胞培养小室放入24孔组织培养适配器板中。用100 µL基底膜细胞外基质（BME）在类肠器官生长培养基中预包被小室的顶侧。加载一个额外的插入物，用于在屏障完整性测量期间作为对照。随后，将包被的插入物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时。孵育完成后，吸除3D肠类器官培养基。用一毫升冰浴洗涤液收获牛回肠类器官。使用细胞刮棒刮下类器官球状结构，并将其收集至一个15毫升锥形管中。用一毫升移液枪头反复吹打30次，以产生类器官碎片。接下来，使用200微升枪头进一步吹打约40次，以分散类肠体碎片。用预冷的洗涤培养基将管内液体体积补至10毫升。然后在室温下以300 ×g离心5分钟。小心吸除上清液，包括 BME 层。接着，每四个类球体结构，用一毫升预热的 TrypLE Express 酶重新悬浮沉淀。将混合物转移至 24 孔板中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 10 分钟。使用1毫升移液器轻轻吹打混合物，以进一步解离类肠体。然后使用200微升移液器吹打混合物，将组织碎片解离为单细胞。用装有无菌22号针头的3毫升注射器吸取并滴加细胞悬液4次，以获得单细胞悬液。使用显微镜监测细胞解离过程，直至80%的肠类器官分解为单个细胞。现在将细胞悬液收集至15毫升锥形管中。加入四倍体积的FBS洗涤培养基以终止反应。随后将类肠组织通过预包被的40微米细胞筛两次，过滤至50毫升锥形管中。以300 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除离解后的牛回肠类肠组织细胞悬液在离心管中的上清液。用少量类器官生长培养基重悬沉淀。接下来，采用台盼蓝染色排斥法并结合血细胞计数板测定细胞活力。小心去除细胞培养小室中多余的包被溶液。在预先包被的培养小室的顶端表面接种200微升单细胞悬液。随后，在小室的基底侧加入700微升含FBS的完全培养基。将培养板以“8”字形移动约10次，使细胞在小室表面均匀分布。然后将培养板置于生物安全柜内的板式加热器上，放置10分钟。将培养板在37°C、5%二氧化碳条件下孵育48小时。孵育结束后，用新鲜的肠类器官生长培养基更换顶端和基底端的培养基。第二天，移除顶侧和基底外侧区室中的培养基。用 PBS 小心清洗小室，并更换为仅添加抑制剂的类肠器官分化培养基。接种的牛肠隐窝培养数小时后即可观察到类肠体的形成。两天后，类球体的管腔结构清晰，第4天可观察到出芽结构。第7天时观察到成熟的肠类器官。对培养7天的三维肠类器官进行免疫染色，结果显示存在多种细胞谱系。E-钙黏蛋白蛋白定位于黏附连接处。类肠体对肠内分泌细胞和产生溶菌酶的潘氏细胞呈阳性。在不到一周的培养时间内观察到融合的二维单层细胞。首先，从培养箱中取出含有二维牛回肠类器官单层的Transwell培养板。将培养板置于生物安全柜中，于室温下平衡数分钟。按照制造商说明，确保STX2电极已完成预处理，并将伏欧表校准至1,000欧姆。将探针的较长端插入Transwell上皮细胞培养的基底侧室，较短端插入顶侧室。待装置稳定后，对每个Transwell小室进行三次跨上皮电阻测量，包括无细胞的小室。计算每个小室测量值的平均值。用实验孔的平均测量值减去空白孔的平均测量值，然后乘以小室的表面积，以确定上皮屏障的电阻。在培养不到一周的时间内即可观察到融合的二维单层细胞。经上皮电阻（TEER）测量显示，数值在七天内持续上升，随后在第12天开始下降。染色后的二维单层细胞共聚焦显微镜图像显示了DAPI细胞核染色、E-钙黏蛋白以及F-肌动蛋白染色的定位。细胞呈现出分化特征，包含肠内分泌细胞、潘氏细胞和肠上皮细胞谱系。对单层细胞的顶端刺激可导致细胞因子产生增加。

generation-bovine-primary-enteroid-derived-two-dimensional-monolayer

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

生成用于转化生物医学研究的牛原代肠源二维单层培养系统

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。...

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外...

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

本研究描述了使用便携式实时逆转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）系统对野生鸟类中的禽流感进行诊断。该方法利用冻干试剂，可在非实验室环境下对野生鸟类进行筛查，适用于疫情暴发时的典型现场情况。分子检测工具可为快速诊断提供准确且灵敏的替代方案。...

野鸟中禽流感病毒的快速诊断：野外便携式实时逆转录聚合酶链式反应与冻干试剂的应用

本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。...

一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

我们描述了一种利用非病毒型piggyBac转座子系统将外源基因导入原代人T细胞的遗传修饰方法。通过piggyBac转座子系统修饰的T细胞可实现外源基因的稳定表达。...

piggyBac 转座子系统对人原代T细胞的改造

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

体外 比较治疗性抗体靶标结合与补体依赖性细胞毒作用诱导的方法：在生物相似性分析中的应用

本文介绍了一种建立和培养人源及小鼠源三维（3D）胃类器官的方案，以及将三维类器官转化为二维单层细胞的实验方法。同时描述了利用胃上皮单层细胞作为新型划痕损伤模型进行再生研究的方法。...

用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

学习建立牛原代肠源二维单层培养系统，用于研究胃肠道组织生理与病理机制。该模型支持免疫细胞共培养，可稳定形成紧密上皮屏障，为转化医学研究提供可靠工具。

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

探索更多视频