姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

口腔念珠菌病的发病率很高，尤其在免疫功能低下个体的可摘义齿佩戴者中更为常见。抗真菌药物治疗存在复发和耐药等缺点。因此，我们课题组二十多年来一直在研究治疗替代方案。

由于临床动物模型在临床试验前的重要性至关重要，我们致力于建立一种海洋小鼠的口腔念珠菌病模型。抗菌光动力疗法（APDT）是一种快速有效的替代方案，可广泛用于替代当前的抗菌治疗方法。该疗法需要聚焦激光与氧气的结合，以产生针对多种口腔微生物的抗菌效应，包括对传统药物具有耐药性的微生物。

姜黄素可能是一种有前景的抗念珠菌生物膜光敏剂，然而它是一种疏水性多酚，水溶性低且生物利用度差。因此，已有研究通过使用药物递送系统或将光敏剂与抗微生物药物联合应用，以提高姜黄素介导的光动力疗法（APDT）的疗效。抗真菌药物的广泛使用已导致念珠菌属在全球范围内出现耐药性紧急情况，并随之引发治疗失败。

因此，通过光动力作用控制念珠菌生物膜以应对抗真菌耐药性已成为我们研究的主要方向。我们建立的小鼠口腔念珠菌感染模型可用于评估念珠菌感染的致病机制以及替代性抗真菌策略的有效性。我们利用该模型评价由一种水溶性姜黄素类化合物介导的光动力抗真菌疗法（APDT）的效果。

首先，将口腔内无念珠菌生长的小鼠随机分为九组，每组对应一种不同浓度的姜黄素类物质，有光或无光条件。在第一天，对各组所有小鼠皮下注射免疫抑制剂泼尼松龙。从第一天起直至实验结束，在饮水中提供浓度为0.83毫克/毫升的盐酸四环素。

第二天，通过每侧大腿肌肉注射氯丙嗪氯化物，使小鼠在经口接种前达到镇静状态。随后，将无菌拭子浸入新配制的白色念珠菌标准悬液中。将小鼠置于仰卧位后，用蘸有菌液的拭子擦拭其舌头30秒。

第五天，给予泼尼松龙皮下注射以维持免疫抑制状态。第七天，在治疗前，将麻醉后的小鼠仰卧于带有缝线的垫板装置上，将缝线绕过门齿以保持口腔张开。

将70微升光敏剂滴加到C组和L组每只小鼠舌背表面。随后将舌头复位至口腔内，并将小鼠置于黑暗环境中20分钟，作为照射前的孵育期。光敏化阶段结束后，将LED装置置于舌背表面，照射7分钟。

按照演示方法将光敏剂应用于C组和L组（不含L组），处理后立即将小鼠置于黑暗环境中27分钟，使用无菌棉签在舌背擦拭1分钟，以采集白色念珠菌。将每根采样棉签放入含有1毫升无菌生理盐水的试管中，涡旋振荡1分钟，以重悬微生物细胞。

立即在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行10倍系列稀释，取25 µL等分试样，重复接种于沙保葡萄糖琼脂平板上，于37°C有氧条件下培养48小时。培养48小时后，使用数字菌落计数器测定酵母菌菌落数量。计算每只动物的白色念珠菌载量。

在动物被妥善实施安乐死后第8天，进行手术切除舌头，切除位置应在轮廓乳头前方，以确保完整移除整个舌头。最后，对分离出的舌头组织进行组织病理学分析。小鼠口腔念珠菌病模型显示，感染小鼠的舌头上出现典型的白色斑块和假膜。

在80微摩尔浓度的姜黄素作用下，抗菌光动力疗法降低了白色念珠菌的存活率。未感染动物的舌组织显示正常健康的组织结构，包括完整的固有层、基底膜和丝状乳头。在无光无药组（C minus L minus组）中，角化上皮层内可见酵母和菌丝结构，其下方结缔组织中存在轻度炎症反应。相比之下，接受80微摩尔浓度姜黄素介导的抗菌光动力疗法治疗的小鼠。

姜黄素类化合物在舌上皮角化层中的真菌细胞较少。