Name: 姜黄素介导的抗菌光动力疗法在口腔念珠菌病小鼠模型上的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解姜黄素介导的抗菌光动力疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。该方法利用水溶性姜黄素类化合物与蓝光LED照射，有效降低白色念珠菌活性，为抗真菌治疗提供新策略。

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作者感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，项目编号 FAPESP #2013/07276-1（CePID CePOF）和 2008/00601-6）提供的资金支持。我们还要感谢 Ana Paula Silva 博士提供了有关基于 CUR 的水溶性盐的信息。&#160;&#160;

本研究使用小鼠的研究方案已获得圣保罗州立大学（UNESP）阿拉拉夸拉牙科学院动物使用伦理委员会的批准（批准编号：05/2008 和 09/2020）。实验采用白色念珠菌（C. albicans，ATCC 90028）作为参考菌株。本研究共使用45只6周龄雌性瑞士小鼠（n = 45），体重范围为20–30 g。实验动物由巴西圣保罗州立大学（UNESP）博图卡图校区提供。
1. 光动力疗法中光敏剂的制备与光源的选择
<ol>
	<li>根据待测物质的规格制备光敏剂（PS）。 
	注意：本研究中使用了一种水溶性姜黄素类化合物混合物（基于姜黄素的水溶性盐混合物12）作为光敏剂（参见材料表和图1）。使用前立即用超纯水配制20 µM、40 µM和80 µM（分别为15.6、29.2和58.4 mg/L）的稀释液，并于5 °C保存。</li>
	<li>选择具有合适波长（与光敏剂吸收波长相同）、能够均匀且同时照射整个光敏化靶区而不引起组织加热的光源设备。 
	&#8203;注意：本研究使用了由巴西圣卡洛斯圣保罗大学圣卡洛斯物理研究所（Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil）设计的手持式发光二极管（LED，参见材料表）装置。光源输出功率在约455 nm的蓝光波长下为89.2 mW/cm2。</li>
</ol>
2. 准备 白色念珠菌 接种物
<ol>
	<li>将标准菌株 C. albicans (ATCC 90028) 保存于含50%甘油的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD，参见材料表）培养基中，置于 -80 °C 保存至使用。</li>
	<li>在室温下解冻冻存菌株，取100 µL菌液涂布于含氯霉素的沙保葡萄糖琼脂（SDA）培养皿（参见材料表），于37 °C 培养48小时。</li>
	<li>挑取五个单菌落接种至10 mL含2%葡萄糖的酵母氮源培养基（YNBg）中，于37 °C 需氧培养16小时。</li>
	<li>将酵母菌液按1:10比例接种于新鲜YNBg培养基中，于37 °C 需氧培养至菌液处于对数生长中期。 
	注：各实验室应预先建立标准化的微生物生长曲线。在本研究中，菌液培养约8小时，直至在540 nm处测得的光密度（OD540）达到对数生长中期，平均值为0.536 ± 0.062（均值 ± 标准差[SD]）。</li>
	<li>在室温下以5,000 x g 离心5分钟，弃上清液，用等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS；0.136 M NaCl，2 mM KCl，1 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4，pH 7.4）重悬菌体沉淀并洗涤两次。</li>
	<li>取100 µL菌悬液用PBS进行连续4次10倍梯度稀释，将各稀释液涂布于SDA平板，于37 °C 培养48小时进行菌落计数。通常使用浓度约为4.5 × 107 菌落形成单位/毫升（CFU/mL）的真菌悬液作为标准。</li>
</ol>

3. 小鼠骨钙素（OC）的诱导
注意：以下方法先前由 Takakura 等人13描述，并由我组10,14重复实现，略有修改。
<ol>
	<li>将小鼠随机分为九组（n = 5），每组对应一种处理方式（补充文件 1). 
	注意：小鼠口腔应呈阴性 假丝酵母 生长情况需通过口腔拭子取样并在SDA培养基上接种培养来检测。</li>
	<li>将动物饲养在聚丙烯盒中10（每箱最多5只小鼠）&#160;使用木屑作为地面铺垫物，&#160;在23 ± 2 °C的温度控制动物饲养室中，采用12/12小时明暗循环光照。无需提供特定的环境丰富化措施。</li>
	<li>将小鼠饲养在挤压颗粒小鼠饲料和过滤水的条件下 随意摄取.</li>
	<li>皮下注射免疫抑制药物泼尼松龙&#160;（100 mg/kg 体重，参见 材料表)，首次在第一天给予 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20 µM、C+L- 40、C+L- 80、C-L+ 和 C-L- 各组所有成员补充文件 1). 
	注意：将同组小鼠饲养于同一笼内，每天监测其是否有应激或体重减轻的迹象。若发现应激或体重减轻，应咨询兽医以确定是否需要使用镇痛剂或调整食物/饮水。</li>
	<li>从第一天开始直至实验结束，将盐酸四环素以0.83 mg/mL的浓度加入饮水中给予13.</li>
	<li>第2天接种小鼠舌部，包括 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20、C+L- 40、C+L- 80、C-L+ 和 C-L- 组（补充文件 1），其中的 C. albicans 接种物。不要对阴性对照组（NCtrl）的小鼠进行接种。
	<ol>
		<li>通过肌肉注射 10 mg/kg 氯丙嗪氯化物使动物镇静（参见 材料表) 在每侧大腿肌肉上&#160;在进行接种之前。</li>
		<li>对小鼠进行口腔内接种&#160;通过将无菌棉签（每只动物一支）浸入新鲜配制的（即接种前立即制备的标准化悬液 C. albicans.</li>
		<li>将麻醉后的小鼠置于仰卧位。使用无菌镊子轻轻将其舌头拉出口外。用浸湿的棉签擦拭每只小鼠的舌头30秒。监测小鼠直至其从麻醉状态恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天，给予泼尼松龙（100 mg/kg体重）皮下补充注射，以维持免疫抑制状态。 
	&#8203;注意：本方案适用于口腔内接种后维持感染7天。方案的时间线如下所示： 图2.</li>
</ol>
4. 抗菌光动力疗法及从口腔病变中回收C. albicans
<ol>
	<li>在第七天治疗前，通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合赛拉嗪（10 mg/kg 体重）对动物进行麻醉（参见材料表）。</li>
	<li>将每只动物仰卧放置于带有不锈钢丝的垫板装置上14,15，不锈钢丝可绕在门齿周围以保持口腔张开。 
	注意：建议使用恒温垫在动物镇静期间为其保温，防止室温下发生低体温，并避免与麻醉相关的死亡15。应通过夹捏脚趾时无回缩反射来监测每只麻醉动物，以确认麻醉深度。如需要，可追加一次维持剂量的氯胺酮（剂量为初始剂量的1/3，不含赛拉嗪）。</li>
	<li>在下颌和面颊回缩的情况下，轻柔地将舌头移出口腔外。</li>
	<li>对于C+L+组的小鼠，将70 µL光敏剂（PS）溶液（选择一种测试浓度）滴加至舌背表面。将小鼠置于黑暗环境中持续20分钟，作为照射前孵育期。在此期间，确保每只动物的舌头保持在口腔内，以防止光敏剂（PS）被吞咽。</li>
	<li>光敏化阶段结束后，将舌头拉出以进行光照。将LED装置置于舌背表面，以37.5 J/cm2的剂量照射（使用当前设备需照射7分钟）（图3）。</li>
	<li>对于C+L-组的小鼠，在舌背表面滴加70 µL光敏剂（PS）溶液（选择一种测试浓度），并将这些小鼠在黑暗环境中放置27分钟。</li>
	<li>对于C-L+组的小鼠（仅接受光照处理，未预先进行光敏化），在舌背表面滴加70 µL无菌生理盐水。将小鼠在黑暗环境中放置20分钟后，以37.5 J/cm2的剂量进行舌部照射（使用当前设备需照射7分钟）。</li>
	<li>对于C-L-组的小鼠（既未接受光敏剂处理也未接受光照处理），在舌背表面滴加70 µL无菌生理盐水，并在黑暗环境中放置27分钟。</li>
	<li>治疗后立即从小鼠舌部回收C. albicans。使用无菌棉签在舌背表面擦拭1分钟。</li>
	<li>将每根取样棉签放入含有1 mL无菌生理盐水的试管中，涡旋振荡1分钟以重悬微生物细胞。</li>
	<li>立即在PBS中进行10倍系列稀释，取25 µL稀释液重复接种于SDA平板上。将平板置于37 °C有氧条件下培养48小时。</li>
	<li>48小时后，使用数字菌落计数器（参见材料表）测定酵母菌落数量。计算每只动物的C. albicans载量（CFU/mL）。</li>
	<li>将CFU/mL数值转换为log10值，并根据实验设计和数据假设进行适当的统计分析。 
	注意：在本研究中，采用Welch单因素方差分析及Games-Howell事后检验（α = 0.05）16。</li>
</ol>
5. 组织病理学分析
<ol>
	<li>第8天，使用100 mg/kg的氯胺酮与10 mg/kg的赛拉嗪联合麻醉小鼠&#160;通过腹腔注射给予过量氯胺酮（200 mg/kg，腹腔注射）处死小鼠，通过检测呼吸运动消失（呼吸暂停）和心跳停止（心搏停止）确认死亡。</li>
	<li>小心捏住舌头并将其拉出动物口腔。使用手动手术刀，在轮廓乳头前方做一切口，完整切除整个舌头，同时避免对舌前部和中部区域造成任何损伤。</li>
	<li>用10%中性缓冲福尔马林（pH 7.2–7.4）固定舌头24小时，然后在流水下冲洗2小时。</li>
	<li>继续进行石蜡包埋流程：脱水、透明和浸蜡10,14.</li>
	<li>使用切片机切取连续切片（5 µm 厚），将切片贴附于玻璃载片上。随后采用过碘酸-希夫与苏木精（PAS-H）染色，以进行组织病理学检查，并在光学显微镜下观察以鉴定真菌。</li>
	<li>请一位病理学家（最好对所研究的分组设盲）评估组织反应 C. albicans 感染</li>
	<li>描述组织的组织学特征（上皮和结缔组织），尤其是不同程度的局部炎症反应。</li>
</ol>

Effective aPDT Using Curcuminoids for Oral Candidiasis in Mice

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</ol>

C. albicans 与免疫功能低下者、糖尿病患者、长期使用抗生素者以及口腔卫生不良者的口腔和食管感染相关1,3。人类传染性疾病的研究需要在开展临床试验之前，进行体外（in vitro）和体内（in vivo）的研究，以确保试验设计的安全性和准确性。本研究描述了一种建立小鼠口腔念珠菌病（OC）模型的方法，可用于评估 C. albicans 引起的口腔感染的发病机制以及抗真菌治疗策略的有效性15,16,17,18,19。
本研究中采用的小鼠OC模型已成功建立，这通过从病灶中...

口腔念珠菌病（OC）是口腔主要的真菌感染，由念珠菌属真菌过度生长引起 假丝酵母 spp. 口腔念珠菌病的易感因素包括内分泌功能障碍、广谱抗生素的使用、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量降低）、义齿佩戴、口腔卫生不良，尤其是免疫抑制状态。1. 在……之中 假丝酵母 物种, 白色念珠菌 是最常见且毒力最强的一种；它在人体内可作为共生菌存在，也可作为机会性病原体。 C. albicans 能够从共生酵母形态（芽生孢子）转变为致病性菌丝形态（菌丝和假菌丝）2菌丝状形态，尤其是菌丝，可通过内吞作用或主动侵入方式侵入宿主上皮细胞，从而引起感染3. 其他毒力因子 C. albicans 包括黏附、生物膜形成，以及脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶素等脂解酶、水解酶和毒素的分泌4.
口腔念珠菌病（OC）的治疗涉及使用抗真菌药物，尤其是局部应用的多烯类和唑类药物（如制霉菌素和咪康唑）5。然而，这些药物仅表现出短期疗效，且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用已导致抗真菌耐药性的产生与传播问题6。因此，亟需替代疗法，例如抗菌光动力疗法（aPDT），该疗法结合光敏剂（PS）、在适当波长（与PS吸收波长相同）的光照以及氧气的存在下发挥作用。光敏剂可与细胞结合或被细胞摄取，在光照激活后产生对敏感细胞具有毒性的活性氧（ROS）7。
在光动力疗法（aPDT）中，一种常用的光敏剂（PSs）是姜黄素（CUR），这是一种从姜黄植物（Curcuma longa L.）的根茎中提取的天然化合物。姜黄素具有多种治疗特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌能力8,9。先前的一项研究发现，在口腔念珠菌病的小鼠模型中，使用姜黄素的aPDT能有效减少白色念珠菌（C. albicans）的数量，且未对宿主组织造成任何损伤10。姜黄素是从姜黄中提取的主要姜黄素类化合物，但该植物中还含有其他多酚类物质，如去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。姜黄素类化合物介导的aPDT已被证实对导管中培养的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜具有抗菌活性11。然而，据我们所知，其对白色念珠菌（C. albicans）的抗真菌活性仍不明确。因此，在本研究中，我们评估了姜黄素类盐介导的aPDT在中国台湾地区建立的OC小鼠模型中对白色念珠菌（C. albicans）的作用效果。

<table><tbody><tr><td>C. albicans</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC，Rockville，Md，USA）</td><td>90028</td><td>用于制备念珠菌接种物</td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;Centrifuge 5804/5804R，B. Braun，Melsungen，Hesse，德国</td><td>022628146 (NA)</td><td>用于制备念珠菌接种物</td></tr><tr><td>氯丙嗪氯化物 2 mg/mL</td><td>巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于在接种白色念珠菌期间使动物镇静</td></tr><tr><td>基于姜黄素的水溶性盐</td><td>PDTPharma，巴西克雷文斯</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>由53.4%的天然姜黄素组成，以及&amp;nbsp; 46.6% 的其他姜黄素类物质（去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素）。以水和N-甲基-D-葡萄糖胺配制（最终平均分子量为730.32 g·mol⁻¹）&amp;minus;1)</td></tr><tr><td>数字菌落计数器</td><td>CP 600 Plus，Phoenix Ind Com Equipamentos Cient&amp;iacute;ficos Ltda，巴西圣保罗州阿拉拉夸拉</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>用于计数琼脂平板上的菌落</td></tr><tr><td>挤压成型的小鼠饲料</td><td>Benelab 饲料，Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda.，Lind&amp;oacute;ia, S&amp;atilde;巴西圣保罗州</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>用于小鼠喂养</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 10%</td><td>氯胺酮 Agener，Uni&amp;atilde;o Qu&amp;iacute;米卡制药&amp;ecirc;乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜&amp;ccedil;巴西圣保罗</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>用于在动物实验前进行麻醉&amp;nbsp; 治疗和安乐死</td></tr><tr><td>发光二极管手柄（原型）</td><td>中国台湾 F研究所&amp;iacute;西卡 de S&amp;atilde;o Carlos，S大学&amp;atilde;圣保罗，S&amp;atilde;o Carlos, SP, 巴西</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>使用LXHL-PR09型Luxeon III发光器（Lumileds Lighting，美国加利福尼亚州圣何塞）制备</td></tr><tr><td>醋酸甲泼尼龙 40 mg</td><td>DEPO-MEDROL，辉瑞，纽约</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>用作免疫抑制剂</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica&amp;nbsp;Microsystems，美国伊利诺伊州班诺克本</td><td>SM2500</td><td>用于切割舌组织的连续切片</td></tr><tr><td>丙烯箱（笼具 housing）H13 × L20 × D30 cm</td><td>邦瑟设备，里贝朗&amp;atilde;o 巴西普雷图</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>用于在整个实验过程中饲养动物&amp;nbsp; 实验周期</td></tr><tr><td>含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂</td><td>HiMedia，孟买，印度</td><td>MM1067-500G</td><td>用于酵母生长的培养基（琼脂）</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>分光光度计 Kasvi K37-VIS, S&amp;atilde;o Jos&amp;eacute; 巴西多斯皮尼亚伊斯</td><td>K37-VIS&amp;nbsp;</td><td>用于标准化接种物浓度</td></tr><tr><td>盐酸四环素&amp;nbsp;</td><td>巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>用于诱导口腔菌群失调的抗生素</td></tr><tr><td>木屑</td><td>J.R. 木屑，Comerce of Sawdust Ltda. 公司，Conchal，S&amp;atilde;巴西圣保罗州</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>用于 housing boxes 内部的地面覆盖</td></tr><tr><td>2% 赛拉嗪</td><td>Calmiun, Uni&amp;atilde;o Qu&amp;iacute;米卡制药&amp;ecirc;乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜&amp;ccedil;巴西圣保罗</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>与氯胺酮联合用于麻醉</td></tr><tr><td>酵母氮源肉汤&amp;nbsp;</td><td>Difco，InterLab，底特律，密歇根州，美国</td><td>DF0919-07-3&amp;nbsp;</td><td>酵母生长培养基（液体）</td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖肉汤</td><td>NutriSelect Basic，Sigma Aldrich</td><td>Y1375</td><td>用于在 -80 保存菌株的培养基&amp;deg;C 和生长</td></tr></tbody></table>

姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

抗菌光动力疗法（aPDT）已得到广泛研究 体外，感染的临床前动物模型适用于在临床试验前评估替代疗法。本研究描述了光动力抗菌疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的疗效。40只小鼠通过皮下注射泼尼松龙进行免疫抑制处理，随后使用预先浸入念珠菌悬液的口腔拭子对小鼠舌部进行接种 C. albicans 细胞悬液。给予四环素 通过 实验期间，小鼠可自由饮用饮水。真菌接种后第5天，将小鼠随机分为八组；另设第九组未处理且未感染的小鼠作为阴性对照组（n = 5）。采用三种浓度（20 µM、40 µM 和 80 µM）的姜黄素类化合物混合物，并结合蓝光LED（89.2 mW/cm²）进行处理2；~455 nm）以及无光照（分别为 C+L+ 和 C+L- 组）。单独光照（C-L+）、无任何处理（C-L-）以及未感染动物作为对照组进行评估。数据采用 Welch's ANOVA 和 Games-Howell 检验进行分析（α = 0.05）。所有感染动物均成功建立口腔念珠菌病模型，并通过舌背出现典型白色斑块或假膜在宏观上得以观察。组织病理学切片显示，C-L- 组中大量酵母和菌丝局限于上皮角化层；而在接受 40 µM 或 80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 治疗的小鼠图像中，真菌细胞的存在在视觉上明显减少。80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 实现了 2.47 log 的降低10 与C-L-组相比，菌落计数减少（p = 0.008）。其他所有组均未显示菌落数量的统计学显著减少，包括仅使用光敏剂（C+L-）或仅使用光照（C-L+）的组别。姜黄素介导的抗菌光动力疗法减少了小鼠舌部的真菌负荷。

小鼠OC模型显示，所有感染小鼠的舌头上均出现典型的白色斑块和假膜（图4A）。从C-L-动物中回收的C. albicans证实了该微生物对组织的定植（菌落数量范围为1.62 × 104 至 4.80 × 105 CFU/mL）。与预期一致，NCtr组动物在取样后未显示任何组织改变或菌落生长（图4B）。
当使用80 µM姜黄素类化合物作为光敏剂时，aPDT降低了白色念珠菌（C. albicans）的存活率（图5）。与C-L-组相比，80 µM光敏剂介导的aPDT实现的平均log10减少值为2.47（p = 0.008）。
在未接受光照的姜黄素处理组（C+L- 组）、仅接受光照但未进行光敏化的处理组（C-L+ 组）以及未处理组小鼠（C-L...

本方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。aPDT 采用水溶性姜黄素类化合物混合物结合蓝光 LED 照射进行。

抗菌光动力疗法（aPDT）已在体外得到广泛研究，而感染的临床前动物模型适用于……

口腔念珠菌病的发病率很高，尤其在免疫功能低下个体的可摘义齿佩戴者中更为常见。抗真菌药物治疗存在复发和耐药等缺点。因此，我们课题组二十多年来一直在研究治疗替代方案。由于临床动物模型在临床试验前的重要性至关重要，我们致力于建立一种海洋小鼠的口腔念珠菌病模型。抗菌光动力疗法（APDT）是一种快速有效的替代方案，可广泛用于替代当前的抗菌治疗方法。该疗法需要聚焦激光与氧气的结合，以产生针对多种口腔微生物的抗菌效应，包括对传统药物具有耐药性的微生物。姜黄素可能是一种有前景的抗念珠菌生物膜光敏剂，然而它是一种疏水性多酚，水溶性低且生物利用度差。因此，已有研究通过使用药物递送系统或将光敏剂与抗微生物药物联合应用，以提高姜黄素介导的光动力疗法（APDT）的疗效。抗真菌药物的广泛使用已导致念珠菌属在全球范围内出现耐药性紧急情况，并随之引发治疗失败。因此，通过光动力作用控制念珠菌生物膜以应对抗真菌耐药性已成为我们研究的主要方向。我们建立的小鼠口腔念珠菌感染模型可用于评估念珠菌感染的致病机制以及替代性抗真菌策略的有效性。我们利用该模型评价由一种水溶性姜黄素类化合物介导的光动力抗真菌疗法（APDT）的效果。首先，将口腔内无念珠菌生长的小鼠随机分为九组，每组对应一种不同浓度的姜黄素类物质，有光或无光条件。在第一天，对各组所有小鼠皮下注射免疫抑制剂泼尼松龙。从第一天起直至实验结束，在饮水中提供浓度为0.83毫克/毫升的盐酸四环素。第二天，通过每侧大腿肌肉注射氯丙嗪氯化物，使小鼠在经口接种前达到镇静状态。随后，将无菌拭子浸入新配制的白色念珠菌标准悬液中。将小鼠置于仰卧位后，用蘸有菌液的拭子擦拭其舌头30秒。第五天，给予泼尼松龙皮下注射以维持免疫抑制状态。第七天，在治疗前，将麻醉后的小鼠仰卧于带有缝线的垫板装置上，将缝线绕过门齿以保持口腔张开。将70微升光敏剂滴加到C组和L组每只小鼠舌背表面。随后将舌头复位至口腔内，并将小鼠置于黑暗环境中20分钟，作为照射前的孵育期。光敏化阶段结束后，将LED装置置于舌背表面，照射7分钟。按照演示方法将光敏剂应用于C组和L组（不含L组），处理后立即将小鼠置于黑暗环境中27分钟，使用无菌棉签在舌背擦拭1分钟，以采集白色念珠菌。将每根采样棉签放入含有1毫升无菌生理盐水的试管中，涡旋振荡1分钟，以重悬微生物细胞。立即在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行10倍系列稀释，取25 µL等分试样，重复接种于沙保葡萄糖琼脂平板上，于37°C有氧条件下培养48小时。培养48小时后，使用数字菌落计数器测定酵母菌菌落数量。计算每只动物的白色念珠菌载量。在动物被妥善实施安乐死后第8天，进行手术切除舌头，切除位置应在轮廓乳头前方，以确保完整移除整个舌头。最后，对分离出的舌头组织进行组织病理学分析。小鼠口腔念珠菌病模型显示，感染小鼠的舌头上出现典型的白色斑块和假膜。在80微摩尔浓度的姜黄素作用下，抗菌光动力疗法降低了白色念珠菌的存活率。未感染动物的舌组织显示正常健康的组织结构，包括完整的固有层、基底膜和丝状乳头。在无光无药组（C minus L minus组）中，角化上皮层内可见酵母和菌丝结构，其下方结缔组织中存在轻度炎症反应。相比之下，接受80微摩尔浓度姜黄素介导的抗菌光动力疗法治疗的小鼠。姜黄素类化合物在舌上皮角化层中的真菌细胞较少。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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微小菌落对念珠菌属耐药性的影响尚未得到充分研究。抗菌光动力疗法（aPDT）为应对耐药性真菌感染提供了一种有前景的策略。本研究表明，玫瑰红介导的aPDT可有效灭活Candida...

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姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

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