在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

最有效的靶向癌症治疗之一是基于抗体的疗法，例如抗HER2抗体曲妥珠单抗。曲妥珠单抗的抗肿瘤作用涉及自然杀伤（NK）细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。深入了解调控癌细胞对抗生长因子受体抗体治疗敏感性的机制，特别是与ADCC相关的机制，对于开发新型且更高效的治疗策略可能至关重要。

三维模型（如癌细胞球状体）在预测肿瘤对各种抗癌疗法的免疫反应方面表现出更优的效果。因此，我们建立了一种ADCC球状体模型，该模型使用NK92自然杀伤细胞系、表达GFP的JIMT-1乳腺癌细胞以及曲妥珠单抗。我们通过诱导抗HER2阳性的JIMT-1乳腺癌细胞形成称为球状体的三维细胞簇，构建了ADCC检测系统。

实验中使用的 JIMT-1 细胞系稳定表达绿色荧光蛋白。我们首先准备用于球体形成的 96 孔板。为了形成 U 形且抗细胞黏附的底部，用含有 0.5% 琼脂糖的 PBS 溶液包被 96 孔板。

将培养板在室温下孵育约30至45分钟。在此期间，对JIMT-1细胞进行胰酶消化并计数，用于接种细胞。用两毫升无菌PBS洗涤细胞。

向培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，然后将培养瓶放回 CO2 培养箱中孵育 10 分钟。孵育结束后，轻敲培养瓶，检查 JIMT-1 细胞是否已脱落。加入 2 mL JIMT-1 培养基终止消化，并将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。

用台盼蓝在布氏计数板中计数细胞，并将细胞浓度调整至每毫升20,000个细胞。通过移液将100微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，用于形成球状体。将细胞在37摄氏度的CO2培养箱中孵育三天，使其聚集形成细胞球。

定期使用倒置显微镜检查类球体的大小和形态。在类球体诱导后的第三天，用溶解于DMSO中的Pluronic F-127溶液包被96孔高内涵筛选板。包被步骤至关重要，可防止JIMT-1 EGFP类球体贴附于玻璃表面或培养板上。

室温孵育45分钟后，吸去包被液，用无血清DMEM F12培养基洗涤孔板两次。使用1毫升移液器将类球体以每组三个复孔的方式转移至96孔高内涵筛选板中。在每孔中加入10微升浓度为40微摩尔的舒尼替尼，并向对照孔中加入新鲜的JIMT-1培养基，以补足体积。

在37摄氏度的CO2培养箱中孵育平板1小时。在预处理类球体孵育的同时，将NK92细胞从培养瓶中收集至15毫升离心管中。使用台盼蓝在布氏细胞计数板中对细胞进行计数，并调整细胞数量，使效应细胞与靶细胞的比例达到20:1。

用10微摩尔的CellTracker Blue溶液对NK细胞进行染色，并将细胞置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育1小时。为洗去多余的染料，在室温下以150 RCF离心NK细胞两次，每次3分钟。然后将细胞重悬于新鲜的JIMT-1培养基中。

用移液器将染色的NK细胞沿孔壁每孔加入55微升至靶向JIMT-1 EGFP类球体中，并同时加入抗HER2抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）。用JIMT-1培养基稀释曲妥珠单抗，使其浓度达到每毫升10微克。向对照孔中加入110微升新鲜的JIMT-1培养基，并将培养板置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育24小时。

因此，ADCC 实验中添加的处理总体积为 110 微升，最终舒尼替尼浓度为 20 微摩尔每升。为检测和测量处理后的细胞凋亡，使用 Annexin V Alexa Fluor 647 偶联物在 JIMT-1 培养基中对类球体染色一小时。实验步骤完成后，将培养板转移至高内涵分析设备中。

在将NK因子加入靶细胞后24小时对培养板进行成像。成像时，我们使用高内涵分析仪和图像分析软件。通过“培养板类型”选项，从培养板列表中选择微孔板的类型。

使用96孔高内涵筛选板。选择两个峰值自动对焦，分别对应在使用10倍物镜（数值孔径为0.3）的板式实验中，通过自动对焦和物镜选项进行设置。选择共聚焦模式并启用OptiMode选项，使用Binning选项时应用Binning 2。

在对类球体进行成像时，使用“通道选择”选项选择适当的通道。为检测转染EGFP的JIMT-1细胞，请选择EGFP通道，设置参数为200毫秒积分时间、50%激光功率、2微米层厚、488纳米激发波长以及500、550纳米发射波长。为检测凋亡细胞，请使用Alexa 647通道，设置参数为100毫秒积分时间、50%激光功率、10微米层厚、640纳米激发波长以及650、760纳米发射波长。

为了观察类球体中的自然杀伤细胞（NK细胞），请选择以下通道参数：DAPI，积分时间为100毫秒，激光功率为50%，层厚为2微米，激发波长为405纳米，发射波长为435纳米和418纳米。在“布局选择”选项中，选择Z轴层扫（Z stacks），因为类球体中的细胞通常位于显微镜的不同焦平面上。以10微米的间距采集10个层面，足以覆盖整个类球体区域。

将第一层面和最后一层面的值分别设置为 0 微米和 90 微米。在开始测量之前，可使用“快照”功能拍摄样本图像，以检查设置是否正确。使用“定义布局”选项设置成像所需的孔数和视野数。

通过EGFP荧光识别球状体，或使用“精细纹理区域”选项识别JIMT-1细胞，并按大小进行筛选。使用“选择群体”模块去除边缘物体。由于Annexin阳性细胞出现在球状体外围，因此在凋亡环区域测量Annexin的荧光强度。

在“选择区域”模块中，将外边框设置为负90。以平均强度表示Annexin的强度值。根据Annexin V染色结果，向JIMT-1细胞中添加NK细胞和曲妥珠单抗可导致肿瘤类球体发生细胞死亡。

在类球体的周边区域出现了膜联蛋白阳性的凋亡细胞。然而，在缺乏曲妥珠单抗的情况下，自然杀伤细胞并未引发肿瘤细胞凋亡。为了区分曲妥珠单抗的直接作用与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应，本研究采用缺乏Fc区结合能力的曲妥珠单抗Fab2片段作为阴性对照。

由于在此模型中 trastuzumab-Fab2 无效，肿瘤细胞死亡可能通过 ADCC 介导。此外，舒尼替尼预处理降低了球状体中 Annexin V 的染色强度，证实舒尼替尼可诱导 ADCC 抵抗，并揭示在与 NK 细胞和曲妥珠单抗共同孵育的 JIMT-1 球状体中，细胞凋亡性死亡受到抑制。该数据证实了舒尼替尼在 ADCC 模型中的细胞保护作用，提示在联合使用基于 ADCC 的免疫治疗与舒尼替尼时应保持谨慎。

总之，我们的高内涵筛选（HCS）检测方法可能适用于鉴定增强ADCC效应的化合物。