Name: 量化肿瘤球状体模型中抗体依赖性细胞毒性:药物发现应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学习利用三维肿瘤球状体模型和NK92细胞系量化抗体依赖性细胞毒性，评估曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌的免疫治疗效果。该方法为药物发现提供可靠的ADCC研究平台。

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LV 获得了匈牙利国家研究、发展与创新办公室资助项目 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS&#34;、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE、OTKA K132193 和 K147482 的支持。本项目还获得了匈牙利研究网络（HUN-REN）的资助。CD16.176V.NK-92 细胞由 Kerry S. Campbell 博士（费城福克斯蔡斯中心，代表加州圣地亚哥 Brink Biologics, Inc.）提供，该细胞在全球范围内受专利保护，并由 Nantkwest, Inc.（www.nantkwest.com）授权使用。作者感谢 György Vereb 和 Árpád Szöőr 在使用 NK-92 细胞系和 TR-F(ab’)2 以及技术指导方面提供的帮助。

1. 建立JIMT-1增强型荧光蛋白（EGFP）球状体模型
<ol>
	<li>为了形成U形细胞排斥性底部，用0.5%琼脂糖-PBS溶液（每孔30 µL）包被96孔板。在室温下孵育约30-45分钟。</li>
	<li>用2 mL无菌PBS洗涤JIMT-1-EGFP细胞两次（JIMT1-EGFP细胞系的构建已在先前的出版物中报道17）。使用T25组织培养瓶和JIMT-1培养基（DMEM/F-12培养基添加20%胎牛血清（FBS）、0.3 U/mL胰岛素（100 IU/mL，Humulin R）和1%青霉素-链霉素）进行细胞培养。</li>
	<li>向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在CO2培养箱中孵育10分钟。</li>
	<li>轻敲培养瓶，检查JIMT-1细胞在孵育后是否已脱落。</li>
	<li>使用2 mL JIMT-1培养基终止消化，并将细胞悬液收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>用0.4%台盼蓝染液（80 µL染液 + 20 µL细胞悬液）在Bürker计数板中计数细胞，并将细胞浓度调整为20,000个细胞/mL。</li>
	<li>将100 µL细胞悬液（每孔2000个细胞）移入96孔板的每个孔中（该板已按步骤1.1所述预先包被0.5%琼脂糖-PBS溶液）。</li>
	<li>将细胞在37 °C的CO2培养箱中孵育3天，使其聚集成团。</li>
	<li>定期使用倒置显微镜检查类球体的大小和形态。</li>
</ol>
2. HCS 平板的包被
注意：为了防止 JIMT-1-EGFP 类球体附着于培养板的玻璃表面，对高内涵筛选（HCS）板进行包被至关重要（否则将无法进行高内涵分析）。
<ol>
	<li>在类球体诱导后的第3天，用Pluronic-F127（0.5%溶于DMSO，每孔50 µL）包被96孔高内涵筛选板，并在室温下孵育45分钟。</li>
	<li>吸除包被液，用DMEM/F-12无血清培养基（每孔100 µL）洗涤孔板两次。</li>
</ol>
3. 类球体转移至高内涵筛选板
<ol>
	<li>使用 1 mL 移液器，将类球体以每组三个重复的数量转移至玻璃底 96 孔 HCS 板中。</li>
</ol>
4. 使用测试化合物对 JIMT-1 EGFP 类球体进行预处理
<ol>
	<li>通过移液向每孔加入10 µL测试化合物（例如，以DMSO稀释至40 µM浓度的舒尼替尼），并向对照（CTL）孔中加入10 µL新鲜JIMT-1培养基。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
</ol>
5. 通过添加效应细胞诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）
注意：CD16.176V.NK92 细胞（下文简称 NK 细胞）在添加了 20% FBS、1% MEM-NEAA、1% 丙酮酸钠、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 100 IU/mL IL-2 的 α-MEM 培养基中培养。
<ol>
	<li>将培养瓶中的NK细胞收集至15 mL离心管中。用台盼蓝（80 µL染料 + 20 µL细胞悬液）计数细胞，并将细胞密度调整至效靶比（E:T）为20:1（即每孔40,000个NK细胞）。</li>
	<li>用10 µM细胞追踪蓝染料（CTB，1 µL加入1 mL α-MEM NK培养基中）对NK细胞进行染色，随后置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>将NK细胞在室温下以150 ×g离心3分钟，重复两次，每次用1 mL α-MEM培养基洗涤以去除多余染料。</li>
	<li>将NK细胞沉淀重悬于1 mL新鲜的JIMT-1培养基中。</li>
	<li>通过移液将染色后的NK细胞和抗HER2抗体（Ab）（曲妥珠单抗，溶于无菌蒸馏H2O中）加入靶向JIMT-1类球体中，每孔加入55 µL CTB标记的NK细胞和55 µL含10 µg/mL抗体的JIMT-1培养基（ADCC处理总体积为每孔110 µL，最终舒尼替尼浓度为20 µM）。 
	注意：抗体浓度和效靶比的选择依据我们先前发表的研究17。我们进行了预实验，测试了不同效靶比和曲妥珠单抗浓度，以评估在类球体中诱导ADCC的最有效条件（补充图S1）。</li>
	<li>向对照（CTL）孔中每孔加入110 µL新鲜JIMT-1培养基。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、含CO2的培养箱中孵育24小时。 
	注意：由于已知NK92细胞具有非特异性细胞毒作用，因此对照组应包括仅与NK细胞共孵育的JIMT-1细胞，以及与同型对照抗体或F(ab')2抗体共孵育的细胞。本实验中使用F(ab')2-曲妥珠单抗（TR-F(ab')2）作为阴性对照。TR-F(ab')2片段的制备方法如Tóth等人19所述，并按照步骤5.5所述与NK细胞一同加入，体积与曲妥珠单抗相同。其浓度调整为6.6 µg/mL，相当于与曲妥珠单抗等摩尔浓度23。</li>
</ol>
6. 类球体的Annexin V-647染色
<ol>
	<li>为检测凋亡性细胞死亡，使用JIMT-1培养基按1:100稀释Annexin V-Alexa Fluor 647偶联物，每孔加入50 µL，孵育1小时对类球体进行染色。</li>
</ol>
7. 成像
注意：在将NK效应细胞加入靶细胞后24小时对培养板进行成像。成像采用高内涵分析仪和图像分析软件。
<ol>
	<li>使用Plate Type选项从培养板列表中选择微孔板类型。使用96孔高内涵筛选（HCS）板。</li>
	<li>由于实验使用10倍物镜（数值孔径0.3）进行，因此分别通过Autofocus和Objective选项选择双峰自动对焦模式。通过Opt. Mode选项选择共聚焦模式，并通过Binning选项应用2× binning。</li>
	<li>对于类球体成像，使用Channel Selection选项选择合适的荧光通道。检测EGFP转导的JIMT-1细胞时选择EGFP通道（积分时间200 ms，激光功率50%，层厚2.0 µm；激发波长：488 nm，发射波长：500–550 nm）；检测凋亡细胞时使用Alexa 647通道（积分时间100 ms，激光功率50%，层厚10.0 µm；激发波长：640 nm，发射波长：650–760 nm）。为观察类球体内的NK细胞，选择以下通道：DAPI（积分时间100 ms，激光功率50%，层厚2.0 µm；激发波长：405 nm，发射波长：435–480 nm）。</li>
	<li>在Layout Selection选项中选择Z-stack模式，因为类球体中的细胞通常位于显微镜的不同焦平面上。10个焦平面（间距10 µm）足以覆盖整个类球体区域。将第一个和最后一个焦平面的位置分别设置为0 µm和90 µm。 
	注意：开始测量前，可使用快照功能拍摄样本图像，以检查设置是否正确。</li>
	<li>使用Define Layout选项设置用于成像的孔数和视野数。</li>
</ol>
8. 高内涵分析（HCA）
注意：使用 Harmony 软件分析图像，或导出图像以使用首选的第三方软件进行分析。在分析 ADCC 效率时，检测 Annexin V 647 的荧光强度。通过 ADCC 杀死的靶细胞出现在类球体的外周&#160;区域。因此，在该类球体的&#34;环状区域&#34;内测量 Annexin V 阳性细胞。为了验证该方法，采用不同参数进行了分析，以评估哪种参数最可靠且能获得最佳结果（补充图 S2）。视频中展示了一个 ADCC 孔，以逐步演示图像分析过程。
<ol>
	<li>使用Find Texture Regions选项，通过JIMT-1细胞的EGFP荧光识别球状体，并按大小（&#62; 25,000 µm2）进行筛选。</li>
	<li>通过Select Population 选项去除边缘物体。</li>
	<li>由于Annexin V阳性（凋亡）细胞出现在球状体的外围，因此使用Select Region选项选择凋亡“环”区域（外边界-90%），测量该区域的Annexin信号强度，以确定细胞凋亡程度。</li>
	<li>以平均强度表示Annexin V的信号强度值。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

尽管在过去几十年中乳腺癌（BC）的治疗取得了显著进展，患者仍经常出现药物耐药性或经历不良副作用24。与乳腺癌相关的高发病率和高死亡率迫切需要持续深入研究其潜在的分子机制，同时也需要建立可靠的筛选平台，以鉴定可用于治疗开发的新分子靶点25。这些研究策略依赖于基于细胞培养的转化实验。近年来，三维肿瘤培养系统（如球状体和肿瘤类器官）作为一种低成本、易于实施的模型逐渐兴起，相较于传统的单层细胞培养，能更真实地模拟肿瘤病理生理的关键特征。其中一项重要特征是多种肿瘤相关免疫细胞与癌细胞之间在空间上协调的相互作用。这使得三维共培养模型成为筛选作用于免疫细胞以治疗恶性肿瘤的药物调节剂的更优工具26。
在本研究中，我们建立了一种新的类球体模型，用于研究自然杀伤细胞（NK细胞）介导的、曲妥珠单抗依赖的针对JIMT-1乳腺癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并描述了一种用于评估NK细胞杀伤癌细胞的自动化成像与分析工作流程。该方法已应用于高内涵成像系统及图像分析软件，可监测NK细胞诱导癌细胞凋亡这一与疾病相关的关键功能。既往在二维细胞培养实验中已发现，多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼可导致JIMT-1细胞对曲妥珠单抗依赖性ADCC产生耐药性。舒尼替尼会损害NK细胞的杀伤功能，并诱导自噬，下调HER2表达，同时增强JIMT-1细胞的黏附能力17。为验证我们所建立的类球体分析流程在化合物筛选中的适用性，我们以舒尼替尼作为模型化合物进行测试，结果表明，该化合物可显著抑制NK细胞对癌细胞类球体的杀伤能力，重现了其在单层培养中的效应。
我们的方法十分简便，包括在经琼脂糖包被的96孔组织培养板中生成球状体，将形成的球状体一次性转移至适用于高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）应用的玻璃底微孔板中，加入待测化合物以及经单独染色并由曲妥珠单抗激活以发挥杀伤作用的自然杀伤细胞（NK细胞），进行一步法细胞死亡染色，最后进行显微镜分析。在两种细胞共培养及药物处理开始后，不再对孔板进行任何剧烈操作，以避免破坏球状体的完整性。该检测仅需4天即可完成。在实验步骤中，使用1%低熔点琼脂糖对96孔组织培养板底部进行包被，是一种比使用超低吸附板更为经济的替代方案，可防止JIMT-1细胞贴附于孔板表面，并促进肿瘤细胞自发形成球状体。由于无法透过琼脂糖垫层和U形塑料表面进行成像，因此需要将球状体转移至成像用孔板中。在转移前，使用生物惰性表面活性剂Pluronic-F127对HCS孔板的玻璃表面进行钝化处理至关重要。若缺少此步骤，球状体会在孔底铺展，导致成像和分析变得困难。
采用稳定表达EGFP的人类肿瘤细胞系用于形成球状体17。这种基因编码的标记物在整个实验流程中可提供持续的荧光信号，无需使用细胞染料。对EGFP信号进行无监督纹理分析，可识别出球状体的致密核心区域，该区域涵盖整个球状体且未诱导细胞死亡。当加入NK细胞并诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）时，球状体轮廓的明显解体有时会给图像分析算法在界定球状体边界时带来挑战。由于Annexin V阳性细胞主要位于球状体的外围区域，因此可通过软件内置的图像分割模块，在明确定义的球状体核心基础上扩展生成一个环形外周区域，从而评估该区域内的细胞死亡情况，以规避上述问题。该区域的外边界扩展因子经过数百个球状体图像的目视筛选后确定，以确保涵盖所有情况下正在死亡、破碎和弥散的细胞边缘区域。通过对Z轴层扫图像最大投影中凋亡环形区域的总荧光强度进行定量，相较于测量整个球状体区域或整个孔板区域，可获得更低的实验误差和更显著的ADCC效应（补充图S2）。荧光标记的选择旨在同时标记乳腺癌细胞（EGFP）并检测细胞死亡（Alexa 647），从而避免多通道分离的需要。实验终点采用荧光标记检测暴露的磷脂酰丝氨酸（一种凋亡标志物）作为读数方式，而非通过监测EGFP荧光强度的下降来随时间评估球状体的存活率，后者也是一种可行方案。Annexin染色能够更准确且灵敏地识别细胞死亡。原则上，可通过引入更多精确的细胞死亡标志物（例如荧光标记的caspase底物）以及明确死亡细胞类型的标记物，进一步优化当前的一维染色方法。
该方法只需进行少量修改，即可用于研究其他效应免疫细胞类型（如巨噬细胞、T细胞以及表达嵌合抗原受体[CAR]的免疫细胞）和激活分子（例如细胞因子、白细胞介素）。为了追求操作的简便性、稳定性和较短的处理时间，我们并未穷尽高内涵筛选（HCA）在此检测中所能提供的所有可能性。成像与分析方案可进一步添加更多的荧光标记。通过加入不同类型的细胞，并使用多重荧光探针以区分这些细胞类型，以及使用特异性荧光标记物将其与正在进行的细胞事件相关联，该检测方法可适用于研究更为复杂的类球体4,5。本方案可适配于任何高内涵成像仪，图像亦可使用任何包含纹理分析模块的图像分析软件进行分析。
本方案的一个关键要点在于使用球状体（spheroids）。因此，必须考虑多个参数。已知与单层培养的细胞相比，三维（3D）培养的细胞对化合物的反应较弱21,22。二维（2D）细胞培养无法&#160;准确预测待测药物在完整生物体内的有效浓度范围。在建立我们的三维模型时，我们测试了高于二维实验中报道的化合物浓度和效靶细胞比（E:T比）。例如，本方案通过将E:T比从我们之前二维ADCC实验中使用的2:117提高至针对癌细胞球状体的20:1，从而实现了优化。这一调整的可能原因是药物难以有效穿透球状体的核心区域，主要作用于外层细胞。另一方面，增加曲妥珠单抗（Trastuzumab）的浓度并未进一步增强ADCC反应（补充图S1）。这种最佳参数的选择可能因细胞系和靶标的不同而有所差异。因此，值得在其他细胞系中测试本方案，例如非HER2阳性乳腺癌细胞系，但需注意HER2表达水平是影响ADCC反应的重要决定因素20。
总之，我们的新方法代表了一种快速且稳健的平台，可用于分析化合物在三维免疫-癌症模型中的作用，具有用于高通量药物筛选的潜力。该方法突显了使用HER2+乳腺癌类球体和NK92.CD16细胞在进一步阐明曲妥珠单抗分子机制方面的重要性，从而为预测曲妥珠单抗依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）在体内的治疗潜力提供了机会in vivo27。寻找新的抗肿瘤免疫调节剂将极大受益于该检测方法。该技术可拓展用于患者来源肿瘤细胞培养物的个体化化疗敏感性测试。我们已证明，传统上用于免疫细胞杀伤和ADCC检测的二维共培养体系可转化为三维类球体检测，从而可能提高其转化相关性。

多细胞肿瘤球体（MCTS）是一种广泛应用的三维（3D）模型，由贴壁细胞因聚集倾向自发形成，是深入理解癌细胞生物学机制的重要工具。可通过多种技术，如基于液体和基于支架的三维培养方法，从多种细胞类型中生成多细胞肿瘤球体。1与单层二维模型相比，其主要优势在于能够重现 体内 肿瘤的结构组织和缺氧特性，通过模拟肿瘤细胞的生物学行为，特别是导致治疗逃逸和药物耐药性的机制2因此，由于多细胞球体（MCTS）能够提高毒性与药物敏感性的可预测性，它们被广泛用于三维癌症研究，并有望促进针对不同类型癌症的有效药物开发。3.
研究任何疾病都需要相关且便捷的模型。建立癌症免疫学研究模型具有挑战性，因为免疫系统由多种细胞类型组成，每种细胞类型又包含多个亚型以及广泛的活化状态。这些不同的免疫细胞类型与癌细胞及其他肿瘤组分相互作用，最终影响疾病的进程。传统的二维体外（2D in vitro）细胞培养方法无法充分模拟这些复杂的细胞间相互作用，因其缺乏可转化性，且无法在系统层面（例如在组织中）预测药物的作用效果4,5。此外，由于人类与小鼠免疫系统之间存在根本性差异，小鼠模型也具有严重局限性。因此，三维（3D）培养系统可填补现有模型中的空白，提供一种替代方法，从而增进我们对癌症免疫学的理解6。特别是类球体模型可用于免疫治疗的测试，主要用于评估药物筛选效率及治疗性抗体增强免疫细胞浸润、并针对类球体靶标产生抗肿瘤效应的能力7。此外，由处于不同代谢和增殖状态细胞构成的多细胞类球体（MCTS）在研究基质细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞）与癌细胞之间的相互作用，以及开发新型抗癌策略方面的潜力已得到充分证实8。因此，迫切需要建立具有预测性和准确性的研究平台，以推动药物筛选进程，并充分考虑肿瘤微环境的病理生理特征。
乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的癌症。这种异质性疾病的临床分类基于跨膜受体的存在情况，例如雌激素（ER）和孕激素（PR）受体（统称为激素受体，HR），以及人表皮生长因子受体2（HER2）蛋白/癌基因的过表达或扩增。根据这些受体的免疫组化表达情况，通常将乳腺癌分为四种亚型：腔面A型（HR+/HER2-）、腔面B型（HR+/HER2+）、HER2阳性型（HR-/HER2+）和三阴性乳腺癌（HR-/HER2-）。HER2阳性型约占乳腺癌病例的10-15%，其特征是HER2高表达且缺乏ER和PR表达，相较于腔面型肿瘤预后更差，需要使用针对HER2/neu蛋白的特异性药物9。
乳腺癌的发展是一个多步骤过程，早期诊断对于成功治疗该疾病至关重要10。然而，尽管近年来出现了个性化的乳腺癌治疗方案（例如内分泌治疗和抗HER2抗体治疗），乳腺癌仍然给肿瘤学家带来挑战。与手术、化疗和放疗一样，这些个性化疗法也可能产生严重不良反应，且患者可能对这些药物产生耐药性，这使得确定最佳治疗策略成为一项长期挑战11,12。因此，深入理解肿瘤与其微环境之间的相互作用至关重要，有望为开发针对不同乳腺癌亚型特异性的新型治疗方法提供新方向13。目前，正在对表达HER2的肿瘤患者广泛研究一系列新型免疫疗法，如抗体-药物偶联物、过继性T细胞疗法、疫苗以及新型靶向HER2的单克隆抗体（mAbs）14。
例如，曲妥珠单抗是 HER2+ 乳腺癌的有效治疗手段。在其作用机制中，曲妥珠单抗介导可结晶片段 γ 受体（FcγR）依赖性活动。FcγR 根据其对 Fc 片段的亲和力以及所启动的免疫应答而有所区分。自然杀伤（NK）细胞上的激活型 FcγRIIIa（CD16A）对于介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）至关重要，而巨噬细胞上的 FcγRIIa（CD32A）和 FcγRIIIa 被激活时，则可诱导抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）。15动物模型研究表明，缺乏 FcγRI（CD64）和 FcγRIII（CD16）受体的小鼠无法启动针对肿瘤特异性抗原的保护性免疫反应，揭示抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）可能是单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）发挥抗肿瘤作用的主要机制16.
由于自然杀伤细胞（NK细胞）依赖于结合在肿瘤细胞上的抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤癌细胞，因此Fc受体的表达对于曲妥珠单抗治疗的有效性至关重要17（图1）。此外，NK细胞的功能受到激活性和抑制性受体（例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体，KIR受体）的共同调控，从而实现有效的功能平衡18。
<img alt="NK细胞通过Fcγ受体与肿瘤细胞相互作用的ADCC过程；免疫学研究用细胞示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1．ADCC在抗肿瘤免疫反应中的作用机制。 自然杀伤（NK）细胞上的Fcγ受体可识别已结合于癌细胞表面抗原的抗体的Fc区。该免疫突触促使NK细胞脱颗粒，释放颗粒酶和穿孔素等细胞毒性介质。这些分子可在靶细胞膜上形成孔道，并激活凋亡通路，从而诱导靶细胞发生程序性死亡（图片由Biorender.com制作）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
针对HER2+乳腺癌的免疫治疗研究正处于不断发展之中。在此背景下，应充分考虑免疫系统各个组分之间的相互作用。此外，既往已有大量研究广泛测试了包括各类传统疗法、免疫疗法或细胞疗法在内的联合治疗方案，以期发现具有协同效应的组合策略19。
既往已有多种HER2阳性乳腺癌（HER2+ BC）的3D模型被用于药物发现。例如，Balalaeva等人利用过表达HER2的SKBR-3细胞球，评估了靶向HER2的免疫毒素4D5scFv-PE40的细胞毒性20。在另一项研究中，建立了一种基于Matrigel的HER2阳性乳腺癌3D培养系统，用于检测细胞在曲妥珠单抗和内分泌药物作用下的生长反应21。这些研究凸显了HER2过表达癌细胞的肿瘤细胞球模型在模拟临床治疗反应方面的重要价值，代表了一种有效提升治疗效果的策略22。
我们课题组先前发现，舒尼替尼（Sunitinib）是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，在二维培养体系中可抑制曲妥珠单抗依赖的JIMT-1 HER2+ 乳腺癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。研究显示，舒尼替尼可诱导自噬，损害自然杀伤（NK）细胞的杀伤功能，下调HER2表达，并增强JIMT-1细胞的表面黏附能力17。
本研究建立了一种新型的三维球形抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）模型（NK.92.CD16+曲妥珠单抗+JIMT-1-EGFP 癌细胞），可用于高通量筛选应用；为验证上述发现，选用舒尼替尼作为模型化合物。首先，我们构建了表达EGFP的JIMT-1细胞17，并由这些细胞形成球状体。通过NK细胞与曲妥珠单抗共同作用诱导ADCC，并将球状体在含或不含待测化合物的条件下培养24小时（图2）。ADCC的定量基于高内涵分析系统检测凋亡癌细胞死亡（Annexin V染色）。
<img alt="ADCC 过程示意图：NK 细胞、肿瘤相互作用、曲妥珠单抗抗体、类球体形成分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2．3D 类球体共培养系统中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 我们的实验设置基于一种 3D 类球体系统，相较于 2D 模型，该系统能更准确地模拟 in vivo 微环境。将 JIMT-1 EGFP 乳腺癌细胞接种于凹形抗细胞黏附底部，使其形成圆形细胞簇，即类球体。随后通过加入 NK92.CD16 自然杀伤细胞（效靶比 E:T = 20:1）和抗 HER2 单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）启动 ADCC 反应。该实验模型已被证实高效且易于应用，可用于筛选调节 ADCC 活性的待测化合物（图片由 Biorender.com 制作）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
我们证明了以这种方式获取数据可实现实时处理，并在癌症药物发现的高内涵筛选中具有统计学稳健性。重要的是，该模型可用于对更大规模的化合物进行扩展验证，并可应用于多种感兴趣的检测方法。

<table><tbody><tr><td>96孔玻璃底细胞培养超微孔板</td><td>PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>LLC 6055302</td><td>用于类球体测量</td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>TPP</td><td>92096</td><td>用于细胞接种</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- MEM 培养基</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>在NK培养基中</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>用于球状体接种</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluo 647 偶联物</td><td>Invitrogen-ThermoFisher Scientific</td><td>A23204</td><td>用于高内涵筛选的细胞凋亡检测</td></tr><tr><td>CD16.176 V.NK-92 细胞</td><td>Kerry S. Campbell 博士（美国宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心，代表加利福尼亚州圣地亚哥 Brink Biologics 公司）</td><td>ATCC CRL-2407</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>细胞示踪蓝</td><td>Invitrogen-Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>C2110</td><td>用于自然杀伤细胞染色</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td>在 JIMT1-EGFP 培养基中</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>用于在转移类球体前包被HCS板</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biosera</td><td>FB-1090/500</td><td>JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>35,050&amp;ndash;061</td><td>在NK培养基中</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1</td><td>GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td></td><td>用于统计分析</td></tr><tr><td>Harmony 软件</td><td>PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>用于HCA</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Proleukin，诺华匈牙利&amp;aacute;ria Kft.，布达佩斯，匈牙利</td><td>PHC0026</td><td>在NK培养基中</td></tr><tr><td>胰岛素（Humulin R）</td><td>Eli Lilly</td><td>HI0219</td><td>JIMT-1-EGFP 培养基</td></tr><tr><td>JIMT-1 乳腺癌细胞</td><td></td><td></td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（MEM-NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11,140&amp;ndash;050</td><td>在NK培养基中</td></tr><tr><td>Na-丙酮酸</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td>在NK培养基中</td></tr><tr><td>Opera Phenix 高内涵分析设备</td><td>PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>HH14001000</td><td>用于HCA</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水）</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Biosera</td><td>LM-A4118</td><td>JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基</td></tr><tr><td>pLP-1、pLP-2、pLP-VSV-G、pWOXEGFP</td><td>Invitrogen，（Prof. J&amp;oacute;zsef T&lt;图片替代文本=&quot;公式 1&quot; 源文本：src=&quot;/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;zs&amp;eacute;r，德布勒森大学</td><td></td><td>用于JIMT-1-EGFP细胞系</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>用于在转移类球体前包被HCS板</td></tr><tr><td>苹果酸舒尼替尼</td><td>SigmaAldrich</td><td>PZ0012</td><td>用于处理</td></tr><tr><td>曲妥珠单抗抗体（人源化抗HER2单克隆抗体）</td><td>Herzuma&amp;reg;，匈牙利布达佩斯 EGIS 制药公司</td><td>NDC-63459-303-43</td><td>用于处理</td></tr><tr><td>曲妥珠单抗-F(ab')2</td><td>Gy教授惠赠&amp;ouml;rgy Vereb 和 &amp;Aacute;rp&amp;aacute;d Sz&amp;ouml;&lt;图片替代文本&quot;公式 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;r&amp;nbsp;</td><td>德布勒森大学生物物理学与细胞生物学系</td><td>用于处理</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>PBS中的1X胰蛋白酶-EDTA</td><td>Biosera</td><td>LM-T1706</td><td>用于细胞脱离</td></tr></tbody></table>

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

基于单克隆抗体的免疫疗法靶向肿瘤抗原现已成为癌症治疗的主要手段。抗体的作用机制之一是抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），即抗体结合癌细胞后，招募免疫系统的细胞组分（如自然杀伤细胞，NK细胞）以杀伤肿瘤细胞。通过鉴定能够增强癌细胞敏感性或提高免疫细胞活性的佐剂化合物，有望提升此类疗法的疗效。此外，癌症患者因既往疾病或癌症相关症状而接受合并用药时，可能产生尚未被发现的药物相互作用，从而影响抗体治疗的效果；因此，需排除此类不良药物相互作用。基于上述目标，我们建立了癌症ADCC模型，并在此描述一种用于筛选ADCC调节药物的简便实验方案。由于三维模型（如肿瘤细胞球状体）在预测方面优于二维培养体系 体内 通过建立表达EGFP的HER2+ JIMT-1乳腺癌细胞与NK92.CD16细胞系的肿瘤球共培养模型，并使用临床批准用于HER2阳性乳腺癌治疗的单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）进行诱导，以评估肿瘤对抗癌治疗的响应。JIMT-1细胞在抗粘附U型底96孔板中培养形成肿瘤球。第3天加入NK细胞和曲妥珠单抗。随后用Annexin V-Alexa 647染色检测细胞凋亡，并利用自动化显微镜定量分析肿瘤球外围区域的凋亡细胞死亡。本实验方法可用于筛选调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的分子，例如证明了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于转移性癌症治疗的受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（Sunitinib）几乎完全抑制ADCC效应。该肿瘤球生成方法及图像采集与分析流程适用于在癌细胞球模型中高通量筛选调节ADCC的化合物。

通过转染表达EGFP的JIMT-1细胞，并由这些细胞生成球状体。选用舒尼替尼作为测试化合物，因其既往已被证明可影响ADCC的过程17。球状体允许聚集培养72小时。在第3天，向球状体中加入10 µg/mL曲妥珠单抗（或等摩尔浓度的6.6 µg/mL TR-F(ab')219）以及NK细胞（效靶比20:1），同时设置或不设置20 µM舒尼替尼预处理1小时，共作用24小时。单独培养的JIMT-1细胞以及与NK细胞（效靶比20:1）共孵育的JIMT-1细胞作为CTL对照。球状体用Annexin V 647染色1小时以检测凋亡性细胞死亡，随后使用高内涵分析仪进行成像。
如Annexin V染色所示，将NK细胞与曲妥珠单抗（Trastuzumab）共同加入JIMT-1细胞后，导致肿瘤类球体发生细胞死亡。Annexin阳性（凋亡）细胞出现在类球体的外周区域，如图3A所示。相比之下，单独加入NK细胞并未引起肿瘤细胞凋亡。为了区分曲妥珠单抗招募抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）的能力与其直接生物学效应，本研究使用缺乏功能性FcR结合能力的TR-F(ab')2作为曲妥珠单抗的阴性对照。由于在该模型中TR-F(ab')2显示无效（图3B），因此该效应很可能是通过ADCC介导的。此外，舒尼替尼（Sunitinib）预处理减少了类球体中的Annexin V染色，证实了舒尼替尼诱导的ADCC耐药性，并揭示了在与NK细胞和曲妥珠单抗共孵育的JIMT-1类球体中，凋亡性细胞死亡受到抑制。
<img alt="3D 球状模型分析、ADCC 效应物影响、Annexin V 647 荧光强度图、细胞凋亡。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3。在 3D 球状模型中检测 ADCC 效应化合物。 使用 JIMT-1-EGFP 细胞生成肿瘤球状体。培养 3 天后，将球状体转移至已预先包被 Pluronic F-127 以防止细胞贴壁的 HCS 培养板中。次日，向孔中加入 10 µg/mL 曲妥珠单抗（TR）（或等摩尔浓度的 6.6 µg/mL TR-F(ab')2 作为阴性对照），以及预先用 Cell Tracker Blue 染色的 NK92.CD16 细胞（效应细胞与靶细胞比例为 20:1），同时设置不含或含有 20 µM 舒尼替尼（SUN）的实验组。单独的 JIMT-1 球状体以及与 NK 细胞共培养（20:1）的 JIMT-1 球状体作为对照组（CTL）。(A) 培养 24 小时后，使用 Annexin V 647（红色）对球状体染色 1 小时，以标记凋亡细胞。(B) 拍摄并分析每种条件下 3 个球状体的图像，测定球状体外围区域（环形区域）Annexin V 647 的荧光强度。柱状图显示 4 次独立实验的结果（均值±标准误）。数据采用 Kruskal-Wallis 检验进行分析，随后进行 Dunn's 事后检验（*p &lt; 0.05，#p &lt; 0.05，ns：无显著性差异）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
这些数据证实舒尼替尼可抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。预计可通过类似方法鉴定出增强ADCC的化合物。总之，我们建立的高内涵筛选（HCS）检测方法可能适用于发现影响ADCC的化合物。
补充图 S1. 优化效应细胞与靶细胞比例（E:T）及曲妥珠单抗浓度。 采用 JIMT-1-EGFP 细胞制备类球体。在第 3 天，将类球体转移至高内涵筛选板中，并以不同的效应细胞与靶细胞比例（20:1、40:1 和 60:1）加入自然杀伤细胞（NK 细胞），同时分别添加 10、20 和 50 µg/mL 的曲妥珠单抗（TR），以确定可最有效诱导类球体细胞死亡的处理条件。对照组（JIMT-1-EGFP）仅加入 JIMT-1 细胞培养基。(A) 处理 24 小时后，用 Annexin V 647（红色）染色 1 小时，通过高内涵分析（HCA）检测凋亡性细胞死亡。直方图显示三次独立实验结果（均值±标准误）。各柱状图表示围绕 JIMT-1 类球体的 Annexin V 647 荧光强度。(B) 对每种条件下 3 个类球体的图像进行分析，测定环形区域 Annexin V 647 的荧光强度。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合 Tukey 事后检验进行统计分析（*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，ns：无显著性差异）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/Supplementary%20Figure%20S1..zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2. 球状体中 JIMT-1 细胞凋亡的评估。 使用 JIMT-1-EGFP 细胞生成球状体。第 3 天，将球状体转移至 HCS 板中，并用 20 µM Sunitinib (SUN) 预处理 1 小时，随后以 20:1 的效靶比加入 NK 细胞，并添加 10 µg/mL Trastuzumab。24 小时后，用 Annexin V 647 染色 1 小时，通过 HCA 检测凋亡性细胞死亡。对每种条件下 3 个球状体的图像进行分析，以评估 Annexin V 647 的荧光强度（对照组：JIMT-1-EGFP；ADCC 组：20:1 NK 细胞 + 10 µg/mL Trastuzumab；ADCC+SUN 组：20 µM Sunitinib + 20:1 NK 细胞 + 10 µg/mL Trastuzumab）。柱状图表示 JIMT-1 球状体周围（环状区域）(A)、整个球状体内部 (B) 以及整个孔板 (C) 的 Annexin V 647 荧光强度。直方图显示三次独立实验的结果（均值±标准误）。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合 Tukey 多重比较检验进行分析（*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，ns：无统计学意义）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/Supplementary%20Figure%20S2..zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。

基于单克隆抗体的免疫疗法靶向肿瘤抗原，现已成为癌症治疗的主要手段。其中一种具有临床相关性的作用机制是……

最有效的靶向癌症治疗之一是基于抗体的疗法，例如抗HER2抗体曲妥珠单抗。曲妥珠单抗的抗肿瘤作用涉及自然杀伤（NK）细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。深入了解调控癌细胞对抗生长因子受体抗体治疗敏感性的机制，特别是与ADCC相关的机制，对于开发新型且更高效的治疗策略可能至关重要。三维模型（如癌细胞球状体）在预测肿瘤对各种抗癌疗法的免疫反应方面表现出更优的效果。因此，我们建立了一种ADCC球状体模型，该模型使用NK92自然杀伤细胞系、表达GFP的JIMT-1乳腺癌细胞以及曲妥珠单抗。我们通过诱导抗HER2阳性的JIMT-1乳腺癌细胞形成称为球状体的三维细胞簇，构建了ADCC检测系统。实验中使用的 JIMT-1 细胞系稳定表达绿色荧光蛋白。我们首先准备用于球体形成的 96 孔板。为了形成 U 形且抗细胞黏附的底部，用含有 0.5% 琼脂糖的 PBS 溶液包被 96 孔板。将培养板在室温下孵育约30至45分钟。在此期间，对JIMT-1细胞进行胰酶消化并计数，用于接种细胞。用两毫升无菌PBS洗涤细胞。向培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，然后将培养瓶放回 CO2 培养箱中孵育 10 分钟。孵育结束后，轻敲培养瓶，检查 JIMT-1 细胞是否已脱落。加入 2 mL JIMT-1 培养基终止消化，并将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。用台盼蓝在布氏计数板中计数细胞，并将细胞浓度调整至每毫升20,000个细胞。通过移液将100微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，用于形成球状体。将细胞在37摄氏度的CO2培养箱中孵育三天，使其聚集形成细胞球。定期使用倒置显微镜检查类球体的大小和形态。在类球体诱导后的第三天，用溶解于DMSO中的Pluronic F-127溶液包被96孔高内涵筛选板。包被步骤至关重要，可防止JIMT-1 EGFP类球体贴附于玻璃表面或培养板上。室温孵育45分钟后，吸去包被液，用无血清DMEM F12培养基洗涤孔板两次。使用1毫升移液器将类球体以每组三个复孔的方式转移至96孔高内涵筛选板中。在每孔中加入10微升浓度为40微摩尔的舒尼替尼，并向对照孔中加入新鲜的JIMT-1培养基，以补足体积。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育平板1小时。在预处理类球体孵育的同时，将NK92细胞从培养瓶中收集至15毫升离心管中。使用台盼蓝在布氏细胞计数板中对细胞进行计数，并调整细胞数量，使效应细胞与靶细胞的比例达到20:1。用10微摩尔的CellTracker Blue溶液对NK细胞进行染色，并将细胞置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育1小时。为洗去多余的染料，在室温下以150 RCF离心NK细胞两次，每次3分钟。然后将细胞重悬于新鲜的JIMT-1培养基中。用移液器将染色的NK细胞沿孔壁每孔加入55微升至靶向JIMT-1 EGFP类球体中，并同时加入抗HER2抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）。用JIMT-1培养基稀释曲妥珠单抗，使其浓度达到每毫升10微克。向对照孔中加入110微升新鲜的JIMT-1培养基，并将培养板置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育24小时。因此，ADCC 实验中添加的处理总体积为 110 微升，最终舒尼替尼浓度为 20 微摩尔每升。为检测和测量处理后的细胞凋亡，使用 Annexin V Alexa Fluor 647 偶联物在 JIMT-1 培养基中对类球体染色一小时。实验步骤完成后，将培养板转移至高内涵分析设备中。在将NK因子加入靶细胞后24小时对培养板进行成像。成像时，我们使用高内涵分析仪和图像分析软件。通过“培养板类型”选项，从培养板列表中选择微孔板的类型。使用96孔高内涵筛选板。选择两个峰值自动对焦，分别对应在使用10倍物镜（数值孔径为0.3）的板式实验中，通过自动对焦和物镜选项进行设置。选择共聚焦模式并启用OptiMode选项，使用Binning选项时应用Binning 2。在对类球体进行成像时，使用“通道选择”选项选择适当的通道。为检测转染EGFP的JIMT-1细胞，请选择EGFP通道，设置参数为200毫秒积分时间、50%激光功率、2微米层厚、488纳米激发波长以及500、550纳米发射波长。为检测凋亡细胞，请使用Alexa 647通道，设置参数为100毫秒积分时间、50%激光功率、10微米层厚、640纳米激发波长以及650、760纳米发射波长。为了观察类球体中的自然杀伤细胞（NK细胞），请选择以下通道参数：DAPI，积分时间为100毫秒，激光功率为50%，层厚为2微米，激发波长为405纳米，发射波长为435纳米和418纳米。在“布局选择”选项中，选择Z轴层扫（Z stacks），因为类球体中的细胞通常位于显微镜的不同焦平面上。以10微米的间距采集10个层面，足以覆盖整个类球体区域。将第一层面和最后一层面的值分别设置为 0 微米和 90 微米。在开始测量之前，可使用“快照”功能拍摄样本图像，以检查设置是否正确。使用“定义布局”选项设置成像所需的孔数和视野数。通过EGFP荧光识别球状体，或使用“精细纹理区域”选项识别JIMT-1细胞，并按大小进行筛选。使用“选择群体”模块去除边缘物体。由于Annexin阳性细胞出现在球状体外围，因此在凋亡环区域测量Annexin的荧光强度。在“选择区域”模块中，将外边框设置为负90。以平均强度表示Annexin的强度值。根据Annexin V染色结果，向JIMT-1细胞中添加NK细胞和曲妥珠单抗可导致肿瘤类球体发生细胞死亡。在类球体的周边区域出现了膜联蛋白阳性的凋亡细胞。然而，在缺乏曲妥珠单抗的情况下，自然杀伤细胞并未引发肿瘤细胞凋亡。为了区分曲妥珠单抗的直接作用与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应，本研究采用缺乏Fc区结合能力的曲妥珠单抗Fab2片段作为阴性对照。由于在此模型中 trastuzumab-Fab2 无效，肿瘤细胞死亡可能通过 ADCC 介导。此外，舒尼替尼预处理降低了球状体中 Annexin V 的染色强度，证实舒尼替尼可诱导 ADCC 抵抗，并揭示在与 NK 细胞和曲妥珠单抗共同孵育的 JIMT-1 球状体中，细胞凋亡性死亡受到抑制。该数据证实了舒尼替尼在 ADCC 模型中的细胞保护作用，提示在联合使用基于 ADCC 的免疫治疗与舒尼替尼时应保持谨慎。总之，我们的高内涵筛选（HCS）检测方法可能适用于鉴定增强ADCC效应的化合物。

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