Name: 在细胞周期的 G1 期可视化单链 DNA 病灶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习利用RPA2免疫荧光染色技术在RPE1细胞中可视化G1期单链DNA病灶。该方法通过细胞周期同步化和过氧化氢处理，为研究DNA损伤修复机制提供了高信噪比的新工具。

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作者感谢Michele Pagano提供的支持与有益的见解，感谢Ashley Chui和Sharon Kaisari对稿件的审阅，以及Jeffrey Estrada和Vilma Diaz的持续支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助项目GM136250多样性补充资助的支持。

1. hTERT永生化视网膜色素上皮细胞（RPE1）的培养与维持
<ol>
	<li>在含10%热灭活胎牛血清（Hi-FBS）和100 µg/mL青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（以下简称培养基）中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养RPE1细胞系。常规传代时，将RPE1细胞培养于15 cm组织培养处理皿中，当细胞融合度达到80–90%时进行传代（约每15 cm培养皿16–18 × 106个细胞）。</li>
	<li>传代时，吸除培养基，并用10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。</li>
	<li>加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖整个培养皿表面。将细胞在37 °C下孵育，直至细胞脱落。</li>
	<li>胰酶消化后，用培养基重悬细胞，在室温（RT，22–25 °C）下以150 × g离心5分钟。弃上清液，轻轻将细胞重悬于10 mL培养基中。</li>
	<li>将1.6–1.8 × 106个细胞接种至新的15 cm培养皿中（约1 mL细胞悬液）。 
	&#8203;注意：所有组织培养操作均应在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。胰酶消化的孵育时间取决于细胞融合度。通常，90%融合的培养皿需2–3分钟即可完成消化。应定期使用 commercially available试剂盒检测支原体（Mycoplasma）污染（参见材料表中的示例）。</li>
</ol>
2. 目的基因（GOI）的siRNA敲低
<ol>
	<li>转染前一天，将 1.0 × 106 个 RPE1 细胞接种至一个 10 cm 组织培养处理培养皿中，加入 10 mL 培养基。</li>
	<li>转染当天，制备 siRNA 复合物。对于 10 cm 培养皿，使用终浓度为 20 nM 的 siRPA2 和 12 µL 脂质类转染试剂，溶于 500 µL 低血清转染培养基中。轻轻弹动离心管混匀所有组分，在室温（22–25 °C）孵育 5 分钟。</li>
	<li>将形成的 siRNA 复合物混合液逐滴加入细胞中，与细胞共孵育 48 小时。</li>
</ol>
3. 将RPE1细胞同步至G0期
<ol>
	<li>按照第1节所述方法，对步骤2.3中的RPE1细胞进行胰蛋白酶消化处理（约2 × 106 个细胞）。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温（22–25 °C）下以150 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用12 mL PBS重悬细胞，在室温（22–25 °C）下以150 × g 离心5分钟。重复弃去上清液及离心操作两次。</li>
	<li>将细胞重悬于10 mL无血清DMEM培养基中，该培养基需添加100 μg/mL青霉素-链霉素、&#160;1 mM丙酮酸钠和15 mM HEPES，并将细胞接种至10 cm组织培养皿中。 
	注意：若细胞易发生聚团，可先将细胞重悬于1 mL无血清DMEM中，使用P1000枪头反复吹打5次以分散细胞团块，再将悬液稀释至终体积10 mL。</li>
	<li>血清饥饿处理24小时后，按照第2节所述方法，向处于血清饥饿状态的细胞中加入siRNA复合物，进行第二轮基因沉默处理。</li>
	<li>在进行G1期释放前，将RPE1细胞继续在无血清DMEM培养基中培养72小时。</li>
</ol>
4. 盖玻片包被及将细胞释放至G1期
<ol>
	<li>用70%乙醇对镊子进行灭菌，并将单个玻璃盖玻片（直径12 mm，#1.5厚度[0.17 mm]）放入24孔板的一个孔中。</li>
	<li>用PBS稀释玻璃粘连蛋白（vitronectin）包被基质，使其终浓度为10 µg/mL。向每个含有盖玻片的孔中加入500 μL vitronectin溶液，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>移除包被溶液，并用1 mL PBS洗涤盖玻片。</li>
	<li>用PBS洗涤后，在37 °C下使用1 mL 0.05%胰蛋白酶处理1分钟，使血清饥饿的RPE1细胞从10 cm组织培养处理板上脱离。 
	注意：血清饥饿后细胞脱落速度显著加快。用PBS洗涤细胞时应小心操作，并使用较短的胰蛋白酶消化时间。</li>
	<li>为灭活胰蛋白酶，将RPE1细胞重悬于总共6 mL培养基中。通过在室温（22–25 °C）下以150 × g 离心5分钟，去除灭活的胰蛋白酶。</li>
	<li>将细胞重悬于1 mL培养基中，并测定细胞数量。</li>
	<li>在总共500 μL培养基中，将4 × 104个RPE1细胞接种至包被的盖玻片上。 
	注意：在进行后续实验步骤前，确保细胞活力高于90%。可在细胞计数过程中通过台盼蓝染色快速评估细胞活力。</li>
	<li>细胞接种至培养基中6小时后，G0期释放的细胞将处于早期G1期。应在细胞开始进入S期前的6–12小时窗口期内，在G1期进行实验操作。</li>
	<li>在诱导DNA损伤前，将细胞在培养基中加入10 μM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），于37 °C脉冲标记30分钟。</li>
	<li>移除含EdU的培养基，并用10 μM胸腺嘧啶在37 °C继续培养10分钟，以防止在DNA损伤诱导期间残留EdU的进一步掺入。</li>
	<li>移除含胸腺嘧啶的培养基，并在培养基中加入250 μM H2O2处理细胞1小时。</li>
</ol>
5. 单链DNA的免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 1 mL 室温（22–25 °C）PBS 洗涤细胞一次，以去除培养基和血清成分。 
	注意：洗涤细胞时动作要轻柔，避免细胞脱落或干燥。不要同时处理过多孔板。</li>
	<li>预提取：将洗涤后的细胞在 1 mL CSK 提取缓冲液（表 1）中孵育 5 分钟，室温（22–25 °C）。 
	注意：CSK 预提取可去除所有非染色质结合的蛋白质，包括可溶性 RPA2。 
	警告：Triton X-100 如吞食有害，可能引起皮肤刺激和眼部损伤。</li>
	<li>移除 CSK 缓冲液，直接加入含 0.05% Triton X-100 的 0.5 mL 3.6% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS）固定细胞，室温（22–25 °C）孵育 10 分钟。 
	警告：必须使用 32% 多聚甲醛母液新鲜配制 3.6% PFA。多聚甲醛可能造成严重眼部损伤、皮肤刺激和呼吸道刺激。</li>
	<li>用含 0.05% Triton X-100 的 1 mL PBS 洗涤细胞一次，以去除多聚甲醛。</li>
	<li>使用含 0.5% Triton X-100 的 1 mL PBS 进一步透化细胞，室温（22–25 °C）孵育 15 分钟。</li>
	<li>EdU 点击化学反应以标记复制期细胞（S 期）
	<ol>
		<li>移除透化液，用 1 mL 封闭缓冲液（表 1）洗涤细胞两次。 
		警告：牛血清白蛋白（BSA）可能引起呼吸道刺激。</li>
		<li>加入 1 mL 封闭缓冲液（表 1），将含盖玻片的培养板在室温（22–25 °C）轻轻摇晃孵育 10 分钟。</li>
		<li>移除封闭缓冲液，加入含 picolyl azide 647 的 500 μL 点击反应混合液（表 1）。盖玻片在室温（22–25 °C）轻轻摇晃孵育 30 分钟，并在避光条件下进行后续孵育步骤。 
		注意：若使用 BrdU 抗体，应按照制造商推荐，使用双倍体积（1 mL）和双倍时间（60 分钟）进行点击反应，以确保反应饱和并充分标记掺入的 EdU，从而降低 BrdU 抗体的交叉反应性27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除点击反应混合液，用含 0.05% Triton X-100 的 PBS 洗涤细胞两次，每次 10 分钟，室温（22–25 °C）（图 1 和 图 2）。</li>
	<li>加入 1 mL 封闭缓冲液，室温（22–25 °C）孵育 30 分钟。也可将细胞在封闭缓冲液中 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>在 250–500 μL 封闭缓冲液中加入一抗（抗 RPA2 大鼠抗体，1:1,000 稀释），室温（22–25 °C）孵育 2 小时，轻轻摇晃。</li>
	<li>用含 0.05% Triton X-100 的 PBS 洗涤细胞两次，快速去除大部分抗体溶液。</li>
	<li>继续用封闭缓冲液在室温（22–25 °C）洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在 250–500 μL 封闭缓冲液中加入二抗（抗大鼠 Alexa-488，1:1,000 稀释），室温（22–25 °C）孵育 2 小时，轻轻摇晃。</li>
	<li>用封闭缓冲液洗涤细胞两次，快速去除大部分二抗。再用含 0.05% Triton X-100 的 PBS 在室温（22–25 °C）洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>为进行细胞核复染，用含 0.05% Triton X-100 和 1 μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 PBS 洗涤细胞一次，室温（22–25 °C）孵育 10 分钟。再用 PBS 洗涤一次，室温（22–25 °C）孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用 10 μL 封片剂/盖玻片将盖玻片封固于显微镜载玻片上。封片前将盖玻片浸入蒸馏水中，以去除盐结晶。次日进行成像，并将样本在 4 °C 保存数周（图 3）。</li>
</ol>
6. 图像采集与定量分析
<ol>
	<li>为获取图像，可使用配备常规滤光片组的落射荧光显微镜，对DAPI、FITC和Cy5通道进行成像，放大倍数至少为60–63倍，配备高数值孔径油镜，以观察细胞核内焦点结构。 
	注意：DAPI的最佳激发波长约为359 nm；Alexa 488的激发波长约为488 nm；Alexa 647的激发波长约为647 nm。</li>
	<li>进行图像分析时，在Fiji/ImageJ中打开图像文件。
	<ol>
		<li>利用DAPI染色生成细胞核掩膜（图4A–F及补充视频S1）。
		<ol>
			<li>打开DAPI图像。</li>
			<li>选择 Process | Enhance Contrast ，并将 saturated pixel 设置为 0.35。</li>
			<li>点击 Process | Binary | Convert to Mask。选择 Binary | Fill Holes，然后点击 Analyze | Analyze Particles。将 size 设置为 10-Infinity。</li>
			<li>在 ROI manager 中，点击 Show all。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在细胞核内识别RPA2焦点（图4G、H 及 补充视频S1）
		<ol>
			<li>打开RPA2图像。</li>
			<li>选择 Process | Find Maxima。将 prominence 设置为可清晰显示RPA2焦点的数值（介于500至750之间），以将其与背景信号区分开。</li>
			<li>最后，在 ROI Manager 中点击 Measure 按钮。</li>
			<li>通过将 RawinDen 列中的数值除以 255 （每个焦点像素强度的最大值），计算细胞核内单链DNA焦点的总数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用首选的统计分析软件进行统计分析。 
		注意：在分析中应排除所有EdU阳性细胞以及分割不准确的DAPI掩膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Detection of G1 Phase Single-Stranded DNA Foci via RPA2 Immunofluorescent Staining

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<li>Gutierrez, R., O'Connor, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+direct+reversal+repair+and+alkylating+agent+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance.</a> Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).</li>
<li>Krokan, H. E., Bjoras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Base excision repair.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583(2013).</li>
<li>Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+nucleotide+excision+repair+and+its+roles+in+cancer+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).</li>
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<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
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作者声明无竞争利益。

维持健康且无支原体污染的细胞培养对于上述所有实验都至关重要。在常规培养基条件下，RPE1细胞能够牢固地贴附于组织培养处理过的塑料器皿表面；然而，当细胞处于无血清条件时，其贴附特性会显著减弱。此外，为了在显微镜下获得单链DNA（ssDNA）焦点的高分辨率图像，需将细胞接种于厚度为0.17 mm的盖玻片上，而该盖玻片的亲水性不足以支持RPE1细胞的正常贴附。若细胞未能充分铺展并均匀分布，则很难清晰观察到单个ssDNA焦点。因此，在将细胞释放进入G1期后，选择合适的包被材料（例如纤连蛋白）并给予足够的时间（6–12小时）使其充分铺展和贴附，显得尤为关键。
该实验方案中一个具有挑战性的环节是获得均一的G1期同步化RPE1细胞。这需要两个关键步骤。首先，为了实现有效的血清饥饿，必须将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS充分洗涤，并直接使用无血清培养基接种到新的组织培养皿中。若直接在组织培养皿中洗涤细胞以去除血清，则无法实现高效的G0期同步化。其次，在将细胞释放进入G1期时，必须再次进行胰蛋白酶消化，并将细胞接种至新的组织培养板中。类似地，仅更换培养基并在原有培养皿中添加含血清培养基，无法实现细胞同步进入G1期。此外，为了实现适当的G1期进入，接种在包被盖玻片上的细胞密度必须达到特定的融合度水平。尽管完全的细胞同步化通常难以实现，但此处所述的同步化方案可获得约97%纯度的G1期细胞群体。建议在直径为12 mm的盖玻片上接种RPE1细胞的密度为约4 × 104，以获得适合成像的均一视野，此时细胞融合度约为70%。过高的接种密度会导致细胞在CSK提取后发生脱落和&#34;剥离&#34;现象，从而在图像采集过程中产生较高的背景信号。
为了降低背景信号并获得理想的信噪比，每次一抗和二抗孵育后的充分洗涤至关重要。由于需要进行多次洗涤步骤，因此还必须防止每个洗涤步骤中孔板干燥。我们通过在所有洗涤和孵育步骤中加入至少0.05%的Triton X-100来最大限度地减少这一人为假象。一旦孔板干燥，细胞将表现出异常的信噪比，在显微镜下呈现马赛克样模式，可能干扰结果评估。结合去卷积的Z轴层析成像有助于捕获不同焦平面上的焦点信号，从而提高分析质量。
传统方法依赖于在非变性条件下检测掺入的 BrdU。然而，这些方法需要对细胞进行预处理，使用高剂量的 BrdU 至少孵育 1–2 天（或相当于所用细胞系完整细胞周期的时间），以确保基因组中均匀掺入。但大量掺入 BrdU 可能导致细胞周期干扰36。为克服这些局限性，本方法利用内源性 RPA2 来检测单链 DNA（ssDNA）焦点。该方法无需依赖复制过程中的 BrdU 掺入，因此也可用于有丝分裂后的细胞。由于无需大量掺入 BrdU，该方法节省了时间并降低了实验复杂性。通过使用 RPA2 染色来可视化单链 DNA，我们可同时利用 2′-脱氧-5-乙炔基尿苷（EdU）和点击化学技术标记 DNA 复制，避免 BrdU 抗体与 EdU 之间可能发生的交叉反应27,37,38。在进行点击反应时，必须特别注意对掺入的 EdU 进行适当封闭，以防止 BrdU 抗体与 EdU 发生交叉反应27,39。
最后，使用 RPA2 而非 BrdU 的一个重要优势在于，与 S 期以外的 BrdU 染色相比，其信噪比显著更高。我们发现，即使在复制中的细胞中，非变性 BrdU 染色及其对单链 DNA（ssDNA）的可视化能力也仅限于 S 期（图 2）。BrdU 抗体仅能结合暴露充分的单链 DNA 区段中的 BrdU。而包括 RPA2 在内的修复蛋白与单链 DNA 区段的结合，可能会抑制或阻碍 BrdU 在单链 DNA 中的充分暴露。我们还发现，使用 BrdU 抗体进行单链 DNA 可视化时，CSK 预提取步骤是必需的。这是因为只有去除与单链 DNA 轨道松散结合的蛋白质组分后，抗体才能接触到这些区域。
然而，该实验方案存在一些局限性。使用 RPA2 检测单链 DNA 的一个局限性在于需要优化 CSK 预提取步骤。在固定细胞之前，必须将未结合的过量 RPA2 从 DNA 上洗脱。一方面，提取不足会导致背景信号升高，原因是未结合到单链 DNA 上的 RPA2 蛋白组分未能被充分去除；另一方面，过度提取则会导致信号丢失。而对于 BrdU 检测而言，这一变量并不存在，因为 BrdU 稳定地整合到 DNA 中，不会被预提取步骤洗脱。因此，必须仔细考虑 CSK 预提取的时间、缓冲液中 Triton X-100 的浓度、液体体积以及预提取操作的温度。此外，CSK 预提取也限制了通过细胞核大小来区分 G0/G1 期细胞与 S/G2 期细胞的应用。
此外，我们不能排除部分RPA2信号可能来源于其与其他染色质结合蛋白相互作用分子的结合。还必须考虑RPA2抗体的物种特异性。本实验方案中使用的抗体可识别人、小鼠、大鼠、仓鼠和猴的RPA2。该方法的另一个局限性在于，并非所有细胞系均可通过血清饥饿实现G0期同步化。大多数癌细胞系能够绕过细胞周期检查点，即使在缺乏血清的培养基中也能持续增殖。尽管血清饥饿具有不引起DNA损伤的优势，但仍需仔细监测细胞同步化效率，以确保实现目标细胞周期时相的有效富集。对于对血清剥夺无响应的细胞，应考虑其他细胞同步化方法（例如有丝分裂摇落法、CDK1抑制以实现G2期阻滞，或如离心淘析等非侵入性技术）。另一种可能的方法是采用高内涵成像技术，检测EdU掺入量和细胞核DNA含量，从而对非同步化细胞进行细胞周期分析31。在选择替代性同步化方法时，必须评估其对后续分析可能产生的干扰。例如，文献中常用的双胸苷阻断法或阿非迪霉素（aphidicolin）处理会引发复制应激和DNA损伤40。
DNA修复机制的研究在癌症和细胞生物学领域持续受到广泛关注。本文介绍的实验方案为细胞制备提供了一种有效的方法，可在细胞暴露于DNA损伤剂后实现单链DNA（ssDNA）的可视化和定量分析。该方案特别强调使用单链DNA结合蛋白RPA2，展示了其在检测微量ssDNA焦点时的高度特异性，并可在细胞周期的所有阶段避免非特异性交叉反应。使用RPA2具有多种优势，尤其适用于希望分析细胞周期G1期细胞的研究人员。本方案还考虑了若干局限性，并针对使用RPA2或BrdU染色检测ssDNA时可能出现的信号干扰、非特异性背景噪声及交叉反应问题提出了相应的解决方案。

为了维持生命，细胞会持续监测并修复DNA，以保持其基因组的完整性。细胞可能由于内源性（如氧化、烷基化、脱氨基、复制错误）和外源性（如紫外线、电离辐射）的DNA应激因素而积累多种类型的DNA损伤。若这些损伤未能得到修复，将导致细胞凋亡、细胞周期阻滞或细胞衰老，并可能引发疾病1。DNA损伤可通过以下主要DNA修复通路进行处理：DR（直接逆转修复），主要修复烷基化碱基2；BER（碱基切除修复），针对非大体积碱基错误和单链DNA断裂（SSBs）3；NER（核苷酸切除修复），用于纠正大体积、扭曲双螺旋结构的DNA损伤4；MMR（错配修复），主要靶向DNA错配、插入/缺失环（IDLs）以及某些碱基损伤5；NHEJ（非同源末端连接）和HRR（同源重组修复），两者均作用于双链DNA断裂（DSBs）6；以及TLS（跨损伤合成），是一种DNA损伤旁路机制7。尽管这些通路具有不同的底物特异性，但它们之间存在一定重叠，以确保修复过程的冗余性和高效性。了解不同DNA修复通路在细胞周期各阶段的作用至关重要，因为这些DNA修复因子可能成为治疗癌症、衰老及神经退行性疾病的重要治疗靶点8,9。
单链DNA（ssDNA）在整个细胞周期中都会产生，这是由于内源性和外源性DNA损伤剂引起的DNA损伤修复所致。在基因毒性应激条件下，ssDNA在S期和G2期大量生成，这两个时期同源重组修复（HRR）和错配修复（MMR）的活性最高，且当复制机器遇到DNA损伤时会发生停滞或崩溃6,10,11。其他DNA修复通路（例如，非同源末端连接[NHEJ]、微同源介导的末端连接[MMEJ]、单链退火[SSA]）在双链断裂（DSB）修复过程中也会产生ssDNA12。这些ssDNA片段通常来源于DNA切除过程，该过程由外切核酸酶（如HR和MMR过程中的EXO1、DNA2和CtIP）、内切核酸酶（如核苷酸切除修复[NER]中的XPF和XPG）或碱基切除修复（BER）中POLB与FEN1的协同作用所介导4,13,14,15,16,17,18,19。由于复制机器的工作，在PCNA结合的复制聚合酶前方，DNA解旋酶解开DNA双链时也会生成ssDNA片段20。相比之下，在G1期，由于缺乏HRR和DNA复制活动，且MMR活性有限，所产生的ssDNA片段数量较少，因此更难以检测10,11,21。
细胞内的单链DNA（ssDNA）区域是高度敏感的结构，必须加以保护以避免双链断裂（DSBs）的形成。这一保护作用通过RPA蛋白包被ssDNA区域来实现。RPA是一种丰度较高的异源三聚体蛋白复合物，由多个亚基（RPA1、RPA2和RPA3，也分别称为RPA70、RPA32和RPA14）组成，这些亚基在整个细胞周期中普遍表达22。每个RPA亚基均含有一个DNA结合结构域（DBD），可与4–6个核苷酸相互作用，而各亚基共同形成稳定的三聚化核心。总体而言，RPA能够以亚纳摩尔亲和力结合约20–30个核苷酸23,24。
传统方法利用免疫荧光（IF）显微技术，通过 BrdU 抗体标记基因组 DNA 中掺入的 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），从而可视化单链 DNA（ssDNA）焦点25。该方法基于 BrdU 抗体仅能识别暴露的单链 DNA 中 BrdU 的特性25。尽管该方法操作简便，但仍存在某些局限性。例如，细胞需在实验开始前进行预处理以掺入 BrdU，这一过程耗时较长，且可能干扰下游效应分子。因此，基于 BrdU 的单链 DNA 检测仅限于增殖细胞，无法用于静息细胞。这使得该方法无法应用于非增殖细胞中 DNA 修复的研究，而后者在癌症和神经退行性疾病等多种疾病中具有重要意义5,26。此外，由于 BrdU 与 EdU 的结构非常相似，大多数 BrdU 抗体对 EdU 存在交叉反应性，在进行双重标记实验时必须考虑这一因素27。已有研究利用 RPA 染色显示 ssDNA 焦点，主要集中在 S 期细胞；然而，部分文献也成功将其应用于 S 期以外的细胞周期阶段28,29,30,31,32,33,34,35。本方案有效利用了 RPA 的特性，可在细胞周期 G1 期（尽管也可用于所有细胞周期阶段）DNA 损伤后实现 ssDNA 焦点的可视化。

<table><tbody><tr><td>α-微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6074</td><td>一抗（1:5,000）</td></tr><tr><td>Axio Observer 倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Bis-Tris Plus Mini 蛋白凝胶，4-12%</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>NW04127BOX</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>001-000-162</td><td>封闭剂</td></tr><tr><td>BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>核苷酸类似物</td></tr><tr><td>BrdU 抗体 BU1/75</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>一抗（1:500）</td></tr><tr><td>CellAdhere 稀释缓冲液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07183</td><td>包被试剂</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU 流式细胞术检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>C10632</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 647 染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10640</td><td>点击反应试剂盒</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5892791001</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Countess 3 自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>neuVitro</td><td>GG12PRE</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>周期蛋白 A2 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-271682</td><td>一抗（1:1,000），用于免疫荧光和 Western Blot</td></tr><tr><td>周期蛋白 B1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td>一抗（1:5,000）</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>溶剂对照</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 HEPES</td><td>Gibco</td><td>12430051</td><td>RPE 细胞培养基</td></tr><tr><td>DPBS，无钙，无镁&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>本实验方案中使用的 PBS</td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>bp220-1</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 系列落射荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10637</td><td>核苷酸类似物</td></tr><tr><td>Falcon 24 孔板</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>351147</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>Falcon 组织培养皿 100 mm</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>353003</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）</td><td>NIH</td><td>版本 1.54f</td><td>软件与算法</td></tr><tr><td>FxCycle PI/RNase 染色液</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>F10797</td><td>PI 染色</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>二抗（1:1,000）</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A48262</td><td>二抗（1:1,000）</td></tr><tr><td>组蛋白 H3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>一抗（1:10,000）</td></tr><tr><td>hTERT RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>试剂</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>试剂</td></tr><tr><td>羟基脲，98% 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8627-5G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-575-020</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Lipfectamine RNAiMAX 转染试剂</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>13778150</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>氯化镁溶液 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td>试剂</td></tr><tr><td>MycoFluor</td><td>Thermo Fisher</td><td>M7006</td><td>支原体检测试剂盒</td></tr><tr><td>链霉菌来源的新生霉素（Neocarzinostatin）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9162-100UG</td><td>试剂</td></tr><tr><td>NuPage MES SDS 电泳缓冲液（20x）</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>NP0002</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>onTARGETplus 人 RPA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-017058-01-0005</td><td>siRNA</td></tr><tr><td>p27 抗体</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>610241</td><td>一抗（1:1,000）</td></tr><tr><td>多聚甲醛水溶液（32%）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-980-494</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>PARP1 抗体</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9542S</td><td>一抗（1:1,000）</td></tr><tr><td>PCNA 抗体</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>13110S</td><td>一抗（1:2,000）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>pH3 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3377S</td><td>一抗（1:2,000）</td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4906837001</td><td>试剂</td></tr><tr><td>PIPES 缓冲液 0.5 M 溶液，pH 7.0</td><td>Bioworld</td><td>41620034-1</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope 预染蛋白标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>1610395</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>版本 10</td><td>统计分析与作图</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>低血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>Rpa32/rpa2 抗体（小鼠）</td><td>EMD Millipore</td><td>NA19L</td><td>一抗（1:1,000），用于 Western Blot</td></tr><tr><td>Rpa32/rpa2 抗体（大鼠）</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>2208S</td><td>一抗（1:1,000），用于免疫荧光</td></tr><tr><td>氯化钠溶液（5 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>试剂</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>十水合四硼酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3535-500G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce DAPI 核复染剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>核酸染料</td></tr><tr><td>胸苷，粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1985-1G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100 水溶液（10%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Gibco</td><td>1540054</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07180</td><td>包被试剂</td></tr><tr><td>ZE5 细胞分析仪</td><td>Bio-Rad</td><td>na</td><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

可视化细胞周期g1期中的单链dna焦点

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA具有特定的细胞修复通路，能够应对由内源性和/或外源性因素引起的损伤。DNA修复需要多种蛋白质协同作用，这些蛋白质负责从识别和信号传递DNA损伤，到最终对其进行物理修复等一系列广泛的任务。在此过程中，常常会形成单链DNA（ssDNA）片段，随后由DNA聚合酶将其填补。这些ssDNA片段的特征（包括长度和数量）以及参与填补这些空隙的聚合酶类型，均具有特定的修复通路依赖性。对这些ssDNA片段的可视化有助于我们理解DNA修复机制中复杂的动态过程。
本方案提供了一种详细的制备G1期同步化细胞的方法，用于检测基因毒性应激下单链DNA（ssDNA）焦点的形成。通过一种易于使用的免疫荧光方法，我们对复制蛋白A复合物（RPA）的组分RPA2进行染色，从而可视化ssDNA。RPA2可结合并稳定在基因毒性应激或DNA复制过程中产生的ssDNA中间体，从而调控DNA修复及DNA损伤检查点的激活。同时使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色来标记DNA复制，以排除处于S期的细胞。本方案为传统的非变性5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）检测方法提供了一种替代方案，更适用于S期以外时期ssDNA焦点的检测。

为克服在G1期检测单链DNA（ssDNA）的局限性，我们采用了RPA2，该蛋白可增强ssDNA焦点检测的特异性和信号强度35为了实现精确的细胞同步化，我们采用了RPE1细胞，该细胞可通过血清饥饿法高效地同步至G0期。随后，通过在血清剥夺后重新添加血清，可诱导细胞重新进入细胞周期。为验证同步化效率，我们使用EdU对细胞进行标记，并用碘化丙啶对DNA含量进行染色。进一步通过流式细胞术获取定性和定量结果补充图 S1A）。点图显示，经过72小时的血清饥饿后，约98%的细胞处于G0期。在加入含血清培养基培养6小时后，细胞重新进入细胞周期（表现为p27水平升高） 图1A)，其中约97%的细胞处于G1期，而仅有 &lt;S 期细胞占 1% &lt;2% 的细胞处于 G2 期（补充图 S1A）。在向细胞中加入血清 20–28 小时后，细胞逐渐通过 S 期，流式细胞术图谱结果如图所示（补充图 S1A）。该细胞同步化方案可获得约97%纯度的G1期细胞群体（血清饥饿72小时后，添加血清6小时）。为进一步验证同步化效率，我们通过Western印迹检测了血清释放后细胞周期标志物的表达情况图1A 和 补充图 S1B）同时进行EdU掺入实验以可视化DNA复制。EdU染色还可显示细胞周期同步效率以及G1期中无DNA复制的现象。图1B，C).
检测哺乳动物细胞中单链DNA（ssDNA）的传统方法依赖于检测ssDNA中的BrdU。图2A显示，在H2O2和新制癌菌素（neocarzinostatin, NCS）处理后，仅在S期细胞中可检测到BrdU焦点，而在非S期细胞中则无法检测到ssDNA焦点。BrdU抗体染色还显示出明显的核仁背景信号，该信号可在所有细胞核中检测到，且不受细胞周期阶段或所施加处理的影响。使用本文所述的EdU点击化学检测方法时，我们未能检测到EdU与BrdU焦点的共定位，这在图2A的未处理样本中尤为明显。为彻底排除由交叉反应引起的任何BrdU信号，我们避免使用EdU标记，转而采用cyclin A2作为S-G2期标记物。然而，cyclin A2染色不允许进行CSK预提取；在此条件下，即使在基因毒性应激后也未观察到任何BrdU焦点（补充图S2A）。这表明，CSK预提取对于基于抗BrdU抗体的ssDNA染色是必需的。作为对照，我们在变性条件下检测了BrdU抗体染色。该处理可打开DNA结构，暴露掺入的BrdU，结果显示BrdU呈均匀掺入状态（补充图S2B）。
相比之下，RPA2 染色显示 NCS 和 H2O2依赖的焦点形成不仅发生在S期，也发生在其他细胞周期阶段（图2B）。作为对照，我们还用羟基脲（HU）处理细胞，HU仅在正在进行复制的细胞中引起单链DNA（ssDNA）的积累。与预期一致，仅在EdU阳性细胞中，HU处理后使用RPA2抗体检测到信号增加，凸显了该方法的特异性。RPA2抗体还可检测在无外源性基因毒性应激情况下复制过程中自然发生的单链DNA形成。图2B）。RPA2 抗体的高度敏感性促使我们尝试将其应用于 G1 期，因为在该时期，传统的 BrdU 染色在基因毒性应激条件下无法检测到任何信号补充图 S2C). 图3A 表明 H 诱导后 ssDNA 焦点的形成2O2 使用抗RPA2抗体检测时，即使在G1期也能观察到处理效应。经H处理后，这些细胞核中的RPA2焦点数量显著增加2O2 处理图3B）。这些信号焦点特异性地来自RPA2，因为RPA2的沉默消除了免疫荧光信号（图 3A，B). 图3C 和 补充图 S1C 显示这些细胞中RPA2沉默的效率。与传统方法相比，基于RPA2的单链DNA检测具有高度敏感性，因此其应用可扩展至G1期细胞。
<img alt="细胞周期蛋白分析；荧光显微镜图像；Western印迹；EdU实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：RPE1细胞经血清饥饿处理后的同步化效率。 （A）免疫印迹显示非同步化、G1期和S期同步化的RPE1细胞中所示蛋白的表达水平。（B）代表性图像显示非同步化、G1期和S期同步化的RPE1细胞，在固定前用10 µM EdU孵育30分钟，并通过Click-IT反应进行可视化。使用DAPI对细胞核DNA进行复染。比例尺 = 50 µm。（C）柱状图显示通过DAPI计数的EdU阳性细胞占总细胞群体的百分比。误差线代表均值的标准误，分析的细胞核数量如下：AS n = 219，G1 n = 630，S n = 437。缩写：RPE1 = hTERT永生化视网膜色素上皮细胞；AS = 非同步化；EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用DAPI、EdU、ssDNA（BrdU/RPA2）免疫荧光显微镜进行细胞周期分析的结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：DNA损伤后使用BrdU抗体或RPA2抗体检测ssDNA。 （A）代表性图像显示使用αBrdU（绿色）检测到的ssDNA灶，S期细胞通过EdU（紫色）标记，DAPI用于复染核DNA（蓝色）。RPE1细胞在任何额外处理前，持续在10 µM BrdU中培养48小时。48小时后，细胞用10 µM EdU脉冲标记30分钟，随后用H2O2（250 μM）处理1小时或用Neocarzinostatin（0.5 μg/mL）处理4小时。CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个细胞核的边界。比例尺 = 5 µm。右侧图板为所示S期或非S期细胞核的放大图像。（B）代表性图像显示使用αRPA2抗体（绿色）检测到的ssDNA灶。S期细胞通过EdU（紫色）标记，DAPI用于复染核DNA（蓝色）。RPE1细胞先用10 µM EdU脉冲标记30分钟，随后分别用H2O2（250 μM）处理1小时、羟基脲（2 mM）处理4小时或NCS（0.5 μg/mL）处理4小时。CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个细胞核的边界。比例尺 = 10 µm。右侧图板为所示S期或非S期细胞核的放大图像。缩写：ssDNA = 单链DNA；BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；RPE1 = 端粒酶逆转录酶永生化视网膜色素上皮细胞；EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；NCS = 新生霉素；HU = 羟基脲。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ssDNA复制分析；显微镜图像、图表、Western blot；H2O2对RPA2焦点/细胞核的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用RPA2抗体检测G1期中的ssDNA焦点。 （A）RPE1细胞分别转染靶向RPA2的siRNA或非靶向siRNA对照，随后同步于G1期，并用10 µM EdU脉冲标记30分钟，之后在指定情况下用H2O2（250 μM）处理1小时。使用DAPI对细胞核DNA进行复染。在CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个细胞核的边界。比例尺 = 5 µm。（B）RPA2焦点/细胞核数量的测量数据来自两次独立实验。分析时仅考虑EdU阴性细胞。图中线条表示平均值。统计分析采用非参数ANOVA检验（Kruskal-Wallis）。星号表示P &lt; 0.0001。分析的细胞核数量如下：siNT 无H2O2 n = 513，siNT 含H2O2 n = 603，siRPA2 无H2O2 n = 266，siRPA2 含H2O2 n = 536。（C）siRNA敲低效率通过免疫印迹显示。缩写：siNT = 非靶向siRNA对照；BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；RPE1 = hTERT永生化视网膜色素上皮细胞；EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分析工作流程；图像处理步骤 A-G；软件界面；荧光显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：使用Fiji对ssDNA焦点进行定量分析。 在Fiji中详细展示如何评估细胞核内RPA2焦点数量的各个步骤。（A-E）利用DAPI通道创建细胞核掩膜。（F-H）设定阈值以从背景信号中识别单个细胞核内的ssDNA焦点。缩写：ssDNA = 单链DNA；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">细胞骨架（CSK）缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES pH 7.0 </td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl </td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA pH 8 </td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 </td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-蔗糖</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 </td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸酶抑制剂混合液</td>
			<td>每 10 mL 加 1 片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白酶抑制剂混合液</td>
			<td>每 10 mL 加 1 片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用 ddH2O 稀释</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">洗涤缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 </td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用 PBS 稀释</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">透化缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 </td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用 PBS 稀释</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">固定液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多聚甲醛 </td>
			<td>3.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 </td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用 PBS 稀释</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">封闭缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白（BSA） </td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 </td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用 PBS 稀释</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Click-iT Plus 反应混合液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Click-iT 反应缓冲液 </td>
			<td>435 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor PCA 溶液</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4-铜保护剂预混液</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Click-iT 缓冲液添加剂</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积 </td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用缓冲液的组成。
补充图 S1。（A）通过血清饥饿 72 小时将 RPE1 细胞同步至 G0 期，随后通过重新加入血清使其进入不同的细胞周期时相。点图显示了处于 G0/G1、S 或 G2/M 期的细胞，其中“小时”表示血清饥饿后重新加入血清的时间。右侧图表显示了各条件下 G0/G1、S 和 G2/M 期细胞的百分比。流式细胞术分析采用商业化的细胞增殖检测试剂盒，按照制造商推荐的方法使用 EdU 和碘化丙啶进行。(B) 图 1 的未裁剪 Western 印迹扫描图。数字表示分子量标记物，单位为 kDa。PARP1 作为上样对照，与 CCNA2、p27（进一步剥离后检测 PCNA）以及 pH3（S10）（进一步剥离后检测 H3）在同一块凝胶上电泳并显影，通过切割膜实现。CCNB1 和 RPA2 则上样于另一块凝胶，使用相同量的蛋白裂解液以确保可比性。(C) 图 3 的未裁剪 Western 印迹扫描图。数字表示分子量标记物，单位为 kDa。缩写：EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2: (A代表性图像显示使用 BrdU 抗体标记的单链 DNA 焦点（绿色）；S 期细胞由细胞周期蛋白 A2 标记（红色）；DAPI 用于复染核 DNA（蓝色）。RPE1 细胞保持在 10 µM BrdU 处理 48 小时后再进行后续处理。48 小时后，细胞用 H 处理2O2 (250 μM）中孵育 1 小时，或采用新制癌菌素（Neocarzinostatin）0.5 µg/mL) 固定前孵育4小时。白色虚线表示每个细胞核的边界。比例尺 = 5 µm. (B) 有无变性条件下RPE1细胞的BrdU染色。异步生长的RPE1细胞经预处理后 10 µM BrdU 处理 48 小时。比例尺 = 10 µm. (CBrdU 焦点/细胞核数量的测量基于两次独立实验中G1期同步化的RPE1细胞。分析过程中仅考虑EdU阴性细胞。图中线条表示均值。统计分析采用非参数方差分析（Kruskal-Wallis检验）。“ns”表示无显著性差异。所分析的细胞核数量如下：NT n = 52，NCS n = 105，H2O2 n = 82。缩写：siNT = 非靶向 siRNA 对照；BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；RPE1 = hTERT 永生化视网膜色素上皮细胞；NCS = 新生霉素链球菌素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Figure%202_revised2.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充视频 S1：基于 Fiji 的 RPA2 焦点分析的屏幕录制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

DNA 具有专门的细胞修复通路，能够应对由内源性和/或外源性因素引起的损伤。DNA修复……

DNA损伤应答对于生命至关重要，因为DNA constantly暴露于各种损伤因子之下。缺乏修复将导致基因组不稳定和疾病发生。我们开发了一种基于RPA2生物学特性的方法，用于在不同细胞周期阶段可视化DNA修复过程中的单链DNA区段。传统的单链DNA检测方法利用BrdU抗体。该方法可用于检测处于活跃复制状态的细胞。此外，该抗体容易与其他核苷酸类似物发生交叉反应，从而限制了其应用。与BrdU不同，我们的方法具有更高的信噪比，因此可在细胞周期的各个阶段使用。了解不同DNA修复通路在不同细胞周期阶段以及潜在的非复制细胞中的作用至关重要。本方案提供了一种新方法和工具，用于可视化单链DNA焦点，而传统利用BrdU的方法则存在局限性。深入了解DNA修复过程可为治疗癌症、衰老和神经系统疾病提供潜在的治疗靶点。我们体内的大多数细胞都是终末分化的，因此不会进行复制和分裂。因此，深入理解这些细胞如何修复各种DNA损伤至关重要。因此，我们的实验室将主要致力于复制后DNA修复过程的研究，并开发用于研究这些过程的新工具。首先，用70%乙醇对镊子进行灭菌处理。将单个玻璃盖玻片放入24孔板的一个孔中。向每个含有盖玻片的孔中加入 500 µL 玻连蛋白溶液。孵育后，移除包被溶液，并用 1 mL PBS 洗涤盖玻片。将 RPE1 细胞在 37 °C 下用 1 mL 0.05% 胰蛋白酶孵育。为了将血清饥饿处理的细胞从组织培养处理板上分离，将RPE1细胞重悬于6毫升DMEM培养基中以灭活胰蛋白酶。随后，在室温下以150 ×g离心5分钟。然后，将细胞重悬于1毫升培养基中。将500微升细胞悬液接种到包被的盖玻片上。在37摄氏度下，用10微摩尔的EdU脉冲标记细胞30分钟。移除含有EdU的培养基，并在37摄氏度下用10微摩尔的胸腺嘧啶对细胞进行10分钟的追踪。去除胸苷培养基后，用 250 微摩尔的过氧化氢处理细胞 1 小时。进行预提取时，将洗涤后的细胞在 1 毫升 CSK 提取缓冲液中于室温孵育 5 分钟。然后在 0.5 毫升 3.6% 多聚甲醛溶液中于室温固定细胞 10 分钟。接着，用含有0.05% Triton X-100的一毫升PBS洗涤细胞，以去除多聚甲醛。透化完成后，吸除溶液，并用一毫升封闭缓冲液将细胞洗涤两次。然后加入一毫升封闭缓冲液，于室温轻轻振荡孵育10分钟。去除封闭缓冲液后，加入500微升含有Picolyl Azide-647的Click反应混合液。然后用含有0.05%Triton X-100的PBS在室温下洗涤细胞两次，每次10分钟。随后将洗涤后的细胞在一毫升封闭缓冲液中于室温孵育30分钟。然后将细胞在250至500微升封闭缓冲液中，于室温下与一抗孵育两小时。用Triton X PBS洗涤细胞两次，再用封闭缓冲液洗涤细胞一次。现在将二抗以250至500 µL封闭缓冲液稀释，在室温下轻柔振荡孵育2小时。孵育完成后，用PBS和封闭缓冲液洗涤细胞。将洗涤后的细胞用DAPI复染细胞核，在室温下孵育10分钟。然后在室温下用 PBS 清洗细胞 5 分钟。将盖玻片浸入蒸馏水中以去除盐结晶。接着将盖玻片用 10 微升封片剂封固在显微镜载玻片上。将染色后的载玻片置于 4 摄氏度保存。使用配备 DAPI、FITC 和 Cy5 通道常规滤光片的落射荧光显微镜拍摄图像。在 Fiji 软件中打开图像文件。为了使用 DAPI 染色制作细胞核掩膜，首先打开 DAPI 图像。选择“Process”（处理），然后选择“Enhance Contrast”（增强对比度），并将饱和像素设置为 0.35。接下来，再次点击“Process”（处理），选择“Binary”（二值化），然后选择“Convert to Mask”（转换为掩膜）。再次点击“Process”和“Binary”。然后按“Fill Holes”。在“Analyze”下点击“Analyze Particles”，并将大小设置为10-无穷大。接下来，在 ROI Manager 中点击“显示全部”。为了找到 RPA2 焦点，首先打开 RPA2 图像，点击“处理”并选择“寻找最大值”，然后将显著性阈值设置为能够突出显示焦点的数值。点击 ROI 管理器中的“Measure”按钮，然后将“RawIntDen”列中的数值除以 255，以计算细胞核内单链 DNA 焦点的总数。将含有血清的培养基加入饥饿处理的细胞中孵育六小时后，细胞重新进入细胞周期。通过EdU掺入实验以及G1期缺乏DNA复制来确认细胞周期同步化。仅在S期细胞中检测到经过过氧化氢和新生霉素处理后出现的BrdU焦点。无论未经处理还是经处理的样本均未显示EdU与BrdU的共定位，表明本方法中抗体无交叉反应性。RPA2 染色显示，在新制癌菌素和过氧化氢作用下，不仅在 S 期，而且在其他细胞周期时相中均出现依赖性的焦点形成。RPA2 抗体还检测到在无外源性基因毒性应激条件下，复制过程中自然发生的单链 DNA 形成。经过氧化氢处理后，处于 G1 期的细胞中 RPA2 焦点显著增加。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

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芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习利用RPA2免疫荧光染色技术在RPE1细胞中可视化G1期单链DNA病灶。该方法通过细胞周期同步化和过氧化氢处理，为研究DNA损伤修复机制提供了高信噪比的新工具。

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

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