可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点
2023年12月22日
以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。
DNA损伤应答对于生命至关重要，因为DNA constantly暴露于各种损伤因子之下。缺乏修复将导致基因组不稳定和疾病发生。我们开发了一种基于RPA2生物学特性的方法，用于在不同细胞周期阶段可视化DNA修复过程中的单链DNA区段。
传统的单链DNA检测方法利用BrdU抗体。该方法可用于检测处于活跃复制状态的细胞。此外，该抗体容易与其他核苷酸类似物发生交叉反应，从而限制了其应用。
与BrdU不同，我们的方法具有更高的信噪比，因此可在细胞周期的各个阶段使用。了解不同DNA修复通路在不同细胞周期阶段以及潜在的非复制细胞中的作用至关重要。本方案提供了一种新方法和工具，用于可视化单链DNA焦点，而传统利用BrdU的方法则存在局限性。
深入了解DNA修复过程可为治疗癌症、衰老和神经系统疾病提供潜在的治疗靶点。我们体内的大多数细胞都是终末分化的，因此不会进行复制和分裂。因此，深入理解这些细胞如何修复各种DNA损伤至关重要。
因此，我们的实验室将主要致力于复制后DNA修复过程的研究，并开发用于研究这些过程的新工具。首先，用70%乙醇对镊子进行灭菌处理。将单个玻璃盖玻片放入24孔板的一个孔中。
向每个含有盖玻片的孔中加入 500 µL 玻连蛋白溶液。孵育后，移除包被溶液，并用 1 mL PBS 洗涤盖玻片。将 RPE1 细胞在 37 °C 下用 1 mL 0.05% 胰蛋白酶孵育。
为了将血清饥饿处理的细胞从组织培养处理板上分离，将RPE1细胞重悬于6毫升DMEM培养基中以灭活胰蛋白酶。随后，在室温下以150 ×g离心5分钟。然后，将细胞重悬于1毫升培养基中。
将500微升细胞悬液接种到包被的盖玻片上。在37摄氏度下，用10微摩尔的EdU脉冲标记细胞30分钟。移除含有EdU的培养基，并在37摄氏度下用10微摩尔的胸腺嘧啶对细胞进行10分钟的追踪。
去除胸苷培养基后，用 250 微摩尔的过氧化氢处理细胞 1 小时。进行预提取时，将洗涤后的细胞在 1 毫升 CSK 提取缓冲液中于室温孵育 5 分钟。然后在 0.5 毫升 3.6% 多聚甲醛溶液中于室温固定细胞 10 分钟。
接着，用含有0.05% Triton X-100的一毫升PBS洗涤细胞，以去除多聚甲醛。透化完成后，吸除溶液，并用一毫升封闭缓冲液将细胞洗涤两次。然后加入一毫升封闭缓冲液，于室温轻轻振荡孵育10分钟。
去除封闭缓冲液后，加入500微升含有Picolyl Azide-647的Click反应混合液。然后用含有0.05%Triton X-100的PBS在室温下洗涤细胞两次，每次10分钟。随后将洗涤后的细胞在一毫升封闭缓冲液中于室温孵育30分钟。
然后将细胞在250至500微升封闭缓冲液中，于室温下与一抗孵育两小时。用Triton X PBS洗涤细胞两次，再用封闭缓冲液洗涤细胞一次。
现在将二抗以250至500 µL封闭缓冲液稀释，在室温下轻柔振荡孵育2小时。孵育完成后，用PBS和封闭缓冲液洗涤细胞。将洗涤后的细胞用DAPI复染细胞核，在室温下孵育10分钟。
然后在室温下用 PBS 清洗细胞 5 分钟。将盖玻片浸入蒸馏水中以去除盐结晶。接着将盖玻片用 10 微升封片剂封固在显微镜载玻片上。
将染色后的载玻片置于 4 摄氏度保存。使用配备 DAPI、FITC 和 Cy5 通道常规滤光片的落射荧光显微镜拍摄图像。在 Fiji 软件中打开图像文件。
为了使用 DAPI 染色制作细胞核掩膜，首先打开 DAPI 图像。选择“Process”（处理），然后选择“Enhance Contrast”（增强对比度），并将饱和像素设置为 0.35。接下来，再次点击“Process”（处理），选择“Binary”（二值化），然后选择“Convert to Mask”（转换为掩膜）。
再次点击“Process”和“Binary”。然后按“Fill Holes”。在“Analyze”下点击“Analyze Particles”，并将大小设置为10-无穷大。
接下来，在 ROI Manager 中点击“显示全部”。为了找到 RPA2 焦点，首先打开 RPA2 图像，点击“处理”并选择“寻找最大值”，然后将显著性阈值设置为能够突出显示焦点的数值。
点击 ROI 管理器中的“Measure”按钮，然后将“RawIntDen”列中的数值除以 255，以计算细胞核内单链 DNA 焦点的总数。将含有血清的培养基加入饥饿处理的细胞中孵育六小时后，细胞重新进入细胞周期。
通过EdU掺入实验以及G1期缺乏DNA复制来确认细胞周期同步化。仅在S期细胞中检测到经过过氧化氢和新生霉素处理后出现的BrdU焦点。无论未经处理还是经处理的样本均未显示EdU与BrdU的共定位，表明本方法中抗体无交叉反应性。
RPA2 染色显示，在新制癌菌素和过氧化氢作用下，不仅在 S 期，而且在其他细胞周期时相中均出现依赖性的焦点形成。RPA2 抗体还检测到在无外源性基因毒性应激条件下，复制过程中自然发生的单链 DNA 形成。经过氧化氢处理后，处于 G1 期的细胞中 RPA2 焦点显著增加。
概述
本研究探讨了细胞周期G1期中单链DNA焦点的检测，强调了DNA修复机制的重要性。通过细胞周期同步化和RPA2免疫荧光染色技术，该方法可有效可视化不同细胞周期阶段的DNA损伤。
关键研究组成部分
研究领域
- DNA损伤应答
- 细胞周期同步化
- 免疫荧光染色
背景
- DNA修复在维持基因组稳定性中的重要性
- 传统BrdU抗体法在单链DNA检测中的局限性
- 对非复制细胞中DNA修复机制的深入理解需求
使用的方法
- RPA2 免疫荧光染色
- 以 RPE1 细胞作为生物学模型
- 细胞周期同步化后进行过氧化氢处理
主要结果
- 在不同细胞周期阶段成功可视化 RPA2 焦点
- 证实了在 DNA 损伤剂作用下焦点形成的增加
- 与传统的 BrdU 方法有明显区别，未观察到抗体交叉反应性
结论
- 该研究提供了一种在细胞周期中可视化单链DNA焦点的新方法。
- 这一进展对于理解DNA修复过程及其在癌症和衰老研究中的意义具有重要影响。
常见问题
行业重要性概要
在G1期细胞中准确可视化单链DNA（ssDNA）焦点，填补了理解复制以外DNA修复动态的关键空白。该技术能力增强了对DNA损伤应答通路靶点验证的预测可靠性，支持在早期发现和转化研究中进行基于风险评估的决策。该方法具有高特异性和改善的信噪比，能够对与肿瘤学及衰老相关疾病研究领域相关的非复制性和有丝分裂后细胞群体中的修复机制进行可靠评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在 G1 期细胞中直接检测 DNA 修复通路的活性。
- 通过区分不依赖 DNA 复制的修复事件，支持作用机制的去风险化研究。
- 有助于对参与单链 DNA 稳定与修复的蛋白质进行功能性靶点验证。
- 提高针对通路特异性治疗假设的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供一种经过验证的免疫荧光检测方法，用于定量同步化细胞群体中的单链DNA焦点。
- 减少基于BrdU检测中常见的交叉反应和背景信号，提高实验可重复性。
- 实现针对DNA修复过程的化合物筛选的标准化读数。
- 支持在不同细胞周期时相中进行检测方法的扩展和平台重复使用。
转化与临床前研究
- 通过在非复制性和终末分化细胞中进行分析，与疾病相关模型保持一致。
- 支持从DNA修复靶点的发现到临床前验证的连续性研究。
- 有助于根据风险评估推进调控DNA损伤应答的候选分子。
- 提供在基因毒性应激条件下修复通路参与的机制性见解。
流程与工作流整合
这种基于免疫荧光的单链DNA可视化方法可融入从发现到临床前研究的连续流程，有助于对DNA修复靶点进行早期假设验证和后续检测方法的开发。
- 发现生物学：支持在G1期对修复通路的参与及单链DNA形成的假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的焦点计数，用于化合物评估。
- 分析：提供基于图像的可靠测量方法，用于不同条件间的比较及统计分析。
- 转化研究：可在与疾病相关且不复制的细胞系统中评估DNA修复能力。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的检测平台，适用于多种DNA损伤应答研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高DNA修复靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强研发团队间检测方法的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过明确修复通路活性，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对DNA修复调节剂及通路靶点进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞同步化、免疫荧光以及定量图像分析方面的专业知识。
- 需要具备落射荧光显微镜及兼容的图像处理软件（例如 Fiji）的使用权限。
- 要求跨团队在染色、成像和分析流程方面实现标准化。
- 可适用于多种细胞类型，包括非复制性和终末分化的模型。
- 依赖经过验证的抗体和优化的染色条件，以实现稳定的信号检测。
