Name: 基于转录组学的经济高效的药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 了解基于转录组学的经济高效药物筛选方法，利用外周血单核细胞培养结合minibug转录组学技术。该方法可在降低测序深度的同时获取有效生物学信号，帮助研究人员识别新型药物靶点并推动现代药物发现研究。

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J.L.S. 受德国研究基金会（DFG）在德国卓越战略（EXC2151-390873048）以及 SCHU 950/8-1；GRK 2168，TP11；CRC SFB 1454 Metaflammation，IRTG GRK 2168，WGGC INST 216/981-1，CCU INST 217/988-1，德国联邦教育和研究部（BMBF）资助的卓越项目 Diet-Body-Brain（DietBB）；以及欧盟项目 SYSCID（资助编号 733100）的支持。M.B. 受 DFG（IRTG2168-272482170，SFB1454-432325352）支持。L.B. 受 DFG（ImmuDiet BO 6228/2-1，项目编号 513977171）和德国卓越战略（EXC2151-390873048）支持。图片使用 BioRender.com 创建。

本方案遵循波恩大学当地伦理委员会的指导原则。
1. 缓冲液、溶液和仪器的准备
<ol>
	<li>准备 材料表 中所述的溶液并收集所需材料。</li>
	<li>将水浴加热至 37 °C，并预热完全培养基（RPMI-1640 + 10% 胎牛血清 (FCS) + 1% 青霉素/链霉素）。</li>
	<li>细胞收获时使用冰冻磷酸盐缓冲液 (PBS)。 
	​注：操作细胞时应保持环境洁净，以维持无菌状态。</li>
</ol>
2. 细胞操作
注意：人血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）的详细冻存方案可参见文献7。
<ol>
	<li>细胞解冻与计数
	<ol>
		<li>从液氮中取出冻存管，在水浴中解冻 37 °C 轻柔倒置 2 - 3 分钟。</li>
		<li>将解冻的细胞转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>用1 mL温热的完全培养基冲洗冻存管，并将此溶液逐滴加入试管中的细胞（1st 稀释步骤</li>
		<li>以1:1比例重复稀释，直至总体积达到32 mL（共进行5次稀释，分别加入1、2、4、8和16 mL预热的完全培养基）。添加培养基时应逐滴加入，同时轻轻振荡锥形管，以减少对细胞的扰动。</li>
		<li>将细胞悬液离心5分钟（300 x g, 20 °C）并用一个流畅的动作轻轻倾斜锥形管以去除上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于3 mL预热的完全培养基中，随后进行细胞计数。</li>
		<li>用于计数时，混合 10 µL 用台盼蓝对细胞悬液进行染色（根据细胞悬液密度按1:2至1:10比例稀释），以在计数时区分活细胞与死细胞。死细胞或受损细胞因摄取染料而呈蓝色，活细胞则不被染色。 
		注意：台盼蓝具有轻微细胞毒性，染色后的细胞存放时间不应超过5分钟。</li>
		<li>使用自动细胞计数器或计数板对细胞进行计数 10 µL 染色细胞溶液
		<ol>
			<li>使用改进型血细胞计数板（Neubauer-improved cell chamber）时，计数四个角的大方格内的所有细胞，并利用以下公式计算细胞悬液的浓度。 
			<img alt="静力平衡方程，细胞计数公式；稀释与浓度分析的计算。" src="/files/ftp_upload/65930/65930eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞稀释至终浓度为 1 x 106 细胞/mL，使用预热的完全培养基。仅当所需体积低于3 mL时进行离心，并将细胞沉淀重悬至所需体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种与处理
	<ol>
		<li>种子 100 µL 每孔加入96孔细胞培养板中的细胞悬液（1 x 10⁵ 个细胞）5 细胞/孔 
		注意：接种细胞数量已针对 PBMC 培养进行优化。细胞浓度过低将无法获得足量 RNA 用于测序，而细胞数量过多则会增加细胞裂解不充分及逆转录反应抑制的风险。</li>
		<li>按治疗浓度的两倍（2x）配制药物稀释液。根据化合物的溶解度选择溶剂，优先选用完全培养基。 
		注意：如果无法达到足够的溶解度，可使用磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）。最终孵育体系中 DMSO 的最大浓度不应超过 0.5 %，以防止溶剂引起的细胞毒性。</li>
		<li>添加 100 µL 2倍药物稀释液（孔内终浓度为1X），于 37 °C 指定的时间。 
		注意：应进行补充性研究，以确定最佳药物孵育时间，并排除潜在的细胞毒性机制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收获与裂解
	<ol>
		<li>将细胞培养板离心 10 分钟（300 x g, 20 °C). 用真空泵小心吸去上清液，同时将培养板保持倾斜角度（30°-45°将吸头对准孔板的底部角落，尽量减少细胞的移除。</li>
		<li>加入洗涤液洗涤细胞 200 µL 加入预冷的 PBS 每孔，并以 300 × g 离心 5 分钟 g, 4 °C). 用真空泵吸去上清液，再次将培养板保持在较陡的角度，以尽可能吸除更多的 PBS。</li>
		<li>按照所述方法制备裂解缓冲液 表1 根据所需反应（rxn）数量，额外增加10%的余量。</li>
		<li>添加 15 µL 加入裂解缓冲液至每孔，并用粘性封板膜密封培养板，以防止样品污染。离心前先涡旋震荡培养板1分钟（1000 x g, 4 °C）并在冰上孵育5分钟。</li>
		<li>收集 6 µL 在PCR板中加入裂解后的细胞溶液，并将细胞裂解液短暂冷冻于-80 °C 以确保最佳的细胞裂解效果。务必避免对培养板进行多次冻融循环。 
		注意：暂停点：如果后续不立即进行 cDNA 的合成，细胞裂解液可保存在 -80 °C。80 °C 长达数月而不会显著降低RNA质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测序文库制备
<ol>
	<li>逆转录（RT）反应 
	注意：处理 RNA 时，应将所有样品置于冰上，并确保使用无核酸酶的设备（无菌、一次性塑料耗材）和水。
	<ol>
		<li>按照所述方法制备逆转录反应混合液 表2 根据所需反应数量配制，额外增加10%余量。轻轻涡旋混匀，短暂离心。将混合液置于冰上保存，直至使用。</li>
		<li>将细胞裂解液在室温（RT）下解冻，并短暂离心，使所有细胞裂解液聚集于孔板底部。</li>
		<li>在PCR仪中按照以下步骤进行mRNA变性处理 表3.</li>
		<li>从PCR仪中取出反应板，短暂离心以收集可能的冷凝液。加入 6 µL 将RT反应混合液加入各孔，使终体积达到 12 µL. 密封培养板以保护样品并防止蒸发、涡旋和离心。</li>
		<li>将培养板置于热循环仪上，并按照逆转录反应程序开始运行 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预扩增
	<ol>
		<li>解冻高保真DNA聚合酶以及 原位 PCR（ISPCR）引物在室温下。</li>
		<li>按照说明制备预扩增混合液 表4 根据所需反应数，额外增加10%余量。短暂涡旋混匀后离心。 
		注意：该酶混合液在室温下数小时内保持稳定。</li>
		<li>离心PCR板，加入 15 µL 将预扩增混合液加入每孔，并密封板子。</li>
		<li>将其置于热循环仪上，并按照预扩增反应程序开始运行 表5.
		<ol>
			<li>根据 RNA 含量调整循环次数。起始时采用较低的循环数，若 cDNA 产量不足，则逐步增加。 
			注意：根据我们的经验，每种细胞类型、实验条件和处理方式的最佳循环数均应单独确定，处理因素不会影响最佳循环数。因此，建议在将本方案用于新细胞类型时，通过实验确定最佳循环数。通常情况下，原代细胞所需的循环次数较细胞系更多。暂停点：预扩增产物可保存于 - 20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA 纯化与质量控制（QC） 
	注意：由于样品在此阶段较为稳定，可依次对每块板进行样品纯化。增加样品数量将延长实验流程的总时长，但不会限制可同时处理的样品数量。
	<ol>
		<li>开始前，将磁性纯化 beads 置于室温，并以高速涡旋振荡 1 min，充分重悬 beads。</li>
		<li>加入0.8倍体积（v/v）的20 µL将磁性纯化珠加入各孔中，室温孵育5分钟。</li>
		<li>将PCR板置于磁力架上静置5分钟，直至磁珠完全分离。小心移除上清液。</li>
		<li>将培养板置于磁力架上，轻轻加入 100 µL 加入新配制的80%乙醇洗涤磁珠，并孵育30秒。用小体积移液器吸除上清液。重复洗涤一次。务必尽可能彻底去除乙醇。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上，室温下晾干，最长不超过5分钟，直至乙醇完全挥发且磁珠不再呈现光泽。</li>
		<li>从磁力架上取下板，重悬珠子 20 µL 加入无核酸酶水并孵育2分钟。</li>
		<li>将培养板再次置于磁力架上，直至磁珠完全分离。</li>
		<li>将洗脱液回收至新的PCR板中，用于cDNA质量检测和片段化。</li>
		<li>使用 TapeStation 或 FragmentAnalyser 检测评估 cDNA 文库的片段大小分布和浓度（推荐：TapeStation D5000 检测）。具体操作详见试剂盒说明书。预期典型产量为 20 ng。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用试剂盒进行标签化片段化 
	注意：如果已有 established 的其他 Tagmentation 方案，可使用。
	<ol>
		<li>将 cDNA 稀释至终浓度为 150 - 300 pg/μLµL 使用无核酸酶水。</li>
		<li>按照以下设置预先编程热循环仪 表6 以确保在将 cDNA 加入酶混合液后立即启动标签化反应。</li>
		<li>按照说明制备标签化混合液 表7 根据所需反应数，额外增加10%的余量。</li>
		<li>分配 3 µL 每反应将转座混合物加入新的PCR板中，并添加 1 µL 每个反应中加入 cDNA。</li>
		<li>在加入 cDNA 后立即启动标签化反应。</li>
		<li>通过添加使反应失活 1 µL 中和片段化缓冲液（NT；也可使用0.2%十二烷基硫酸钠（SDS））。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>富集PCR
	<ol>
		<li>配制富集PCR反应液 表7 根据反应数量，额外增加10%余量。（推荐：使用Nextera UDI试剂盒，以防止在有序流动池（如Illumina NovaSeq 6000）上发生索引跳跃）</li>
		<li>添加 9 µL 将富集PCR混合液加入各反应体系，使总体积达到 14 µL.</li>
		<li>按照说明书运行富集PCR程序 表8. 
		注意：对于扩增PCR，标准循环数为16个。如果cDNA质量较差，可增加额外循环数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化与质量控制
	<ol>
		<li>实验开始前，将磁性纯化 beads 置于室温，并以高速涡旋震荡 1 分钟，充分重悬 beads。</li>
		<li>加入1.0倍体积（v/v）14 µL）磁性纯化珠，室温孵育5分钟。</li>
		<li>将培养板置于磁力架上，静置5 min，直至磁珠完全分离。小心移除上清液。</li>
		<li>将培养板保持在磁力架上，轻柔地加入 100 µL 加入新配制的80%乙醇洗涤珠子，孵育30秒。使用小体积移液器吸除上清液。再重复洗涤一次。务必尽可能彻底去除乙醇。</li>
		<li>室温下风干珠子3分钟，或直至其表面不再有光泽。</li>
		<li>从磁力架上取下反应板，重悬磁珠 20 µL 加入无核酸酶水并孵育2分钟。</li>
		<li>将平板再次置于磁力架上，直至磁珠分离，收集洗脱液至新的PCR板中，用于文库质控。</li>
		<li>使用 TapeStation 或 Fragment Analyzer 检测以评估 cDNA 文库的片段大小分布和浓度（推荐：TapeStation D1000 高灵敏度检测）。具体操作详见仪器制造商说明书。通常情况下，预期产量约为 10 ng。 
		注意：暂停点：PCR 产物可在 - 20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 测序与数据预处理
<ol>
	<li>测序 
	注意：以下指南适用于所有用于短读长测序的Illumina仪器。如果无法获得相关仪器，可将测序工作委托给外部测序机构完成。也可采用其他测序方法。为简化说明，本文仅报告目前使用最广泛的测序技术。 
	注意：以下与软件操作相关的步骤描述基于Illumina NovaSeq6000测序仪的操作流程。
	<ol>
		<li>根据步骤3.6.8获得的结果，将带有唯一索引的文库按等摩尔比例混合。</li>
		<li>使用高灵敏度检测方法测定最终文库混合物的浓度，以计算样品的摩尔浓度，公式如下： 
		<img alt="DNA定量公式，核酸浓度计算方程，包含ng/µL，示意图。" src="/files/ftp_upload/65930/65930eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2"></li>
		<li>根据仪器说明书及实验优化条件加载流动池。常见仪器的加载浓度示例见表9。</li>
		<li>触摸屏幕选择测序以启动运行设置。</li>
		<li>按照屏幕提示加载流动池、边合成边测序试剂盒、簇生成试剂盒、缓冲液试剂盒，并确保废液容器为空。</li>
		<li>当仪器识别所有试剂后，点击运行设置。在此处定义运行名称和用于存储数据的输出文件夹。</li>
		<li>设定测序参数为双端测序，两端读长均为51 bp，同时对两个索引序列进行测序，每个索引读长为8 bp。</li>
		<li>点击查看，确认所有测序参数无误后，点击启动运行。 
		注意：推荐的测序深度为每个样品5 × 106条读段，最低不少于每个样品1 × 106条读段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据预处理
	<ol>
		<li>使用Bcl2Fastq2工具将原始测序数据转换为FASTQ格式，并根据样品索引进行解复用。解复用时采用默认参数设置。有关Bcl2Fastq2的详细操作说明，请参阅其参考手册。 
		注意：若测序不在本实验室进行，FASTQ格式转换和解复用通常由测序机构完成。测序机构通常会提供已完成解复用的FASTQ文件供后续分析使用。</li>
		<li>目前有多种可用于测序读段比对和丰度定量的分析方法（推荐：nf-core RNA-seq流程（https://nf-co.re/rnaseq））。该流程提供多种选项，建议采用默认设置，使用STAR8进行序列比对，Salmon9进行转录本丰度定量。</li>
		<li>注意：在后续生物信息学分析方面，存在多种可用方法。本实验方案不涵盖所有分析流程（推荐：DESeq2分析流程10）。我们开发的基于DESeq2工作流的标准分析脚本可在GitHub上获取（https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Transcriptome Profiling for High-Throughput Drug Screening

<ol><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+transcriptome+profiling+in+drug+and+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery.</a> Front Genet. 11, 19(2020).</li>
<li>Bonaguro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+systems-level+immunomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A guide to systems-level immunomics.</a> Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).</li>
<li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+mechanism+of+action+and+sensitivity+to+drug+candidates+from+integrated+transcriptome+and+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state.</a> ELife. 11, 78012(2022).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>De Domenico, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+on+infectious+diseases+including+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100233(2020).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Patro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Frankish, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENCODE+reference+annotation+for+the+human+and+mouse+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes.</a> Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

药物发现与药物开发可从批量转录组学所提供的细胞过程整体视角中显著受益。然而，由于标准批量RNA测序方案的实验成本较高，该方法常受到限制，从而阻碍了其在学术环境中的应用以及在工业规模上的扩展潜力。
该实验方案中最关键的步骤是细胞复苏以及文库构建的初始步骤。复苏后确保细胞具有较高的存活率，对于后续处理和转录组分析的成功至关重要。从细胞收集到cDNA合成的文库构建初期步骤，对于维持RNA的完整性至关重要。在此阶段，必须始终将细胞裂解物置于冰上，并尽快处理样品。若观察到RNA出现严重降解，应使用特定产品清洁实验台面和仪器，以抑制任何RNase活性。
本文所述方案目前针对健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）的药物处理进行了优化，最长处理时间不超过24小时。若使用不同细胞类型或延长孵育时间，可能需要相应优化接种细胞数量和培养条件。
通过本方案，我们提供了一种使用常规实验室设备对药物处理后的外周血单个核细胞（PBMCs）进行转录组分析的工作流程，且无需商业试剂盒。采用该方法并省去RNA纯化步骤，我们显著降低了成本，从而能够对大量化合物进行平行分析。
由于该方案基于体外实验，其主要局限性在于无法评估药物可能经历的任何代谢加工过程，而这些过程可能导致不同的生物活性。此外，所捕获的转录本数量和测序深度将低于标准的批量全长转录组学方法，因此这些数据不适用于需要更高信息含量的应用，例如差异剪接分析或单核苷酸多态性的定量分析。

新药研发是一个复杂且耗时的过程，涉及潜在药物及其靶点的识别、候选药物的优化与合成，以及在临床前和临床试验中对其有效性和安全性的测试1。传统的药物筛选方法，即对候选化合物库进行系统性评估以寻找治疗用途的方法，通常采用动物模型或基于细胞的检测手段来测试化合物对特定靶点或通路的作用。尽管这些方法在发现候选药物方面已取得成功，但往往无法充分揭示药物疗效背后的复杂分子机制，同时也难以阐明潜在的毒性及副作用机制。
评估全基因组范围的转录状态为克服当前药物筛选的局限性提供了一种强有力的方法，因为它能够全面评估药物处理后基因表达的变化2。通过以全基因组方式测量特定时间点表达的RNA转录本，转录组学旨在提供药物诱导的转录变化的整体视图，包括基因表达模式的改变、可变剪接以及非编码RNA的表达变化3。这些信息可用于确定药物靶点、预测药物疗效和毒性，并优化药物剂量和治疗方案。
将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要优势之一，是有可能发现此前未被考虑的新型药物靶点。传统的药物筛选方法通常集中于已确立的靶分子或信号通路，这限制了新靶点的发现，并可能导致药物产生意想不到的副作用以及疗效受限。转录组学可通过揭示药物处理后发生的分子变化，克服这些局限性，从而发现可能此前未被关注的潜在靶点或信号通路2。
除了鉴定新的药物靶点外，转录组学还可用于预测药物的有效性和毒性。通过分析与药物反应相关的基因表达模式，可以开发出生物标志物，用于预测患者对特定药物或治疗方案的反应。这也有助于优化药物剂量，降低发生不良副作用的风险4。
尽管转录组学具有潜在优势，但其成本仍然是限制其在药物筛选中广泛应用的重要障碍。转录组学分析需要专用设备、专业技术以及数据分析能力，这使得资金有限的小型研究团队或机构难以在药物筛选中应用转录组学。然而，转录组学的成本正在持续下降，使其对科研群体的可及性不断提高。此外，技术进步和数据分析方法的改进使转录组学变得更加高效且经济，进一步提升了其可及性2。
在本方案中，我们描述了一种基于转录组的高维度、探索性药物筛选系统，该系统结合了微型化扰动培养与微量批量转录组学分析。5,6通过本方案，可将每个样品的成本降低至原来的1/6th 相较于当前商业化的全长mRNA测序解决方案，本方案成本较低。该流程仅需常规实验室设备，唯一例外是需使用短读长测序技术，若机构内部无测序仪器，可将测序步骤外包。优化后的微量批量测序方案可在经济有效的测序深度下提供富含生物学信息的信号，从而支持对已知药物及新分子进行广泛筛选。
本实验的目的是在不同的生物学背景下筛选药物对PBMCs的活性。该方案可应用于任何需要以转录组学读数来测试多种药物的生物学问题，从而全面揭示治疗处理对细胞的转录组水平影响。

<table><tbody><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>fisher scientific</td><td>10203001</td><td></td></tr><tr><td>粘性 PCR 板密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>扩增子片段化混合液（ATM）</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本）</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A 63881</td><td></td></tr><tr><td>Betaine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级 96 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养真空泵（VACUSAFE）</td><td>Integra Bioscience</td><td>158300</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTPs）混合液（每种 10 mM）</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DTT（100 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>用于贴壁细胞</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（10 &amp;micro;L）</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F171203</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（100 &amp;micro;L）</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F171403</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（20 &amp;micro;L）</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F171303</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头（200 &amp;micro;L）</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F171503</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td></td></tr><tr><td>ISPCR 引物（10 &amp;micro;M）</td><td>Biomers.net GmbH</td><td>SP10006</td><td>5&amp;prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG&lt;br/&gt; T-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X）</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl2）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>96 孔磁力架</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>中和片段化（NT）缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本），或替代使用 0.2% SDS</td></tr><tr><td>与 Nextera 兼容的索引引物</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>PCR 96 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0600</td><td></td></tr><tr><td>PCR 板封膜仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSF0031</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>15723679</td><td></td></tr><tr><td>重组 RNase 抑制剂（40 U/µL）</td><td>TAKARA</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 细胞培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>61870036</td><td>若非使用 PBMCs，请根据细胞类型调整&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SMART dT30VN 引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG&lt;br/&gt; TACT30VN-3</td></tr><tr><td>常规实验室设备</td><td>多种</td><td>多种</td><td>例如离心机、制冰机、冰桶、蒸馏水、水浴锅</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶（SSRT II）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶（SSRT II）缓冲液（5x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>片段化 DNA 缓冲液（TD）</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本）</td></tr><tr><td>TapeStation 4200 系统</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪（S1000）</td><td>Bio-Rad</td><td>1852148</td><td></td></tr><tr><td>TSO-LNA（100 µM）</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG&lt;br/&gt; TACAT(G)(G){G</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 混匀仪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr></tbody></table>

基于转录组学的低成本药物筛选

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

转录组学能够&#160;全面深入地揭示细胞程序及其对扰动的响应。尽管在过去十年中，文库构建和测序的成本显著降低，但将这些技术应用于药物筛选所需的规模时，其费用仍然过高，限制了这些方法巨大潜力的发挥。本研究提出了一种基于转录组的低成本药物筛选系统，结合了微型化扰动培养与微型批量转录组学（mini-bulk transcriptomics）技术。优化后的微型批量转录组学方案可在经济的测序深度下获得具有生物学意义的信号，从而实现对已知药物和新分子的大规模筛选。根据所选处理方式和孵育时间，该方案可在约2天内完成测序文库的制备。由于本方案中设置了多个可暂停的步骤，文库构建和测序可在不同时间点独立进行。该方法支持高通量样本的并行处理，已成功测试同时处理多达384个样本，且未出现数据质量下降。尽管不同药物的最佳孵育时间可能存在差异，但该方法对处理条件和/或药物数量尚无已知限制。

按照已报道的方案，将人外周血单个核细胞（PBMCs）接种后，用不同的免疫调节药物处理，并在不同孵育时间后收集细胞，采用测序方案进行大规模转录组分析（图1）。
应在本方案之前，借助互补的实验策略并根据具体的科学问题，确定待测化合物的理想药物浓度和孵育时间。在大多数情况下，孵育2 - 4小时和24小时可分别代表药物处理后早期和晚期的转录响应情况。
评估本实验方案正确执行的最重要结果是cDNA和文库的质控（QC）图2 和 图3）。cDNA 谱应具有较宽的分布，平均大小为 &gt; 1000 bp (图2），较低的平均分子量或低分子量下分子的累积图4）可能表明RNA投入量较低或RNA降解。
构建高质量的测序文库也是本实验方案中的关键步骤；片段化后的文库片段长度应主要集中分布在约 250 bp 左右（图 3）；过长的片段在测序过程中表现较差（图 5）。
测序完成后，原始的 FASTQ 文件将比对至相应的参考基因组（例如人或小鼠），并对每个样本的转录本丰度进行定量（参见 nf-core RNA-seq 分析流程（https://nf-co.re/rnaseq））。接下来将进行探索性数据分析，以评估数据的整体质量。比对后的数据应能检测到大量蛋白编码基因，因为本实验方案仅捕获带有聚腺苷酸尾的 RNA（图 6A）。在人源样本中，预期可检测到 15000 至 20000 个转录本（该数值基于 GENCODE 27 版人类参考基因组注释11）。进一步的探索性数据分析可包括主成分分析（PCA）。在此类分析中，数据的内在结构可通过二维图进行可视化展示。图 6B 展示了一个典型的 PCA 图，其中各点按处理条件着色，显示出三种不同实验条件形成各自的转录组谱聚类。同时可见，生物学重复样本（同色的点）在转录水平上具有高度相似性，表明本实验方案具有良好的稳健性。本图所示结果由基于 DESeq2 分析流程的 GitHub 公开工具生成（https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2）。
<img alt="细胞处理至测序示意图，逆转录PCR，cDNA制备，工作流程步骤，实验室设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：时间估算与工作流程。（A）本实验方案在96个样本运行情况下的时间估算。（B）从细胞解冻到数据预处理各步骤的流程示意图。请按照箭头方向从上至下阅读该图。带圆圈的箭头表示步骤的重复。红色圆点表示本实验方案中进一步说明的暂停点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳结果图；DNA片段大小分布；大小范围15至10000 bp。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2cDNA文库的典型结果。 微型电泳结果展示了一个代表性cDNA文库的片段大小分布。上下信号代表用于样本比对的标记物。蓝色线条指示平均片段大小（蓝色括号）。cDNA谱显示了广泛的分布，平均大小为 &gt; 1000 bp <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA 片段大小分布；图示；峰分析；分子大小测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：测序文库的典型结果。 微型化电泳结果显示成功构建的测序文库具有较窄的片段大小分布，平均长度约为 250 bp。上下信号代表用于样本比对的标记物。蓝色线条表示平均片段大小（蓝色括号）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳结果，DNA片段化图谱，显示片段大小分布，片段分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：cDNA文库的典型非理想结果。 亚最优cDNA文库的微型电泳结果，显示其平均大小的片段分布情况 &lt; 200 bp。上下信号代表用于样本比对的标记。蓝线表示平均片段大小（蓝色方括号）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳结果，样本强度与片段大小关系，DNA Ladder峰，用于遗传分析的图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：测序文库中典型的非理想结果示例。 微型电泳结果显示一个非理想测序文库的片段大小分布，其中包含200 - 1000 bp的较长片段。上方和下方的信号代表用于样本校准的标记物。蓝色线条表示平均片段大小（蓝色括号）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达数据分析；显示处理差异的柱状图和PCA散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65930/65930fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：探索性数据分析。 探索性数据分析的代表性结果，显示所选免疫调节药物对PBMCs的影响。（A）按基因类型（X轴）分类的检测到的基因数量（Y轴）柱状图。（B）根据不同药物处理着色的数据集中所有基因的PCA分析。相同颜色的点为生物学重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65930/65930fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度</td>
			<td>体积 [µL] /反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐酸胍</td>
			<td>80 mM</td>
			<td>7.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脱氧核苷三磷酸混合物 (dNTPs)</td>
			<td>每种 10 mM</td>
			<td>6.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART dT30VN 引物</td>
			<td>100 µM</td>
			<td>0.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td></td>
			<td>0.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td></td>
			<td>15.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：裂解缓冲液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积 [µL] /反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSRT II buffer (5x)</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (100 mM)</td>
			<td>0.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine (5 M)</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSRT II (200 U/µL)</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA酶抑制剂 (40 U/µL)</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO-LNA (100 µM)</td>
			<td>0.20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>6.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：逆转录（RT）反应体系。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">mRNA 变性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA 变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>冰上放置</td>
			<td>2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">逆转录</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>逆转录</td>
			<td>42 °C </td>
			<td>90 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶失活</td>
			<td>70 °C</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：mRNA变性与逆转录（RT）的PCR仪程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积 [µL] /反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高保真DNA聚合酶</td>
			<td>12.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPCR引物（10 µM）</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>2.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>15.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：预扩增混合液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="3">16 – 18 个循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>67 °C</td>
			<td>20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72 °C </td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：预扩增PCR仪程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>片段化与接头连接（Tagmentation）</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>8 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：打断片段化反应热循环程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">片段化反应混合液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积 [µL] /反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicon Tagment Mix (ATM)</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tagment DNA Buffer (TD)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">扩增富集 PCR 混合液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积 [µL] /反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高保真 DNA 聚合酶</td>
			<td>7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>与 Nextera 兼容的索引引物</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>9.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表7：片段化反应混合液与富集PCR混合液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>热启动</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">16 个循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表8：富集PCR扩增仪程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>仪器</td>
			<td>上样浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq v2</td>
			<td>10 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550</td>
			<td>1.4 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000</td>
			<td>1250 pM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表9：常见测序仪器上样浓度的示例。

本方案描述了从ex vivo或in vitro细胞培养到转录组数据预处理的工作流程，用于低成本的基于转录组的药物筛选。

转录组学能够全面揭示细胞程序及其对扰动的响应。尽管显著降低了……

转录组学使我们能够深入理解细胞程序及其对外部变化的响应。然而，尽管在过去几十年中，文库构建和测序成本已显著降低，但要将该技术应用于药物筛选所需的规模时，其成本仍然过高，限制了这些方法的巨大潜力。本研究提出了一种基于转录组的低成本药物筛选系统。将微型化扰动培养与微型转录组学相结合。优化后的微型转录组学方案可在经济有效的测序深度下提供具有信息量的生物学信号，从而实现对已知药物和新分子的大规模筛选。将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要优势之一，在于有望发现此前未被考虑的新型药物靶点。传统的药物筛选方法通常集中于已知的靶分子或信号通路，这会阻碍新靶点的发现，并可能导致药物出现意料之外的副作用以及疗效受限。首先，将PBMC冻存管置于37摄氏度水浴中解冻两到三分钟，期间轻轻翻转。然后，将解冻后的细胞转移至一个50毫升的锥形管中。用一毫升温热的完全培养基冲洗冻存管，并将溶液逐滴加入锥形管中的细胞，以完成第一次稀释步骤。随后，将细胞悬液以5分钟离心，流畅地倾倒锥形管以去除上清液。用三毫升温热的完全培养基重悬细胞。进行细胞计数时，取10微升细胞悬液与台盼蓝混合。使用10微升染色后的细胞溶液，通过自动细胞计数仪或细胞计数板进行细胞计数。用预热的完全培养基稀释细胞，使其最终浓度达到每毫升1 × 10⁶个细胞。然后将100 µL细胞悬液接种至96孔细胞培养板的每孔中。向每孔加入100 µL的两倍药物稀释液。收集细胞时，将细胞培养板离心10分钟。使用真空泵吸取上清液，同时将泵的吸头置于孔的底部角落，以保留细胞。随后向每孔加入 200 µL 冰冷的 PBS。将培养板离心 5 分钟后，弃去上清液。然后向每个孔中加入 15 µL 裂解缓冲液。使用粘性密封膜密封板以防止污染。涡旋振荡板子并离心 1 分钟。最后，用PCR板收集六微升裂解后的细胞溶液。首先，通过离心收集经药物处理的外周血单个核细胞（PBMCs），并将细胞裂解液收集至PCR板中。离心PCR板，使裂解液聚集于管底。接下来，使用热循环仪进行 mRNA 变性。然后向每个孔中加入 6 µL 逆转录酶反应混合液，使总体积达到 12 µL。密封反应板以防止污染和蒸发。短暂涡旋振荡后，将板放入离心机离心。将板置于热循环仪上，并启动逆转录反应程序。逆转录完成后，对PCR板进行离心，向每个孔中加入15 µL预扩增混合液，并密封。将密封的反应板放入热循环仪中，开始预扩增反应。为纯化cDNA，在每个孔中加入磁性纯化 beads，并在室温下孵育五分钟。将PCR板置于磁力架上五分钟，或直至磁珠完全分离。随后，小心移除上清液。保持微孔板置于磁力架上，轻轻加入 100 µL 新鲜配制的 80% 乙醇以清洗磁珠。孵育 30 秒后，用移液器吸除上清液。将磁力架上的磁珠静置晾干5分钟，或直至乙醇完全挥发且磁珠不再呈现光泽。从磁力架上取下反应板后，用20微升无核酸酶的水重悬磁珠。将反应板再次放回磁力架上，直至磁珠完全分离。将洗脱液转移至预先准备好的用于cDNA质量控制和片段化处理的新PCR板中。进行片段化处理时，为每个反应在新的PCR板中加入三微升片段化反应混合液。每个反应中加入一微升cDNA。立即开始片段化反应。然后通过向每个反应中加入一微升中和片段化缓冲液来中和反应。对于扩增PCR，向每个反应中加入九微升扩增PCR混合液，使总体积达到14微升。启动富集PCR程序。首先，将带有独特索引的文库以等摩尔比例混合。使用高灵敏度检测方法测定最终文库池的浓度，并利用以下公式计算样品的摩尔浓度。现在，根据仪器的规格和任何实验优化要求，加载流动池。在屏幕上选择“测序”以开始运行设置。按照屏幕提示，依次加载流动池、合成试剂盒、簇生成试剂盒和缓冲液试剂盒。当设备识别所有试剂后，在运行设置中添加运行名称。指定测序参数为双端测序，两端读长均为51个碱基对。此外，对两个索引序列进行测序，每个索引读长为8个碱基对。确定用于数据存储的输出目录，然后点击“审查”。在确认所有测序参数正确无误后，选择“开始运行”以启动测序。

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本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

为了鉴定转录因子的新调控因子，我们开发了一种方法，利用基于双荧光素酶的转录报告基因检测技术，对排列式慢病毒或逆转录病毒RNAi文库进行筛选。该方法能够在单次实验中快速且相对低成本地筛选数百个候选基因。...

利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。...

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

本研究介绍了一种运行Pathway2Targets算法的实验方案，该算法是一个R语言脚本，可根据批量RNA测序实验中病例组与对照组样本间细胞内信号通路谱的比较结果，预测并筛选潜在的治疗靶点。...

利用人类差异表达基因列表进行下游通路富集分析与靶点优先排序

了解基于转录组学的经济高效药物筛选方法，利用外周血单核细胞培养结合minibug转录组学技术。该方法可在降低测序深度的同时获取有效生物学信号，帮助研究人员识别新型药物靶点并推动现代药物发现研究。

基于转录组学的低成本药物筛选

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