Name: 火坦解毒通络汤对 H 型高血压大鼠的降压作用及机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 了解火坦解毒通络汤对H型高血压大鼠的降压作用及其抑制内质网应激诱导细胞凋亡的分子机制，为中医药治疗高血压提供实验依据。

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本工作由吉林省自然科学基金（编号：YDZJ202301ZYTS189）资助。

所有动物实验均经长春中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。材料列于材料表中。
1. 动物与处理
<ol>
	<li>将50只成年雄性自发性高血压大鼠（SHRs，50日龄）随机分为五组，包括对照组（CON）、蛋氨酸组（MET）、MET + HTJDTLD + 马来酸依那普利组（EM）、MET + EM组和MET + HTJDTLD组。 
	注：实验大鼠饲养于可控环境中，以确保其舒适与健康。饲养室温度恒定为22 °C，相对湿度为40–60%。笼具由透明聚碳酸酯制成，为每只大鼠提供充足活动空间。光照周期为12小时&#160;明/暗循环，模拟自然昼夜节律。大鼠可自由获取充足的食物和饮水。</li>
	<li>给予大鼠以下饮食干预，持续28天。
	<ol>
		<li>给予MET组大鼠3%蛋氨酸饮食，连续28天，以诱导H型高血压。</li>
		<li>除给予3%蛋氨酸饮食外，对MET + HTJDTLD + EM组大鼠进行灌胃，剂量为1 mL/kg，给予HTJDTLD（1.633 g/mL）和EM（0.2 mg/mL）。</li>
		<li>除给予3%蛋氨酸饮食外，分别对MET + EM组和MET + HTJDTLD组大鼠通过灌胃给予HTJDTLD或EM。 
		注：HTJDTLD由瓜蒌果实（Fructus Trichosanthis，20 g）、丹参根及根茎（Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae，15 g）、金银花（Lonicerae japonicae flos，30 g）、甘松根及根茎（Radix et Rhizoma Nardostachyos，15 g）、当归根（Radix Angelicae sinensis，15 g）、甘草根及根茎（Radix et Rhizoma Glycyrrhizae，10 g）、水蛭（Hirudo，5 g）、红景天根及根茎（Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae，15 g）和玄参根（Radix Scrophulariae，15 g）组成，按先前报道方法煎煮7。马来酸依那普利（EM）溶于纯化水（0.2 mg/mL）作为阳性对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 血压测量
注意：血压测量使用无创血压计进行（材料表）。
<ol>
	<li>经28天处理后，将各组大鼠禁食12小时，并测量血压。</li>
	<li>选择与大鼠体型相匹配的固定装置。本研究所用的固定装置包括圆柱形固定网套、帆布外罩、保温管和稳定用泡沫垫。将大鼠放入固定网套中，再将固定网套置入保温管内，然后将保温管放入帆布外罩中。</li>
	<li>将信号电缆置于外罩下方合适位置。将大鼠尾巴穿过外罩上的开口，并固定在稳定泡沫垫上。测量时应选择无人干扰、安静且温暖的环境。提前20–30分钟将大鼠转移至测量区域，使其适应测量环境。 
	注意：可重复执行步骤2.2–2.3数次以稳定大鼠状态。经过数次训练后，大鼠将逐渐适应该过程，并能迅速稳定下来，便于后续血压测量。</li>
	<li>连接加压传感器的气管接口、信号接口和固定管。将加压传感器置于大鼠尾尖处。</li>
	<li>开始测量血压。当大鼠尾巴插入传感器后，会出现脉搏波形。点击开始/停止按钮以启动或停止测量。 
	注意：设备将自动判断大鼠尾巴是否已插入传感器。若未插入，加压传感器将不会启动加压，亦不会进行测量。</li>
	<li>当血压测量完成后，结果菜单将自动弹出。在结果菜单中查看测量的平均值、标准差（SD）、标准误（SE）和变异系数（CV）。 
	注意：每只大鼠测量三次血压，每次间隔超过2分钟，取平均值作为最终结果。</li>
	<li>测量血压后，&#160;通过腹腔注射过量2%戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死大鼠&#160;。随后，&#160;使用手术剪和有齿镊从会阴部至颈部逐层解剖大鼠&#160;。翻转胸腹腔内容物，定位两肾之间的腹主动脉分叉处，并向上采集至主动脉弓的一段主动脉组织。</li>
</ol>
3. 苏木精-伊红（HE）染色
<ol>
	<li>将主动脉血管组织置于4%多聚甲醛中固定至少24小时。</li>
	<li>取血管标本，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。</li>
	<li>包埋后，连续切片，厚度为3–5 mm。将切片在60–70 °C下烘干，然后于室温（RT）保存。</li>
	<li>将切片依次浸入二甲苯Ⅰ中30分钟、二甲苯Ⅱ中30分钟、100%酒精Ⅰ中10分钟、100%酒精Ⅱ中10分钟、95%酒精Ⅰ中5分钟、95%酒精Ⅱ中5分钟、80%酒精中5分钟进行脱蜡，然后用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>将切片用苏木精染液（Harris法）染色5分钟，自来水冲洗5分钟；用1%盐酸酒精分化10秒，再用自来水充分冲洗15分钟；用氨水洗涤切片5秒，再用自来水充分冲洗15分钟。</li>
	<li>进行显微镜观察，用伊红染色10分钟，并用自来水充分冲洗15分钟。</li>
	<li>将切片依次浸入80%乙醇中10秒、95%酒精Ⅰ中5分钟、95%酒精Ⅱ中5分钟、100%酒精Ⅰ中10分钟、100%酒精Ⅱ中10分钟、二甲苯Ⅰ中10分钟、二甲苯Ⅱ中10分钟进行脱水。</li>
	<li>用中性树胶封片。</li>
	<li>在光学显微镜下观察主动脉组织的组织学变化（物镜100倍，总放大倍数1000倍）。</li>
</ol>
4. 马松三色染色
<ol>
	<li>进行常规脱蜡，步骤类似于苏木精-伊红（HE）染色。</li>
	<li>苏木精染色：将切片浸入苏木精溶液中染色10分钟，随后立即用自来水冲洗。</li>
	<li>将切片浸入1%盐酸溶液中数秒，随后立即用自来水冲洗。</li>
	<li>将切片浸入Lichtenstein酸性品红染液中染色5分钟，然后用水冲洗。</li>
	<li>将切片浸入1%磷钼酸溶液中5分钟。</li>
	<li>将切片浸入2%苯胺蓝染液中染色5分钟，再浸入1%冰醋酸浸洗液中1分钟。然后将切片在95%酒精中快速漂洗3次。</li>
	<li>进行常规脱水、透明和中性树胶封片，步骤类似于HE染色。</li>
</ol>
5. 通过 ELISA 测定 Hcy
<ol>
	<li>通过腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（45 mg/kg）对大鼠进行麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度。&#160;固定大鼠，剪除胡须以避免采血时接触干扰。使用弯头镊子摘除大鼠眼球&#160;，并将血液收集至预先准备的无菌微量离心管中。&#160;随后，通过腹腔注射过量 2% 戊巴比妥钠（100 mg/kg）对大鼠实施安乐死。</li>
	<li>将血液在室温下静置自然凝固 10–20 分钟，然后在 2–8 °C 条件下以 626–1409 × g 离心约 20 分钟。</li>
	<li>小心收集上清液，并将其储存在 -80 °C 冰箱中。</li>
	<li>根据试剂盒说明书在试管中稀释标准品。</li>
	<li>设置空白孔（空白对照孔中不加样品和酶试剂，其余步骤相同）、标准品孔和待测样品孔。向酶标板中加入 50 µL 标准品，向样品孔中加入 40 µL 样品稀释液，然后加入 10 µL 血清（样品最终稀释倍数为 5 倍）。 
	注意：将样品加至孔底，尽量避免接触孔壁，并轻轻振荡混匀。</li>
	<li>用封板膜密封酶标板，在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释 30 倍，配制成工作浓度备用。</li>
	<li>小心揭开封板膜，弃去孔内液体，并震荡以彻底去除残留液体。每孔加入洗涤液，静置 30 秒后弃去。重复此步骤 5 次，并拍干。</li>
	<li>除空白孔外，每孔加入 50 µL 酶试剂。</li>
	<li>用封板膜密封酶标板，于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>重复步骤 5.8。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 显色剂 A，再加入 50 µL 显色剂 B，轻轻振荡充分混匀。在避光条件下于 37 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 终止液以终止反应（蓝色将变为黄色）。</li>
	<li>以空白孔调零，依次在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。 
	注意：加入终止液后应在 15 分钟内完成测定。</li>
</ol>
6. RNA 提取与定量 RT-PCR
<ol>
	<li>提取总RNA。
	<ol>
		<li>迅速将新鲜的主动脉组织切成适当大小（30–50 mg/片），在液氮中充分研磨。加入1 mL Trizol试剂，充分混匀，在冰上孵育10分钟以裂解组织。</li>
		<li>在4 °C下以2250 ×g离心10分钟。小心地将上清液转移至新的微量离心管中，避免触及沉淀。</li>
		<li>加入200 µL氯仿，剧烈振荡15秒，在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>在4 °C下以2250 ×g离心15分钟。混合物将分为三层：下层为苯酚-氯仿有机相，中间相和上层水相。</li>
		<li>小心地将上层水相转移至新的微量离心管中（约为Trizol体积的60%）。切勿吸取中间相；可保留少量上层液体。</li>
		<li>加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀约10次，在室温下静置10分钟。</li>
		<li>在4 °C下以2250 ×g离心10分钟。弃去上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀两次。</li>
		<li>在4 °C下以2250 ×g离心5分钟，弃去上清液，在室温下晾干5–10分钟。</li>
		<li>用15–50 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，并测定RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行逆转录和RT-qPCR（表1）
	<ol>
		<li>采用qRT-PCR检测与内质网应激（ERS）和细胞凋亡相关的基因表达。使用步骤6.1中提取的总RNA，按照试剂盒说明书，利用cDNA合成试剂盒将其逆转录为cDNA。</li>
		<li>使用SYBR Green PCR主混合液，在20 µL反应体系中通过实时PCR检测系统测定基因表达。</li>
		<li>采用2−ΔΔCT法对数据进行定量分析，并以β-actin表达水平为参照，表示为n倍变化。引物序列见表2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 蛋白质印迹（WB）
<ol>
	<li>提取组织总蛋白。
	<ol>
		<li>将少量组织块放入1-2 mL匀浆器的球形部分，用干净的剪刀尽可能将组织块剪碎。</li>
		<li>加入400 µL（w:v=1:10）RIPA裂解缓冲液并进行匀浆。随后将样品置于冰上。数分钟后再次研磨，并再次放回冰上。重复研磨过程数次。</li>
		<li>裂解30 min后，用移液器将裂解液转移至1.5 mL离心管中，并将离心管放入预冷的4 °C离心机中。以2250 x g离心10 min，然后将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白定量。
	<ol>
		<li>根据试剂盒说明书稀释蛋白标准品。配制如下浓度梯度的标准品：0、25、125、250、500、1000、1500和2000 ng/µL。</li>
		<li>取2.5 µL蛋白样品，用样品稀释液稀释至25 µL（10倍稀释）。</li>
		<li>取一块96孔板，分别向各孔中加入20 µL标准蛋白样品（按浓度梯度）和目标蛋白样品，每种目标蛋白样品设两个复孔。</li>
		<li>将显色液A和液B按50:1的比例混合，配制显色工作液（即用即配），每孔加入200 µL显色液。</li>
		<li>将加样后的96孔板置于37 °C培养箱中孵育30 min。</li>
		<li>检测562 nm处的吸光度。</li>
		<li>计算待测蛋白浓度。
		<ol>
			<li>以标准蛋白浓度为纵坐标，562 nm处吸光度为横坐标，绘制标准曲线。</li>
			<li>根据标准曲线所得公式及目标蛋白的实测吸光度，计算目标蛋白浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在微量离心管中，向20 µL蛋白样品中加入180 µL上样缓冲液。将离心管放入金属浴中，在100 °C变性10 min。变性后的蛋白可用于Western blot检测，或于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫印迹（Immunoblotting）。
	<ol>
		<li>配制蛋白电泳凝胶。
		<ol>
			<li>清洗并吹干凝胶制备玻璃板（1 mm或1.5 mm），将其固定在凝胶制备装置上。</li>
			<li>根据表3配制10%分离胶。将配好的分离胶缓慢加入玻璃板之间，避免产生气泡。然后加入适量无水乙醇以平整分离胶液面。室温静置20-30 min，直至凝胶完全凝固。 
			注：蛋白分子量越大，胶浓度应越低，可根据需要配制其他浓度的分离胶。</li>
			<li>根据表3配制5%浓缩胶。待分离胶凝固后，倒掉上层无水乙醇，灌入浓缩胶，并缓慢插入与玻璃板匹配的梳子（注意避免气泡）。室温静置20-30 min，使浓缩胶凝固。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行电泳。
		<ol>
			<li>称取Tris 60.5 g、甘氨酸375 g和十二烷基硫酸钠（SDS）20 g，加水至2 L，60 °C加热搅拌溶解，配制成10x电泳缓冲液。冷却至室温，使用时稀释为1x工作液。</li>
			<li>从凝胶制备装置中取出含凝胶的玻璃板，在水流下以均匀速度拔下梳子，同时排出加样孔中的气泡。</li>
			<li>将玻璃板固定于电泳槽中，加入配制好的1x电泳缓冲液。确保内槽充满缓冲液，外槽液面约为内槽的一半。</li>
			<li>在加样孔中加入等质量的蛋白样品和5 µL蛋白Marker（用于指示蛋白大小）。</li>
			<li>以60 V电泳20 min，然后调至100 V继续电泳90 min，直至上样缓冲液迁移至凝胶底部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行转膜。
		<ol>
			<li>称取Tris 60 g、甘氨酸288 g，加水至2 L，充分搅拌溶解，配制成10x转膜缓冲液，室温保存。使用时按1:2:7的比例（10x转膜液:甲醇:水）稀释为1x工作液。 
			注：转膜缓冲液应提前配制，并于冰箱中冷却至4 °C。</li>
			<li>将PVDF膜在甲醇中浸泡适当时间（0.5-1 min），以激活膜上的正电荷基团，使其更易与带负电荷的蛋白结合。</li>
			<li>取转膜夹，按顺序依次放置组件（黑色面-海绵-滤纸-电泳胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色面），固定夹子。 
			注：注意避免产生气泡；如有气泡，应用滚轮轻轻赶出。</li>
			<li>将夹子放入转膜槽中，注意电极方向正确，槽内放入两个冰袋，并加满1x转膜液。最后将整个转膜槽置于冰浴中。</li>
			<li>设定转膜条件为100 V，1 h。 
			注：可根据蛋白大小调整转膜时间；蛋白分子量越小，转膜时间越短。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>封闭。
		<ol>
			<li>对于磷酸化蛋白，使用5% BSA（溶剂为TBST）作为封闭液；对于非磷酸化蛋白，使用5%脱脂奶粉（溶剂为TBST）进行封闭。</li>
			<li>将封闭液倒入适当大小的孵育皿中，放入PVDF膜，确保膜完全浸没于封闭液中。盖上皿盖，在室温下孵育1 h。</li>
			<li>取出膜，根据Marker显示及各目标蛋白的大小，将膜裁剪为适当大小，并标记序号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>抗体孵育。
		<ol>
			<li>弃去封闭液，用滤纸吸干残留液体。将相应裁剪好的PVDF膜分别放入对应的抗体稀释液中（包括CPR78 [1:1000]、TRAF2 [1:1000]、p-JNK [1:1000]、caspase [1:1000]和GAPDH [1:1000]），置于4 °C旋转摇床上过夜孵育。</li>
			<li>加入1x TBST，在室温下漂洗三次，每次10 min。</li>
			<li>根据二抗说明书，将PVDF膜在二抗稀释液中孵育，室温孵育1 h。</li>
			<li>加入1x TBST，在室温下漂洗三次，每次10 min。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>显影PVDF膜。
		<ol>
			<li>将化学发光试剂盒中的液A和液B等体积混合，充分震荡混匀，现配现用。</li>
			<li>将PVDF膜平铺于保鲜膜上，迅速且均匀地滴加配制好的发光液。室温避光孵育3 min。</li>
			<li>使用增强型化学发光（ECL）Western blot检测试剂检测蛋白条带。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>所有数据均以均值 ± 标准差表示。使用 SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析。当 p &#60; 0.05 时，认为差异具有统计学意义。</li>
</ol>

Antihypertensive Effects of Huotan Jiedu Tongluo in H-Type Hypertensive Rats

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</ol>

我们声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

高血压是最常见的心血管疾病之一，影响约三分之一的成年人，会增加中风、冠心病以及心力和肾功能衰竭的风险8。H型高血压是一种特殊类型的高血压，指原发性高血压与同型半胱氨酸（homocysteine）水平升高同时存在，近年来受到广泛关注9。近年来，口服依那普利叶酸片（EM）联合降压药物在控制血压和降低血同型半胱氨酸（Hcy）水平方面显示出更好的疗效，但仍存在诸多禁忌症、副作用、耐药性等问题，如头痛、头晕、乏力、咳嗽和低血压等。中医药在治疗H型高血压方面具有优势，其个体化治疗、针对病因干预以及协同增效、副作用少等特点，有助于对该疾病的长期有效管理。本研究发现，中药复方侯氏通降汤加味（HTJDTLD）对蛋氨酸诱导的H型高血压具有显著的降压作用。更重要的是，HTJDTLD显著增强了EM的降压疗效，而EM是目前首个获批用于治疗伴有同型半胱氨酸升高的高血压的药物。然而，EM的使用有时会产生一些不良反应。
同型半胱氨酸（Hcy）是一种含硫氨基酸，在蛋氨酸代谢过程中生成，其水平在心血管疾病和神经退行性疾病中升高，包括高血压10、阿尔茨海默病、痴呆11和帕金森病12。先前的研究还表明，高血压与同型半胱氨酸之间的相互作用会影响中老年人群的死亡风险13。Woo 等人14报道，Hcy 水平升高会导致内皮功能障碍，并与动脉僵硬度增加相关，后者是由于弹力纤维破坏和胶原生成增多所致。本研究中，我们发现蛋氨酸处理组血浆 Hcy 水平显著升高，同时伴有血压升高和明显的动脉病理改变。然而，HTJDTLD 治疗显著降低了血压，缓解了动脉病理损伤，并减少了 Hcy 水平。EM 是一种含有依那普利和叶酸的新型复方制剂，已被批准作为首种用于治疗伴有 Hcy 升高的高血压的药物15。值得注意的是，HTJDTLD 增强了降压效果，表现为 Hcy 水平降低以及病理变化的缓解。
内质网（ER）是分泌蛋白和跨膜蛋白合成、折叠及修饰的核心细胞器16内质网正常功能的紊乱可能导致内质网应激，这种应激状态已被发现与多种疾病相关，近年来更与高血压有关17,18此外，既往研究报道表明，同型半胱氨酸（Hcy）可通过破坏二硫键的形成，激活内质网应激，进而降低内皮细胞活力和血管舒张功能。19同型半胱氨酸诱导的内质网应激也可导致内皮细胞凋亡20,21然而，HTJDTLD 是否通过调控内质网应激发挥降压作用尚未被研究。因此，我们探讨了 HTJDTLD 通过内质网应激诱导的细胞凋亡通路所介导的降压作用。GPR78 也被称为 Bip，是一种主要的分子伴侣蛋白，在内质网应激后被激活22肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）也被证实与细胞对内在信号（如内质网应激）的响应相关23TRAF2 启动信号转导级联反应，以细胞和环境依赖的方式导致c-Jun氨基末端激酶（JNK）的活化24Caspase-3 是细胞凋亡的关键执行者，在哺乳动物细胞的凋亡过程中发挥重要作用，并可通过多种途径在多种哺乳动物细胞中被激活25Caspase-3 是细胞凋亡的关键执行者，在多种哺乳动物细胞类型的凋亡过程中发挥重要作用，并可通过多种途径被激活。26Caspase-3 参与内质网应激介导的细胞凋亡，并作为不同凋亡级联途径的最终共同组分27在本研究中，我们通过qRT-PCR和Western blotting检测了GPR78、TRAF2、JNK和caspase 3的基因和蛋白表达。结果显示，蛋氨酸处理显著上调了GPR78、TRAF2、JNK和caspase 3的基因和蛋白表达，而HTJDTLD显著抑制了这些基因和蛋白的表达。然而，仅使用这两种方法仍存在一定的局限性。理想情况下，应通过使用ERS相关信号通路的抑制剂，并结合流式细胞术检测细胞凋亡，以进一步评估HTJDTLD的作用机制。我们将在今后的研究中不断完善实验方案。
我们的结果表明，HTJDTLD 对蛋氨酸诱导的 H 型高血压大鼠具有降压作用。其潜在机制可能与抑制内质网应激激活所诱导的细胞凋亡有关。鉴于 HTJDTLD 在蛋氨酸诱导的高血压大鼠中表现出的降压效果及其可能的作用机制，该方剂在高血压治疗的未来临床应用中具有广阔前景。

高血压是心肌梗死、脑卒中和肾功能衰竭的主要危险因素，已成为影响全球10亿人口的重要公共卫生问题1。同型半胱氨酸（Hcy）是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的重要代谢中间产物。伴有血浆Hcy水平升高的高血压被称为H型高血压，可能是脑心血管疾病（如脑卒中）发生和复发的重要危险因素2,3。近期研究表明，H型高血压共存状态可能加重心脑血管疾病的不良影响4。值得注意的是，中国75%的H型高血压患者为原发性高血压，严重影响生活质量5。目前，H型高血压的治疗主要采用西药，但可能引发一定不良反应且依从性较差，已无法满足H型高血压综合管理的需求。
中医是中国具有两千多年历史的独特资源。由于西医在高血压控制方面仍存在未满足的临床需求，临床医生已开始考虑中医在H型高血压防治中的潜在作用6。豁痰解毒通络方（HTJDTLD）是由邓岳教授根据其丰富的临床经验所制定的中药复方7。在二十多年的临床应用过程中，该方在治疗心脑血管疾病方面已显示出显著疗效1。然而，目前尚未见关于豁痰解毒通络方对H型高血压是否具有治疗作用的报道。因此，本研究旨在探讨豁痰解毒通络方在H型高血压大鼠中的降压作用及其具体作用机制，并寻找治疗H型高血压的潜在有效药物。

<table><tbody><tr><td>qPCR用第一链cDNA合成超混合液</td><td>Yeasen,中国</td><td>11149ES</td><td>cDNA合成试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗β-肌动蛋白抗体</td><td>Bioss, 中国</td><td>bs-0061R</td><td></td></tr><tr><td>抗caspase-3抗体</td><td>Bioss, 中国</td><td>bs-0081R</td><td></td></tr><tr><td>抗GPR78抗体</td><td>Abcam, 美国</td><td>ab108513</td><td></td></tr><tr><td>抗JNK抗体</td><td>Abcam, 美国</td><td>ab76572</td><td></td></tr><tr><td>抗p-JNK抗体</td><td>Bioss, 中国</td><td>bsm-52462R</td><td></td></tr><tr><td>抗兔IgG抗体</td><td>Bioss, 中国</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>抗TRAF2抗体</td><td>Bioss, 中国</td><td>bs-22372R</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96</td><td>实时PCR检测系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECL Western印迹底物</td><td>Merck, 马萨诸塞州, 美国</td><td>WBULP-10ML</td><td></td></tr><tr><td>马来酸依那普利叶酸片</td><td>扬子江药业集团有限公司, 中国</td><td>20040991</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>Sigma</td><td>FSSGMMRO</td><td></td></tr><tr><td>栝楼果实</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>水蛭</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>智能无创血压计&amp;nbsp;</td><td>北京 Softron 生物技术公司</td><td>BP-2010A</td><td></td></tr><tr><td>金银花</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>甲硫氨酸</td><td>Sigma, 美国</td><td>M9500</td><td></td></tr><tr><td>当归根</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>甘草根及根茎</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>甘松根及根茎</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>红景天根及根茎</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>丹参根及根茎</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>玄参根</td><td>长春中医药大学第一附属医院, 中国</td><td>无目录编号</td><td></td></tr><tr><td>大鼠同型半胱氨酸ELISA试剂盒</td><td>上海美面工业有限公司, 中国</td><td>MM-0293R2</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>上海碧云天生物技术公司</td><td>P0013B</td><td></td></tr></tbody></table>

火痰解毒通络汤对h型高血压大鼠的降压作用及其机制

The Antihypertensive Effects and Mechanisms of Huotan Jiedu Tongluo Decoction in Rats with H-Type Hypertension

H型高血压是一种以血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平升高为特征的特殊类型高血压，已成为全球主要的公共卫生挑战。本研究探讨了活痰解毒通络方（HTJDTLD）——一种常用于治疗血管狭窄的高效中药复方——的降压作用及其潜在机制。采用蛋氨酸诱导大鼠H型高血压模型，并通过灌胃给予HTJDTLD。随后，采用无创尾动脉测压法测定大鼠的收缩压和舒张压。通过苏木精-伊红（HE）染色对主动脉进行组织学评估。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测Hcy水平，采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（western blotting）测定葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）、c-Jun氨基末端&#160;激酶（JNK）和caspase-3的mRNA及蛋白表达水平。结果显示，HTJDTLD在蛋氨酸处理后显著降低血压，减轻组织病理学损伤，并降低Hcy水平。此外，HTJDTLD显著抑制了主要参与内质网（ER）应激诱导凋亡通路的GRP78、JNK、TRAF2和caspase-3的基因和蛋白表达。总体而言，研究结果表明HTJDTLD对H型高血压大鼠具有显著的降压效果，并揭示其降压机制与抑制内质网应激诱导的凋亡通路激活有关。

如图所示 表4 和 表5在1至4周期间，MET组的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）显著高于CON组。经HTJDTLD治疗后，大鼠的SBP和DBP显著低于MET组。值得注意的是，HTJDTLD与EM联合使用比单独使用HTJDTLD具有更强的降压作用。
根据HE染色和Masson三色染色结果，MET组主动脉血管内膜不完整且不光滑，中膜显著增厚，与CON组相比，平滑肌细胞出现增殖和肥大，排列层数增加，纤维排列紊乱。然而，在MET + HTJDTLD + EM、MET + EM和MET + HTJDTLD组中，血管内膜恢复更完整且表面更光滑，中膜增厚明显减轻，内膜损伤显著缓解（图1 和 图2）。此外，甲硫氨酸（MET）组的同型半胱氨酸（Hcy）浓度是对照组的2倍。然而，MET + HTJDTLD + EM、MET + EM和MET + HTJDTLD组的Hcy浓度显著低于MET组。值得注意的是，MET + HTJDTLD + EM组的降低最为显著，其Hcy浓度比MET组约低1倍（图3）。mRNA和蛋白质表达结果显示，甲硫氨酸处理后GPR78、TRAF2、JNK、p-JNK和caspase-3的表达明显上调。然而，HTJDTLD、EM以及HTJDTLD与EM联合使用均显著抑制了GPR78、TRAF2、JNK和caspase-3的上调表达。值得注意的是，HTJDTLD与EM联合应用的效果最为显著（图4 和 图5）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65932/65932fig01.jpg" /> 
图1：HE染色。 胸主动脉组织的组织学变化，分别来自（A）CON组、（B）MET组、（C）MET + HTJDTLD + EM组、（D）&#160;MET + EM组，以及（E）MET + HTJDTLD组。细胞核呈蓝色，而细胞质和细胞外基质呈现不同程度的粉红色染色（100倍放大）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65932/65932fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65932/65932fig02.jpg" /> 
图2：Masson染色结果。（A）CON组，（B）MET组，（C）&#160;MET + HTJDTLD + EM组，（D）MET + EM组，以及（E）MET + HTJDTLD组。对各组主动脉血管进行Masson染色，以评估HTJDTLD对沉积物及纤维化的影响（100倍放大）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65932/65932fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65932/65932fig03v2.jpg" /> 
图3：Hcy 水平。采用 ELISA 法检测各组血清 Hcy 浓度。数据以均值 ± 标准差表示（n = 6，标准差分别为：CON：236.5 nmol/L，MET：185 nmol/L，MET + HTJDTLD + EM：126.8 nmol/L，MET + EM：124 nmol/L，MET + HTJDTLD：325 nmol/L）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65932/65932fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65932/65932fig04.jpg" /> 
图4：GRP78、TRAF2、JNK 和 caspase-3 的 mRNA 表达水平。 经 MET、MET + EM + HTJDTLD 及 MET + EM 处理后，采用 qRT-PCR 检测内质网应激相关基因的表达。数据以均值 ± 标准差表示（n = 6，标准差如下：GRP78 [CON: 0.12, MET: 0.13, MET + HTJDTLD + EM: 0.11, MET + EM: 0.17, MET + HTJDTLD: 0.12]；TRAF2 [CON: 0.09, MET: 0.09, MET + HTJDTLD + EM: 0.07, MET + EM: 0.11, MET + HTJDTLD: 0.13]；JNK [CON: 0.99, MET: 0.01, MET + HTJDTLD + EM: 0.03, MET + EM: 0.06, MET + HTJDTLD: 0.07]；caspase-8 [CON: 0.06, MET: 0.10, MET + HTJDTLD + EM: 0.01, MET + EM: 0.13, MET + HTJDTLD: 0.03]）。* 表示与 CON 组相比具有显著差异，# 表示与 MET 组相比具有显著差异，Δ 表示与 MET + HTJDTLD 组相比具有显著差异，∇ 表示与 MET + EM 组相比具有显著差异。p &#60; 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65932/65932fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65932/65932fig05.jpg" /> 
图5：GRP78、TRAF2、JNK、p-JNK 和 Caspase-3 的蛋白表达。（A）使用 GRP78、TRAF2、JNK、p-JNK 和 Caspase-3 抗体通过 Western 印迹法分析蛋白样品，GAPDH 作为对照。（B）通过密度测定法对 GRP78、RAF2、JNK、p-JNK 和 Caspase-3 蛋白进行定量，并以 GAPDH 为基准进行归一化。数据以均值 ± 标准差表示（n = 6）。* 表示与 CON 组相比具有显著性差异，p &#60; 0.01；# 表示与 MET 组相比具有显著性差异，Δ 表示与 MET + HTJDTLD 组相比具有显著性差异，∇ 表示与 MET + EM 组相比具有显著性差异，p &#60; 0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65932/65932fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>逆转录反应</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分&#160;</td>
			<td>体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总RNA</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA消化混合液</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix plus</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水&#160;</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">反应程序如下：25 °C，5 分钟；55 °C，15 分钟；85 °C，5 分钟。&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分&#160;</td>
			<td>体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物 (10μM)</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物 (10μM)</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green qPCR Mix</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">反应程序如下：预变性 95 °C，5 分钟；变性 95 °C，10 秒；退火/延伸 60 °C，45 秒，共 40 个循环。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：逆转录反应体系体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列 (5’ 至 3’)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPR78-F</td>
			<td>CGTCGTATGTGGCCTTCACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPR78-R</td>
			<td>ATTCCAAGTGCGTCCGATGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAF2-F</td>
			<td>GAAGGGAGCATTCCTAGACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAF2-R</td>
			<td>GAAGGGAGCATTCCTAGACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JNK-F</td>
			<td>GTCAGAATCCGAACGAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JNK-R</td>
			<td>GTCTACGCAGGCAATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3-F</td>
			<td>GCGGTATTGAGACAGACAGTGGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3-R</td>
			<td>GCGGTAGAGTAAGCATACAGGAAGTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：引物列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% 分离胶，5 mL 体系：</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mol/L Tris-HCL (pH 8.8)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>0.002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% 浓缩胶，3 mL 体系：</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分&#160;</td>
			<td>体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mol/L Tris-HCL (pH 6.8)</td>
			<td>0.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>0.003</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：分离胶和浓缩胶的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组别</td>
			<td>1 周</td>
			<td>2 周</td>
			<td>3 周&#160;</td>
			<td>4 周</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CON</td>
			<td>163.4 ± 6</td>
			<td>150.1 ± 7.0</td>
			<td>134.2 ± 9.9</td>
			<td>158.8 ± 10.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET</td>
			<td>192.1 ± 9.5##</td>
			<td>166.7 ± 12.8#</td>
			<td>177.3 ± 19.7##</td>
			<td>187 ± 23.6##</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+HTJDTLD+EM</td>
			<td>165.4 ± 9.2##</td>
			<td>148.9 ± 11.1*</td>
			<td>134.5 ± 12.3**</td>
			<td>159.2 ± 19.6**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+EM</td>
			<td>173 ± 9.1##</td>
			<td>149.9 ± 18.7*</td>
			<td>145 ± 12.5**</td>
			<td>162.4 ± 19.1**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+HTJDTLD</td>
			<td>176.7 ± 8.4##</td>
			<td>154.9 ± 22.8</td>
			<td>168.3 ± 10.2</td>
			<td>172.2 ± 17.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：收缩压的变化。&#160;#p &#60; 0.05 且 ##p &#60; 0.01，与对照组比较；*p &#60; 0.05 且 **p &#60; 0.01，与 MET 组比较。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组别</td>
			<td>1周</td>
			<td>2周</td>
			<td>3周&#160;</td>
			<td>4周</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CON</td>
			<td>138.4 ± 13.8</td>
			<td>121.2 ± 12.5</td>
			<td>107 ± 19.7</td>
			<td>131.1 ± 16.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET</td>
			<td>147.9 ± 7.7#</td>
			<td>131 ± 11.9</td>
			<td>143.7 ± 19.6##</td>
			<td>146 ± 21.4##</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+HTJDTLD+EM</td>
			<td>139.4 ± 10</td>
			<td>123.1 ± 18.5</td>
			<td>117.1 ± 9.6**</td>
			<td>129.2 ± 18.6**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+EM</td>
			<td>140.9 ± 13.4</td>
			<td>119.6 ± 7.8</td>
			<td>123.6 ± 10.8**</td>
			<td>128 ± 25.2**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET+HTJDTLD</td>
			<td>140.4 ± 11.3</td>
			<td>129.5 ± 11.1</td>
			<td>138.3 ± 15.1</td>
			<td>132.8 ± 16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：舒张压的变化。#p &#60; 0.05 且 ##p &#60; 0.01，与对照组比较；**p &#60; 0.01，与MET组比较。

本文介绍了一种诱导H型高血压并评价经口灌胃给予活痰解毒通络方（HTJDTLD）抗高血压作用的实验方案。在H型高血压大鼠模型中，HTJDTLD表现出有效的降压作用，其机制可能与抑制内质网（ER）应激诱导的细胞凋亡通路激活有关。

火痰解毒通络汤对H型高血压大鼠的降压作用及其机制

H型高血压是一种以血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平升高为特征的特殊类型高血压，已成为重要的公共卫生问题……

H型高血压已成为人类重要的公共卫生挑战。目前主要依赖西医治疗，虽有一定疗效，但仍存在局限。本研究探讨了活痰解毒通络汤这一中药复方在H型高血压大鼠中的降压作用及其作用机制。本研究表明，化痰解毒通络汤对H型高血压大鼠具有降压作用。其潜在机制可能与抑制内质网应激激活所诱导的细胞凋亡有关，从而为患者提供一种有效的治疗选择。未来我们将探索H型高血压早期诊断与预后评估的潜在生物标志物，并开发新的治疗策略。首先，将50只高血压大鼠分为五组，其中包括对照组。给予第一组大鼠（即甲硫氨酸组）含3%甲硫氨酸的饮食，持续28天，以诱导H型高血压。对于第2至第4组大鼠，在甲硫氨酸饮食的基础上，同时给予豁痰解毒通络汤联合马来酸依那普利，持续28天。接下来，通过将圆柱形束缚网放入热缩管中，并将热缩管置于帆布套内，制备一个固定装置。经过28天的处理后，将大鼠放入束缚网中。然后，将无创血压计的信号线置于套子下方。将大鼠尾巴置于盖板的缝隙中，并固定在稳定垫上。在测量血压前 20 至 30 分钟，将大鼠转移至安静的测量场所。然后连接加压传感器的气管接头、信号连接线和固定管。将压力传感器放置在大鼠尾尖。将大鼠尾巴插入传感器后，应出现脉搏波形。按开始/停止按钮以启动或停止测量。血压检测完成后，结果菜单将自动弹出。在结果菜单中查看测量的平均值、标准差、标准值和变异系数。处死大鼠后，使用手术剪和齿镊从会阴部至颈部进行解剖。翻转胸腹部内容物，然后定位至两侧肾脏之间的腹主动脉分叉处。从该处开始向上收集主动脉，直至主动脉弓的一段区域。从第一周到第四周，与对照组相比，代谢组的收缩压和舒张压显著升高。给予豁痰解毒通络汤后，血压下降。豁痰解毒通络汤与马来酸依那普利联合使用的效果比单用豁痰解毒通络汤具有更强的降压作用。首先，在2至8摄氏度条件下，以626至1,409 ×g离心含有凝固血液的试管20分钟。然后小心收集上清液至新试管中。将上清液在-80摄氏度下保存。接下来，设置空白孔、标准品孔和样品孔。将稀释后的标准品各50微升加入ELISA板孔中，然后将40微升稀释后的样品转移至样品孔中。再向样品孔中加入10微升血清。现在，用封板膜密封微孔板。将密封后的微孔板置于37°C的培养箱中孵育30分钟。用蒸馏水将30倍浓缩的洗涤液稀释，得到1倍浓度的洗涤液。接下来，从板上移除封板膜，并弃去液体。然后，每孔加入200 µL洗涤液，重复5次。最后一次弃去上清液后，将板拍干。除空白孔外，向所有其他孔中加入50微升酶试剂。然后用封板膜密封酶标板，于37摄氏度孵育30分钟。再次洗涤酶标板五次后，每孔加入50微升显色剂A和50微升显色剂B。轻轻振荡酶标板以充分混匀，然后在低光照条件下于37摄氏度孵育10分钟。现在，向每个孔中加入50微升终止液以终止反应。依次在450纳米处测定每个孔的吸光度。甲硫氨酸组的血浆同型半胱氨酸浓度是对照组的两倍。治疗组的血浆同型半胱氨酸浓度相对较低。

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Biochemistry

生物化学

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