过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

我们的主要研究基于对过敏性鼻炎的探讨。本研究旨在分析与过敏性鼻炎相关的蛋白质。目前，多色免疫荧光技术已被用于推动本领域的研究进展。

在未来的研究中，我们将聚焦于中医药治疗过敏性鼻炎的可能机制。首先，使用手术刀沿已处死大鼠口角两侧进行精确切口，以暴露肌肉组织。然后使用组织剪剪断颅骨两侧的颧骨与下颌骨关节。

然后，移除下颌骨。使用组织剪剪断鼻腔与上颌骨之间的骨性连接。接着，使用止血钳分离上颌骨的皮肤以暴露鼻腔。

在眶下孔处切断鼻腔与两侧眼眶骨之间的连接，并移除鼻腔。将取出的鼻腔置于4%多聚甲醛溶液中固定。为脱钙组织，用蒸馏水清洗固定后的组织。

将组织置于脱钙液中，脱钙液体积为组织体积的20至30倍，室温下进行。脱钙完成后，将组织放入脱水盒中。将脱水盒转移至脱水机，用逐渐递增的酒精浓度对组织进行脱水，不同浓度酒精中孵育时间不同。

接着，将组织放入无水乙醇中处理30分钟，重复两个循环。随后，将组织转移至二甲苯中浸泡5至10分钟，并重复一次。然后，将组织浸入石蜡中1小时。

将石蜡包埋块放入包埋盒中。待石蜡完全凝固后取出，修整石蜡块。将修整好的石蜡块装入石蜡切片机，切成三微米（3 µm）厚的切片。

对照组大鼠的苏木精-伊红染色显示上皮细胞和纤毛排列整齐。疾病组鼻中隔黏膜出现损伤并脱落，伴有明显的中性粒细胞浸润。首先，将苏木精-伊红染色的大鼠鼻黏膜组织切片置于显微镜载物台上。

调节显微镜焦距，直至图像清晰可见。以40倍放大倍数拍摄组织图像。加热柠檬酸磷酸盐缓冲液至沸腾。

然后，将容器从热源移开，加入载玻片。加热八分钟至沸腾后，关闭热源静置八分钟，随后调至中低火加热七分钟。待容器自然冷却后，将切片转移至 PBS 中。

使用脱色摇床将切片振荡五分钟。接着，用免疫组织化学笔在干燥的组织周围画一个圆圈。在孵育前，向切片上加入3%过氧化氢溶液。

然后，将切片转移至 PBS 中，按前述方法进行洗涤。封闭时，在标记的圆圈内加入 5% 的山羊血清。孵育后，小心移除封闭液，并向组织切片中加入一到两毫升 Foxp3 抗体。

然后，将切片置于湿盒中，于4°C孵育过夜。用PBS洗涤切片后，用滤纸轻轻吸干切片。随后，向切片中加入一至二毫升的二抗溶液。

接下来，在避光条件下，于室温将切片与100微升的酪胺信号放大工作液孵育10分钟。孵育结束后，用PBS洗涤切片三次，每次五分钟。现在，在孵育前向切片加入一至二毫升DAPI染色液。

将切片在淬灭剂中孵育5分钟以淬灭自发荧光，随后用PBS洗涤10分钟。然后用抗荧光淬灭剂封片。在20倍和40倍放大倍数下采集染色切片的显微图像。

对照组大鼠的苏木精-伊红染色显示上皮细胞和纤毛排列整齐。疾病组鼻中隔黏膜出现损伤并脱落，伴有明显的中性粒细胞浸润。多重免疫荧光染色表明，疾病组中ROR gamma t和TICAM-1的表达增加。

然而，Foxp3 的表达水平较低。