用于多重荧光成像的琼脂糖包埋肺组织自动振动切片

该方案在肺移植和肺再生的大动物模型（如猪）中尤为有用，可在不同时间点采集小块组织样本。该技术有助于我们更好地理解这些模型中的空间生物学特征。该技术制备的肺组织切片经过最少程度的处理，适用于免疫荧光成像，且无需抗原修复步骤，迄今为止测试的所有抗体均能有效应用。

该方法可进行调整，以切取稍厚的切片，例如约一毫米厚，随后可用于光片荧光显微镜，以研究更三维空间内的蛋白质表达情况。我们的研究致力于探索影响肺移植排斥反应的因素，并利用猪模型开发减少排斥反应的治疗方法。该技术有助于理解术后影响移植效果的空间蛋白质变化。

目前，我们正在利用该技术探索猪肺移植模型中的空间蛋白质表达图谱。我们希望该技术能够帮助我们更深入地理解实验性治疗背后的机制。成功的关键在于振动切片机的切片效果，若切片效果不佳，应重点关注刀片振幅是否足够高以及推进速度是否过快。

首先，在室温下用4%多聚甲醛固定猪肺组织48小时。然后将肺组织转移至含有30毫升PBS（含0.01%叠氮化钠）的50毫升锥形管中。准备好一个塑料杯、精细镊子和无菌剪刀。

将琼脂糖放入微波炉中加热至沸腾，然后在水浴中冷却至42摄氏度。待用时，将其保存在水浴中。

将肺活检组织从 PBS-叠氮化钠溶液中取出。使用精细镊子和无菌剪刀将肺叶仔细解剖成较小的组织块。接着，从塑料杯的中部向下剪开。

在杯子底部倒入少量琼脂糖。将一个50毫升锥形管的管盖（去除边缘）放置在琼脂糖表面。将此装置置于4摄氏度环境中静置五分钟，使琼脂糖凝固。

琼脂糖凝固后，从冰箱中取出塑料杯。然后在杯盖上倒入约一毫升液态琼脂糖。接着将肺组织块轻轻放置在杯盖上。

待琼脂糖部分凝固后，缓慢将肺组织浸入液态琼脂糖中。将装置置于4°C冰箱中冷藏约15分钟，直至琼脂糖完全凝固。使用锋利刀片小心去除肺组织周围多余的琼脂糖。

首先，将肺组织包埋在琼脂糖中。为准备切片，先用超级胶水将每块组织固定在振动切片机的样品盘上，并在周围浴槽中加入冰块。然后小心地将样品盘安装到缓冲槽中，并向槽内加入磷酸盐缓冲液（PBS）。

接下来，设置振动切片机参数，切片厚度保持为 200 微米，频率为 100 赫兹，刀片振幅为 1.3 毫米，刀片前进速度控制在 0.02 至 0.03 毫米每秒之间。开始对肺组织进行切片。当切出足够数量的切片后，使用毛刷轻轻将组织切片从振动切片机的托盘中提起。

将切片转移至含有 PBS-叠氮化钠溶液的 24 孔板中。在 4 摄氏度条件下保存肺切片。首先对肺组织进行包埋和琼脂糖包埋，然后使用振动切片机进行切片。

向切片组织中加入 300 微升封闭剂。将培养板置于 4 摄氏度摇床中，轻柔振荡孵育 45 分钟。随后，用移液器向每孔加入 300 微升 PBS 稀释的一抗溶液。

将培养板在4°C下轻轻振荡孵育过夜。现在轻轻吸出一抗，注意不要触碰组织切片。用400 µL PBS洗涤切片三次。

接下来，将300微升稀释后的二抗加入每个孔中。在4°C孵育90分钟后，移除抗体溶液。然后向各孔中加入DAPI和番茄凝集素-488（tomato lectin-488）。

将混合物孵育30分钟。去除DAPI和番茄凝集素后，用PBS清洗切片，每次10分钟，共洗三次。用刷子将切片转移至载玻片上。

在载玻片上滴加三滴封片介质，成像前盖上盖玻片。小鼠、猪和人肺组织切片经免疫荧光染色检测SMA、弹性蛋白（elastin）和LEA。观察到SMA和弹性蛋白分布在肺泡管、血管、支气管和肺泡等结构中。

对成人与婴儿人类中Ⅱ型肺泡细胞分布的比较分析已进行。Ⅱ型肺泡细胞抗体HT2-280对肺泡细胞表面具有强亲和力。婴儿样本的Ⅱ型肺泡细胞计数显著更高。

然而，婴儿样本的支架覆盖率也显著高于成人。基于支架覆盖率的Ⅱ型肺泡细胞数量在婴儿中也显著更高。