利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

我们的研究探讨了衰老和疾病中干细胞功能障碍的分子机制。我们的目标是理解肌肉干细胞和前体细胞如何与肌肉微环境中的其他细胞相互作用，以实现有效的再生。我们还在研究在衰老和疾病过程中，细胞间的相互通讯是否会影响肌肉干细胞的功能。

研究干细胞微环境中细胞间通讯的主要障碍之一是缺乏能够提供单细胞分辨率的技术。单细胞质谱流式技术可对复杂组织中的多种细胞类型和分子表型进行高通量、多参数的同步定量分析。本实验方案通过针对细胞表面标志物和成肌转录因子的抗体，实现对肌肉再生过程中稀有干细胞及其子代细胞的分离与深度分析。

研究这些细胞有助于我们理解肌肉干细胞命运的调控机制，并揭示在有效再生过程中驱动细胞状态转变的分子网络。在单细胞水平上同时检测多达50种细胞表面和细胞内蛋白，是研究肌肉组织中细胞功能的一种重要方法。该技术能够识别独特的分子特征，并揭示衰老和疾病状态下肌肉干细胞功能障碍的新机制。

本方案可用于研究细胞状态转变如何影响健康与疾病中的组织再生。我们在此展示的活化干细胞特征，使得此前无法开展的干细胞静息状态研究成为可能。现在，我们仅凭细胞表面标志物即可纯化活化干细胞（CD98高表达、CD44高表达），并首次研究其如何重返静息状态。

首先，将稀释于无菌0.9%生理盐水中的布托啡诺溶液和稀释于磷酸盐缓冲液（PBS）中的蛇毒神经毒素溶液置于冰上。在鼻罩装置下，使用剃毛器剃除麻醉小鼠后肢的毛发，然后将小鼠放回诱导箱中。用胰岛素注射器分别准备15微升（µL）用于腓肠肌（GA）注射和10微升（µL）用于胫骨前肌（TA）注射的蛇毒神经毒素溶液。

将小鼠移至鼻锥装置后，用乙醇棉片消毒注射部位。将针头斜面向下，以30度角插入胫前肌（TA肌）肌腹。推进针头使其与胫骨平行，到达TA肌中部肌腹，缓慢注射蛇毒神经毒素（notexin）溶液，持续10秒。

将针头以45度角插入腓肠肌外侧头中段肌腹处，注射蛇毒肌毒素（notexin）溶液。将小鼠翻转，使用胰岛素注射器皮下注射布托啡诺。根据以下公式计算每只小鼠所需的碘脱氧尿苷溶液体积。

使用胰岛素注射器，在安乐死前 8 至 12 小时，于已消毒的注射部位进行碘脱氧尿苷溶液的腹腔注射。小鼠安乐死后，从后肢分离胫前肌（TA）和腓肠肌（GA），并将其置于培养皿盖中。用剪刀将组织剪碎成匀浆状。

将切碎的组织转移至含有5毫升冰上预冷的解离缓冲液的50毫升离心管中，并置于冰上保存。待样本管在37摄氏度加热后，于培养箱中旋转孵育45分钟，向样本管中加入10毫升洗涤培养基并涡旋混匀。离心样本管，弃去上清液，保留约4毫升沉淀。

接下来，向细胞中各加入 0.5 毫升的胶原酶和分散酶。然后涡旋混匀并进行孵育。孵育结束后，离心消化后的样品，并用 5 毫升移液管重悬沉淀物。

接下来，用5毫升洗涤液预润湿置于50毫升离心管上的40微米细胞滤筛。使用带20号针头的5毫升注射器，将细胞悬液反复吹打10次。然后，将细胞悬液通过预润湿的40微米细胞滤筛进行过滤。

用10毫升洗涤液收集并过滤剩余细胞后，通过离心沉淀细胞悬液，吸除试管中的上清液，并轻轻弹击沉淀物以使其松散。首先，将从经碘脱氧尿苷标记的notexin损伤小鼠中分离的骨骼肌细胞重悬于1毫升冷的无血清DMEM中，并使用血细胞计数板或细胞计数仪进行计数。在通风橱内，加入顺铂储备液，使其终浓度达到25 µM。

将离心管涡旋振荡10秒，并在室温下孵育1分钟。用含10% FBS的冰冻DMEM终止反应，并将样品置于冰上。离心并重悬细胞后，通过35微米细胞滤网过滤细胞悬液。

在通风橱下，加入过滤后的多聚甲醛储备液以固定细胞悬液，并涡旋振荡30秒。用2毫升细胞染色液（CSM）通过离心洗涤两次。最后一次洗涤后，吸除上清液至约60微升，充分重悬细胞沉淀。

加入40微升在CSM中配制的2.5倍表面抗体染色混合液，涡旋混匀，每20分钟涡旋一次，孵育1小时。用CSM洗涤样本两次后，吸去上清液并轻弹管底沉淀。为透化细胞，在通风橱内将0.5毫升预冷甲醇逐滴加入，同时涡旋混匀。

用一毫升 CSM 通过离心洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，吸除上清液至约 60 微升，充分重悬沉淀。将细胞与 40 微升胞内抗体染色混合液一起孵育一小时，每 20 分钟涡旋震荡样品一次。

用一毫升 CSM 洗涤细胞两次后，将样品重悬于 0.5 毫升的嵌入剂铱溶液中并涡旋振荡。首先，取经顺铂金属偶联抗体和嵌入剂铱溶液染色的骨骼肌细胞，通过离心使细胞成团。去除上清液后，向涡旋振荡后的细胞中加入一毫升 CSM。

通过离心沉淀细胞，并用一毫升 CAS 缓冲液洗涤。离心后，吸除上清液至大约 200 微升。向涡旋混匀的样品中加入一毫升 CAS 缓冲液，并分装五微升用于细胞计数。

离心细胞后，吸除上清液至剩余50微升，用CAS缓冲液重悬细胞，使终浓度为每毫升100万个细胞，并加入校准微球，使其终浓度为0.1倍。将样品加载至质谱流式细胞仪，以每秒400至500个细胞的流速采集数据，采集完成后对数据进行归一化处理。如有需要，可将每个样品的独立流式细胞术标准文件（FCS文件）合并为单个文件。

通过门控选择铱嵌入剂阳性事件来鉴定单细胞。选择对顺铂呈阴性的事件以圈定活细胞。对目标细胞群进行门控，并定量分析干细胞与前体细胞的相对比例。

为了进行高维分析，导出目标细胞群并使用聚类算法。对于X偏移分析，请下载Vortex软件包和64位Java。将导出的细胞群上传至本地数据库，并定义聚类参数。

为了可视化X shift聚类中细胞群体之间的空间关系，执行一种受力导向布局。质谱流式细胞术（CyTOF）分析鉴定出四个细胞群体的序列，包括干细胞以及第一至第三类前体细胞群体。前体细胞群体P1和P2对应于成熟度逐渐增加的前体细胞。

P3 之前因丰度较低而被识别但未被表征。通过 C104 双轴点图分析 CD9，研究损伤后干细胞与祖细胞的动态变化。在第3天观察到干细胞群体显著增加，提示其发生扩增。

碘脱氧尿苷掺入增加支持了这一结果，表明细胞增殖增强，并且MyoD表达升高，如颜色叠加图所示。在损伤后第3天，通过高表达CD98、CD44、MyoD和碘脱氧尿苷标记的活化干细胞被鉴定出来，凸显其处于高度增殖和活化状态。