Name: 通过高维单细胞质谱流式细胞术鉴定和分析急性骨骼肌损伤过程中体内肌源性祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习使用高维单细胞质谱流式细胞术和FACS技术，在小鼠模型中分析急性骨骼肌损伤后的肌源性祖细胞动态变化。该方法可揭示肌肉干细胞命运调控机制，为衰老相关肌肉退化的治疗策略提供新靶点。

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感谢奥胡斯大学生物医学系FACS核心设施的成员提供的技术支持。感谢生物医学系质谱流式细胞术单元负责人Alexander Schmitz给予的讨论和帮助。科学插图使用Biorender.com制作。本研究由奥胡斯大学研究基金会（AUFF）启动资助以及诺和诺德基金会启动包资助（0071113）支持，资助对象为E.P。

Single-Cell CyTOF Analysis of Myogenic Progenitors in Muscle Regeneration

作者声明无利益冲突。

骨骼肌再生是一个依赖成体干细胞功能的动态过程。尽管以往的研究主要关注肌肉干细胞在再生过程中的作用，但其子代细胞的功能 体内 由于缺乏用于识别和分离这些细胞群体的工具，该领域研究尚不充分15,16,17,18在此，我们介绍一种可同时鉴定并分离肌肉干细胞与前体细胞的方法 体内 在骨骼肌中，并解析其在急性肌肉损伤背景下的细胞与分子动态变化19.
本文介绍的方法结合了高维质谱流式细胞术（CyTOF）分析与细胞分选技术，为深入理解细胞状态转变如何驱动有效的组织再生提供了工具，并揭示了在衰老及肌肉疾病过程中干细胞功能的改变52。在遗传性小鼠模型中或药物干预后，不同细胞群体相对比例的变化可为肌生成过程提供机制性见...

骨骼肌是人体中质量最大的组织，调控多种功能，从视力到呼吸，从姿势维持到运动，以及新陈代谢1。因此，维持骨骼肌的完整性和功能对健康至关重要。骨骼肌组织由紧密排列的多核肌纤维束构成，肌纤维周围分布着复杂的神经和血管网络，具有显著的再生潜能1,2。
骨骼肌再生的主要驱动因素是成体肌肉干细胞（MuSCs）。由于其独特的解剖位置位于肌纤维质膜旁且基底膜下方，这类细胞也被称为卫星细胞，于1961年首次被发现3。MuSCs表达一种独特的分子标志物——转录因子Pax7（paired box 7）4。在健康成人体内，这些细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活，增殖并产生子代细胞，这些子代细胞将（i）分化为具有融合能力的肌细胞，形成新的肌纤维以修复肌肉损伤，或（ii）自我更新以补充干细胞库5。
在细胞和分子水平上，再生过程具有高度动态性，涉及细胞状态的转变，其特征是关键成肌转录因子（也称为成肌调节因子，MRFs）的协调表达。6,7之前 体内 发育研究、谱系示踪实验以及利用成肌细胞进行的细胞培养工作&#160;研究表明，这些转录因子的顺序表达可驱动成肌作用：成肌因子5（Myf5）在细胞激活时表达，成肌分化因子1（MyoD1）的表达标志着向成肌程序的定向，而肌源性生成素（MyoG）的表达则标志着细胞分化8,9,10,11,12,13,14尽管已有这些认知以及发现可用于纯化肌肉干细胞（MuSCs）的细胞表面标志物，但仍缺乏有效的策略和工具来鉴定和分离肌源性分化途径中各个明确的细胞群体，并解析肌源性发育的连续过程 体内 一直缺乏15,16,17,18.
在此，我们介绍一种基于近期已发表研究的创新方法，该方法能够识别骨骼肌中的干细胞和前体细胞，并分析其在急性肌肉损伤背景下的细胞、分子及增殖动态。19. 该方法依赖于单细胞质谱流式技术（又称飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]），可同时检测关键的细胞表面标志物（α7&#160;整合素、CD9、CD44、CD98 和 CD104）、细胞内成肌转录因子（Pax7、Myf5、MyoD 和 MyoG）以及核苷类似物（5-碘-2′-脱氧尿苷，IdU），用于监测处于 S 期的细胞19,20,21,22,23此外，该方案提出了一种基于检测两种细胞表面标志物CD9和CD104的策略，通过荧光激活细胞分选（FACS）来纯化这些细胞群体，从而为今后深入研究其在损伤及肌肉疾病背景下的功能提供了可能。尽管原代成肌细胞在过去已被广泛用于研究成肌分化后期阶段 体外目前尚不清楚它们是否重现了体内肌肉前体细胞的分子状态 体内24,25,26,27,28,29,30成肌细胞的制备过程繁琐且耗时，且该原代培养物的分子状态在传代过程中迅速改变。31因此，通过该方法分离纯化的原代肌源性前体细胞将为研究肌生成过程以及遗传或药物干预的影响提供一个更接近生理状态的实验体系 离体.
本方案可用于解决多种研究问题，例如研究肌源性区室的动力学变化 体内 在肌肉疾病的动物模型中，针对急性基因操作或药物干预的反应，从而加深我们对不同生物学背景下肌肉干细胞功能障碍的理解，并促进新型治疗干预措施的开发。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td>KDM</td><td>KD-fine 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 G，0.5 mL 胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G，0.3 mL 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>泰尔茂医疗</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>5 mL聚丙烯管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯试管，含 35 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>泰尔茂医疗</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-碘-2-脱氧尿苷（IdU）</td><td>默克</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>抗CD104 FITC（克隆号：346-11A）</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>储备液 = 0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD11b APC-Cy7（克隆：M1/70）</td><td>Biolegend</td><td>101226</td><td>储备液 = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD31 APC-Cy7（克隆号：390）</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>储备液 = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD45 APC-Cy7（克隆：30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>储备液 = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗CD9 APC（克隆：KMC8）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-0091-82</td><td>储备液 = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗Sca1（Ly6A/E）APC-Cy7（克隆：D7）</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>储备液 = 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;7整合素 PE（克隆：R2F2）</td><td>不列颠哥伦比亚大学抗体实验室</td><td>67-0010-05</td><td>储备液 = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III（4 激光）仪器</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td>405、488、561 和 633 nm 激光器</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/mL</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104（克隆号：346-11A）</td><td>BD 生物科学</td><td>553745</td><td>Dy162；实验室自制偶联物</td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1（克隆：429 MVCAM.A）</td><td>Biolegend</td><td>105701</td><td>Er170；实验室自制偶联物</td></tr><tr><td>CD11b（克隆：M1/70）</td><td>BD 生物科学</td><td>553308</td><td>Nd148；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD29/整合素 &amp;beta;1（克隆：9EG7）</td><td>BD 生物科学</td><td>553715</td><td>Tm169；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD31（克隆：MEC 13.3）</td><td>BD 生物科学</td><td>557355</td><td>Sm154；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD34（克隆：RAM34）</td><td>BD 生物科学</td><td>551387</td><td>Lu175；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD44（克隆：IM7）</td><td>BD 生物科学</td><td>550538</td><td>Yb171；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD45（克隆：MEC 30-F11）</td><td>BD 生物科学</td><td>550539</td><td>Sm147；实验室自制偶联物</td></tr><tr><td>CD9（克隆：KMC8）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2（克隆：30-H12）</td><td>BD 生物科学</td><td>553009</td><td>Nd144；实验室自制偶联物</td></tr><tr><td>CD98（克隆：H202-141）</td><td>BD 生物科学</td><td>557479</td><td>Pr141；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>细胞获取溶液/Maxpar CAS缓冲液</td><td>标准生物工具</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID 插入剂-铱</td><td>标准生物工具</td><td>201192B</td><td>阳离子核酸嵌入剂</td></tr><tr><td>顺铂</td><td>默克</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>顺铂（cis-二氨合铂(II)二氯化物）</td><td>默克</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 透明离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>计数室</td><td>默克</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1（克隆：2B11/CXCR4）</td><td>BD 生物科学</td><td>551852</td><td>Gd158；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>DAPI（1 mg/mL）</td><td>BD 生物科学</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>暗色1.5 mL离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（低糖，含丙酮酸钠）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）</td><td>默克</td><td>E5134</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>EQ四元素校准微球（EQ微球）</td><td>标准生物工具</td><td>201078</td><td>校准微球</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，巴西来源</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Helios CyTOF 系统</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>马血清，热灭活，新西兰来源</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>默克</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>铱-嵌入剂</td><td>标准生物工具</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>异氟烷/Attane Vet</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5（克隆：C-20）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>MyoD（克隆号：5.8A）</td><td>BD 生物科学</td><td>554130</td><td>Dy164；实验室自制偶联物</td></tr><tr><td>MyoG（克隆：F5D）</td><td>BD 生物科学</td><td>556358</td><td>Gd160；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>Nalgene 快速流速无菌一次性瓶顶滤器 0.20 &amp;mu;M PES 滤膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>重悬至 50 &amp;micro;微克/毫升，溶于无菌 PBS。保存储备液（如 50） &amp;micro;l) 在 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>营养混合物 F-10（Ham's）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt（克隆：D9E）</td><td>标准生物工具</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7（克隆：PAX7）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153；实验室内部偶联</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（Pen/Strep）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PES 滤器单元 0.20 &amp;mu;M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>PES注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16% 电镜级</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;无水（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb（克隆：J112-906）</td><td>标准生物工具</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6激酶（克隆：N7-548）</td><td>标准生物工具</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1（克隆：E13-161.7）</td><td>BD 生物科学</td><td>553333</td><td>Nd142；内部偶联</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 无菌生理盐水溶液</td><td>Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;7整合素（克隆号：3C12）</td><td>MBL国际</td><td>K0046-3</td><td>Ho165；实验室自制偶联物</td></tr></tbody></table>

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其子代细胞驱动的动态过程。在稳态下，成体肌肉干细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活。激活后，这些细胞开始增殖，其大部分子代细胞分化为具有融合能力的肌细胞，而其余部分则通过自我更新以补充干细胞库。尽管肌肉干细胞的身份早在十余年前即已通过细胞表面标志物的共表达得以确定，但肌源性前体细胞直到最近才借助高维单细胞技术被鉴定出来。本文介绍一种单细胞质谱流式技术（飞行时间质谱流式，CyTOF），用于分析急性肌肉损伤中的干细胞与前体细胞，以解析肌肉再生过程中发生的细胞与分子动态变化。该方法基于同时检测新型细胞表面标志物和关键的肌源性转录因子，这些因子的动态表达有助于识别处于激活状态的干细胞及前体细胞群体，从而揭示肌生成过程中的关键节点。尤为重要的是，本文描述了一种基于检测细胞表面标志物CD9和CD104的分选策略，可利用荧光激活细胞分选（FACS）对肌肉干细胞和前体细胞进行前瞻性分离，以便深入研究其功能。肌肉前体细胞为研究肌肉干细胞命运调控、发现肌肉疾病的新治疗靶点以及开发再生医学中的细胞治疗应用提供了关键的缺失环节。本文所提出的方法可用于研究肌肉干细胞与前体细胞 体内 在应对特定信号通路的药理学干预等扰动时，该方法可用于研究肌肉疾病动物模型中肌肉干细胞与前体细胞的动态变化，从而加深对干细胞相关疾病的理解，并加速治疗策略的开发。

本文介绍了采用该联合方法的实验设计概览，包括：（i）通过注射notexin构建急性损伤时间序列，利用高维CyTOF技术分析骨骼肌中干细胞与前体细胞的细胞及分子动态变化（图1，上图方案）；以及（ii）利用两种细胞表面标志物CD9和CD104对干细胞与前体细胞进行FACS分选，以分离这些细胞群体并深入研究其功能（图1，下图方案）。本研究所述实验均使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠。
用于急性损伤过程中识别骨骼肌干细胞与祖细胞及其细胞与分子动态研究的CyTOF分析 
我们重新分析了已公开发布的、通过注射notexin诱导急性损伤时间过程的CyTOF数据集，其中骨骼肌样本使用一组包含21种金属偶联的、适用于CyTOF的抗体进行染色19 (图2 和 图3</str...

本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。

骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其子代细胞驱动的动态过程。在稳态下，成体肌肉……

我们的研究探讨了衰老和疾病中干细胞功能障碍的分子机制。我们的目标是理解肌肉干细胞和前体细胞如何与肌肉微环境中的其他细胞相互作用，以实现有效的再生。我们还在研究在衰老和疾病过程中，细胞间的相互通讯是否会影响肌肉干细胞的功能。研究干细胞微环境中细胞间通讯的主要障碍之一是缺乏能够提供单细胞分辨率的技术。单细胞质谱流式技术可对复杂组织中的多种细胞类型和分子表型进行高通量、多参数的同步定量分析。本实验方案通过针对细胞表面标志物和成肌转录因子的抗体，实现对肌肉再生过程中稀有干细胞及其子代细胞的分离与深度分析。研究这些细胞有助于我们理解肌肉干细胞命运的调控机制，并揭示在有效再生过程中驱动细胞状态转变的分子网络。在单细胞水平上同时检测多达50种细胞表面和细胞内蛋白，是研究肌肉组织中细胞功能的一种重要方法。该技术能够识别独特的分子特征，并揭示衰老和疾病状态下肌肉干细胞功能障碍的新机制。本方案可用于研究细胞状态转变如何影响健康与疾病中的组织再生。我们在此展示的活化干细胞特征，使得此前无法开展的干细胞静息状态研究成为可能。现在，我们仅凭细胞表面标志物即可纯化活化干细胞（CD98高表达、CD44高表达），并首次研究其如何重返静息状态。首先，将稀释于无菌0.9%生理盐水中的布托啡诺溶液和稀释于磷酸盐缓冲液（PBS）中的蛇毒神经毒素溶液置于冰上。在鼻罩装置下，使用剃毛器剃除麻醉小鼠后肢的毛发，然后将小鼠放回诱导箱中。用胰岛素注射器分别准备15微升（µL）用于腓肠肌（GA）注射和10微升（µL）用于胫骨前肌（TA）注射的蛇毒神经毒素溶液。将小鼠移至鼻锥装置后，用乙醇棉片消毒注射部位。将针头斜面向下，以30度角插入胫前肌（TA肌）肌腹。推进针头使其与胫骨平行，到达TA肌中部肌腹，缓慢注射蛇毒神经毒素（notexin）溶液，持续10秒。将针头以45度角插入腓肠肌外侧头中段肌腹处，注射蛇毒肌毒素（notexin）溶液。将小鼠翻转，使用胰岛素注射器皮下注射布托啡诺。根据以下公式计算每只小鼠所需的碘脱氧尿苷溶液体积。使用胰岛素注射器，在安乐死前 8 至 12 小时，于已消毒的注射部位进行碘脱氧尿苷溶液的腹腔注射。小鼠安乐死后，从后肢分离胫前肌（TA）和腓肠肌（GA），并将其置于培养皿盖中。用剪刀将组织剪碎成匀浆状。将切碎的组织转移至含有5毫升冰上预冷的解离缓冲液的50毫升离心管中，并置于冰上保存。待样本管在37摄氏度加热后，于培养箱中旋转孵育45分钟，向样本管中加入10毫升洗涤培养基并涡旋混匀。离心样本管，弃去上清液，保留约4毫升沉淀。接下来，向细胞中各加入 0.5 毫升的胶原酶和分散酶。然后涡旋混匀并进行孵育。孵育结束后，离心消化后的样品，并用 5 毫升移液管重悬沉淀物。接下来，用5毫升洗涤液预润湿置于50毫升离心管上的40微米细胞滤筛。使用带20号针头的5毫升注射器，将细胞悬液反复吹打10次。然后，将细胞悬液通过预润湿的40微米细胞滤筛进行过滤。用10毫升洗涤液收集并过滤剩余细胞后，通过离心沉淀细胞悬液，吸除试管中的上清液，并轻轻弹击沉淀物以使其松散。首先，将从经碘脱氧尿苷标记的notexin损伤小鼠中分离的骨骼肌细胞重悬于1毫升冷的无血清DMEM中，并使用血细胞计数板或细胞计数仪进行计数。在通风橱内，加入顺铂储备液，使其终浓度达到25 µM。将离心管涡旋振荡10秒，并在室温下孵育1分钟。用含10% FBS的冰冻DMEM终止反应，并将样品置于冰上。离心并重悬细胞后，通过35微米细胞滤网过滤细胞悬液。在通风橱下，加入过滤后的多聚甲醛储备液以固定细胞悬液，并涡旋振荡30秒。用2毫升细胞染色液（CSM）通过离心洗涤两次。最后一次洗涤后，吸除上清液至约60微升，充分重悬细胞沉淀。加入40微升在CSM中配制的2.5倍表面抗体染色混合液，涡旋混匀，每20分钟涡旋一次，孵育1小时。用CSM洗涤样本两次后，吸去上清液并轻弹管底沉淀。为透化细胞，在通风橱内将0.5毫升预冷甲醇逐滴加入，同时涡旋混匀。用一毫升 CSM 通过离心洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，吸除上清液至约 60 微升，充分重悬沉淀。将细胞与 40 微升胞内抗体染色混合液一起孵育一小时，每 20 分钟涡旋震荡样品一次。用一毫升 CSM 洗涤细胞两次后，将样品重悬于 0.5 毫升的嵌入剂铱溶液中并涡旋振荡。首先，取经顺铂金属偶联抗体和嵌入剂铱溶液染色的骨骼肌细胞，通过离心使细胞成团。去除上清液后，向涡旋振荡后的细胞中加入一毫升 CSM。通过离心沉淀细胞，并用一毫升 CAS 缓冲液洗涤。离心后，吸除上清液至大约 200 微升。向涡旋混匀的样品中加入一毫升 CAS 缓冲液，并分装五微升用于细胞计数。离心细胞后，吸除上清液至剩余50微升，用CAS缓冲液重悬细胞，使终浓度为每毫升100万个细胞，并加入校准微球，使其终浓度为0.1倍。将样品加载至质谱流式细胞仪，以每秒400至500个细胞的流速采集数据，采集完成后对数据进行归一化处理。如有需要，可将每个样品的独立流式细胞术标准文件（FCS文件）合并为单个文件。通过门控选择铱嵌入剂阳性事件来鉴定单细胞。选择对顺铂呈阴性的事件以圈定活细胞。对目标细胞群进行门控，并定量分析干细胞与前体细胞的相对比例。为了进行高维分析，导出目标细胞群并使用聚类算法。对于X偏移分析，请下载Vortex软件包和64位Java。将导出的细胞群上传至本地数据库，并定义聚类参数。为了可视化X shift聚类中细胞群体之间的空间关系，执行一种受力导向布局。质谱流式细胞术（CyTOF）分析鉴定出四个细胞群体的序列，包括干细胞以及第一至第三类前体细胞群体。前体细胞群体P1和P2对应于成熟度逐渐增加的前体细胞。P3 之前因丰度较低而被识别但未被表征。通过 C104 双轴点图分析 CD9，研究损伤后干细胞与祖细胞的动态变化。在第3天观察到干细胞群体显著增加，提示其发生扩增。碘脱氧尿苷掺入增加支持了这一结果，表明细胞增殖增强，并且MyoD表达升高，如颜色叠加图所示。在损伤后第3天，通过高表达CD98、CD44、MyoD和碘脱氧尿苷标记的活化干细胞被鉴定出来，凸显其处于高度增殖和活化状态。

identification-analysis-myogenic-progenitors-vivo-during-acute

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过高维单细胞质谱流式细胞术鉴定和分析急性骨骼肌损伤过程中体内肌源性祖细胞

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本文描述了一种在成年小鼠中诱导急性骨骼肌再生的详细方案，以及对肌肉进行后续操作的方法，例如解剖、冷冻、切片、常规染色和肌纤维横截面积分析。...

通过注射心脏毒素诱导急性骨骼肌再生

活跃的自噬作用与有效的肌肉再生密切相关，而肌肉再生对于肌肉干细胞（MuSC）的活化至关重要。本文提供了一种 原位 检测对照组和损伤小鼠肌肉组织切片中 MyoD 阳性肌卫星细胞（MuSCs）内自噬标志物...

原位 肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。...

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。...

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

我们介绍了一种体内方法，通过结合心脏毒素介导的骨骼肌损伤和自递送siRNA注射，研究卫星细胞中特定基因功能的丧失。...

通过心脏毒素损伤及体内自递送siRNA注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。...

大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征

本方案描述了一种体外培养和功能分析肌肉干细胞的方法，该方法可保留肌肉干细胞与其内源性微环境之间的大部分相互作用。...

单根肌纤维培养实验用于体外评估成年肌肉干细胞功能

准确鉴定纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌肉干细胞（MuSCs）对于研究其在生理和病理条件下的生物学功能至关重要。本方案提供了从成年小鼠肌肉中分离、纯化和培养FAPs与MuSCs的操作指南。...

FACS分离与培养未受干扰及损伤后小鼠骨骼肌中的纤维脂肪生成祖细胞和肌肉干细胞

学习使用高维单细胞质谱流式细胞术和FACS技术，在小鼠模型中分析急性骨骼肌损伤后的肌源性祖细胞动态变化。该方法可揭示肌肉干细胞命运调控机制，为衰老相关肌肉退化的治疗策略提供新靶点。

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

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