Name: 用于药物开发应用的全人肝培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解TruVivo全人肝细胞培养平台在药物代谢与毒性评估中的应用。该系统采用传统二维培养技术，可长期维持肝细胞形态功能，为临床前药物开发提供准确的代谢清除预测和药代动力学分析。

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我们感谢 Mellissa Keller 和 Wendy Hetman 在手稿和图表审阅过程中提供的帮助。

本方案遵循 Lifenet Health 伦理委员会的指导原则。该文稿不包含任何由作者开展的人类受试者或动物实验。所有细胞均来自 Lifenet Health 已获得完全研究用途知情同意的供体组织。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>解冻各一瓶饲养层细胞解冻培养基、添加剂A、添加剂B和添加剂C（参见 材料表) 在一个 37 °C 水浴或16-24小时于 4 °C.</li>
	<li>将整瓶（10 mL）饲养细胞解冻培养基分装至一个15 mL或50 mL的锥形离心管中。 
	注意：使用15 mL锥形管更便于观察细胞沉淀的大小。</li>
	<li>向一瓶包被培养基（75 mL）中加入4.5 mL补充剂B和11 mL补充剂A（参见 材料表以制备完全培养基。 
	注意：完全培养基中 FBS 的浓度 &lt;5% v/v</li>
	<li>向另一个瓶子中加入 100 mL 培养基（参见 材料表），1 mL 补加剂 C 和 14 mL 补加剂 A，配制成完全培养基。 
	注意：完全培养基中含有一定浓度的 FBS &lt;1% v/v</li>
	<li>将剩余的补充剂C和补充剂A置于-20 °C 直至第2周培养基制备。 
	注意：反复冻融会缩短添加剂的保质期，建议仅冻融一次。</li>
	<li>使用前，将10 mL饲养细胞解冻培养基、肝细胞解冻培养基、完全铺板培养基和完全培养基在37 °C孵育20–30分钟 37 °C 水浴锅</li>
</ol>
2. 解冻、计数和接种人源饲养层细胞（图 1A）
<ol>
	<li>在接种原代人肝细胞（PHH）前约 1 小时，开始培养饲养层细胞。将饲养层细胞（见材料表）在 37 °C 水浴中解冻 1–2 分钟。 
	注意：通过观察解冻过程并当冻存管倒置时液体开始松动时立即取出，避免长时间暴露（例如 >2 分钟）。</li>
	<li>解冻后立即置于冰上。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）内采用无菌操作技术，将新鲜解冻的细胞加入 10 mL 饲养层细胞解冻培养基中。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器，用 1 mL 细胞/解冻培养基悬浮液冲洗冻存管一次，并收集。</li>
	<li>在室温（RT）下以 400 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免通过移液或真空抽吸扰动细胞沉淀。将细胞沉淀用 1 mL 完全铺板培养基重悬，并对饲养层细胞进行计数。 
	注意：可使用自动细胞计数仪结合吖啶橙和碘化丙啶（AOPI）对饲养层细胞进行计数，或使用血细胞计数板结合台盼蓝染色计数。细胞计数结果可能因技术与操作者而异。为获得最佳结果，建议对样本进行重复计数，并保持所选方法的一致性。</li>
	<li>用完全铺板培养基将细胞悬液稀释至 100,000 个细胞/mL。</li>
	<li>将稀释后的细胞悬液每孔 500 µL（含 50,000 个细胞）接种至胶原包被的 24 孔板中（见材料表）。</li>
	<li>采用“北（N）-南（S）-东（E）-西（W）”方向摇晃法：先在 N-S 方向来回晃动 2 次，再在 E-W 方向以相同方式晃动；重复该摇晃程序共 3 轮。 
	注意：摇晃时应施加适中力度，避免液体溅至板盖，同时有助于细胞均匀分布（请参见视频）。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 60 分钟。</li>
	<li>在继续解冻肝细胞前，观察饲养层细胞的贴壁情况。 
	​注意：可接受的饲养层细胞贴壁状态为肉眼观察贴壁密度约为 50% 汇合度。</li>
</ol>
3. 解冻、计数及接种原代人肝细胞（图1B）
<ol>
	<li> feeder 细胞培养 30 分钟后，将预热的肝细胞解冻培养基通过 0.2 µm 聚醚砜（PES）滤器过滤。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中解冻原代人肝细胞（PHHs）1-2 分钟。 
	注意：通过观察解冻过程并监测，当倒置冻存管时液体开始松动即应立即取出，避免长时间暴露（例如 >2 分钟）。</li>
	<li>解冻后立即将 PHHs 置于冰上。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中，将 PHH 悬液倒入肝细胞解冻培养基中。 
	注意：应尽可能避免使用移液操作 PHH 细胞悬液。在将解冻后的 PHHs 从冻存管转移至解冻培养基的过程中，严禁进行移液操作。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器，通过轻柔地将 1 mL 肝细胞/解冻培养基悬液反复吹打 3-4 次清洗冻存管，并将洗涤液倒回解冻培养基中收集。</li>
	<li>盖紧管盖，轻轻翻转解冻后的 PHH 悬液 5 次。</li>
	<li>在室温下以 100 × g 离心 8 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，可使用移液或真空抽吸方式。沿锥形离心管管壁加入 3 mL 完全铺板培养基。</li>
	<li>左右轻摇锥形离心管，使细胞沉淀重悬。</li>
	<li>向重悬的肝细胞中再加入 5 mL 完全铺板培养基。</li>
	<li>计数 PHHs。 
	注意：可使用 AOPI 在自动细胞计数仪上或使用台盼蓝在血细胞计数板上进行 PHHs 计数。计数结果可能因技术与操作者而异。为获得最佳结果，建议对样本进行重复计数，并保持所选方法的一致性。</li>
	<li>使用完全铺板培养基将细胞悬液稀释至所需接种密度（300,000–600,000 PHHs/mL）。 
	注意：最佳肝细胞接种密度可能因批次而异。每一批次推荐的接种密度将在分析证书（COA）中提供。使用以下公式计算 24 孔板每毫升所需的肝细胞数量。 
	<img alt="平衡公式：Hepatocytes/mL = Hepatocytes/Well × 2；数学公式。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>从已铺好的 feeder 细胞中，通过移液或真空抽吸方式移除培养基。 
	注意：为确保 feeder 细胞的存活率，建议每次更换培养基的孔数不超过 3 个。</li>
	<li>立即向含有 feeder 细胞的预包被胶原蛋白 24 孔板中每孔加入 500 µL 稀释后的肝细胞悬液（150,000–300,000 个细胞）。</li>
	<li>以南北-东西方向轻轻摇动培养板：先在南北方向前后移动 2 次，再在东西方向重复相同动作 2 次，重复此摇动程序共 3 轮。 
	注意：摇动时应施加适中力度，避免液体溅至板盖，同时有助于细胞均匀分布。</li>
	<li>在 37 °C / 5% CO2 条件下培养 2–4 小时。在培养的前 60 分钟内，每 15 分钟按步骤 3.15 所述方式以 N-S-E-W 动作摇动培养板一次。</li>
	<li>培养结束后，将培养板从培养箱中取出并置于生物安全柜中。</li>
	<li>轻轻摇动培养板，然后通过移液或真空抽吸方式移除完全铺板培养基。 
	​注意：为确保培养体系的稳定性，建议每次更换培养基的孔数不超过 3 个。</li>
	<li>立即向每孔加入 500 µL 预热的完全培养基。</li>
</ol>
4. 维护
<ol>
	<li>分装完全培养基，并在37 °C水浴中预热20-30分钟。每块24孔板约需13.5 mL培养基。</li>
	<li>每天以每孔500 µL新鲜预热的完全培养基更换培养液。 
	注意：为确保培养物的存活率，建议每次更换不超过3个孔。</li>
	<li>每7天配制一次新鲜的完全培养基。</li>
</ol>
5. 收集培养上清液样本以测定白蛋白和尿素
<ol>
	<li>在第7、10和14天，从目标样本孔中收集500 µL培养基至微量离心管中，如图1C所示。</li>
	<li>在4 °C条件下，以320 × g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。</li>
	<li>使用移液器将上清液转移至新的微量离心管中，避免扰动沉淀物。</li>
	<li>进行白蛋白和/或尿素检测（分别参见第10和11节）。 
	​注意：样本可在-20 °C至-80 °C保存2周。</li>
</ol>
第6天 染色第一天
警告：固定缓冲液含有多聚甲醛。多聚甲醛可导致眼部损伤、皮肤刺激以及器官毒性。应在通风良好的区域操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
<ol>
	<li>在第14天收集培养基样本后，加入 300 µL 固定缓冲液（参见 材料表) 加入每个待染色的孔中，如图所示 图1C至少染色2个孔。</li>
	<li>孵育于 4 °C 20–60 分钟。</li>
	<li>配制 1x 穿膜缓冲液（参见 材料清单) 通过将5 mL 10x储存液加入45 mL 1x PBS中制备（参见 材料清单). 
	注意：1x 透化缓冲液可保存于 4° C 1个月。</li>
	<li>洗涤 2 次 300 µL 置于冰上，加入1×破膜缓冲液。</li>
	<li>添加 300 µL 细胞角蛋白18一抗（参见 材料表使用1:1000稀释比例，在1×透化缓冲液中冰上孵育。 
	注意：至少将一个孔仅用1×通透缓冲液孵育，作为仅二抗对照。</li>
	<li>孵育 16–24 小时于 4 °C.</li>
</ol>
7. 染色第二天
<ol>
	<li>次日，通过移液或真空抽吸去除一抗。</li>
	<li>用预冷的 1× 透化缓冲液，每孔 300 µL，冰上洗涤 2 次。</li>
	<li>加入 300 µL 荧光标记的二抗（见材料表），使用 1× 透化缓冲液按 1:500 稀释（需设置仅加二抗的对照）。 
	注意：使用荧光抗体时应避免光照。</li>
	<li>4 °C 避光孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>通过移液或真空抽吸去除二抗。</li>
	<li>用预冷的 1× 透化缓冲液，每孔 300 µL，冰上洗涤 2 次。</li>
	<li>用 1× PBS 缓冲液，每孔 300 µL，洗涤 1 次。</li>
	<li>每孔加入 150 µL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片剂（见材料表），室温避光孵育 15 分钟。 
	注意：板可包裹 Parafilm 膜，于 4 °C 避光保存 1 周。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察。使用 10× 物镜，对每个孔的每个特定荧光通道采集 5 张图像（确保其中一张图像包含比例尺）。 
	注意：DAPI 的激发/发射波长为 358 nm/461 nm。应使用配备适用于 DAPI 及二抗荧光染料检测滤光片的荧光显微镜。</li>
</ol>
8. ImageJ 分析（图2）
注意：建议使用 ImageJ 1.52a 或更高版本。
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开一张包含比例尺的图像。点击 直线（Straight Line） 图标，并绘制一条与比例尺长度完全一致的线 [图 2 (1)] 
	注意：如有需要，可点击 放大镜（Magnify Glass） 图标进行放大或缩小。</li>
	<li>点击 分析（Analyze） 选项卡，选中并点击 设置比例尺（Set Scale）。</li>
	<li>将 已知距离（Known Distance） 更改为比例尺的实际距离，将 长度单位（Units of Length） 更改为比例尺所用的单位。通过勾选 全局（Global） 选项将设置应用于所有图像。点击 确定（OK） 以设定比例尺。 
	注意：一旦应用此设置，此后打开的每张图像都将显示视场面积的计算结果，单位为用户输入的单位。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开一张仅含 DAPI 的图像。点击 处理（Process） 选项卡，选中 减去背景（Subtract Background）。每次移除 50 像素的背景，直至未染色区域变为黑色。 
	注意：如果图像中无背景信号，则无需执行此步骤。</li>
	<li>点击 图像（Image） 选项卡并选中 类型（Type），然后点击 8 位（8-bit），将图像转换为灰度图像 [图 2 (2)]。</li>
	<li>手动或自动对图像进行阈值分割，以包含所有 DAPI 颗粒（注意避免手动过度阈值化）[图 2 (3)]。点击 图像（Image） 选项卡并选中 调整（Adjust），点击 阈值（Threshold），完成后点击 应用（Apply）。</li>
	<li>点击 处理（Process） 选项卡并选中 二值化（Binary），然后点击 分水岭（Watershed）。</li>
	<li>点击 分析（Analyze） 选项卡并选中/点击 分析颗粒（Analyze Particles） [图 2 (4)]。将 大小（Size） 设置为 5-无穷大（5-Infinity），将 圆度（Circularity） 设置为 0.00-1.00。在 显示（Show） 下拉菜单中选择 轮廓（Outlines）。确保勾选 显示结果（Display Results）、汇总（Summarize） 和 包含孔洞（Include Holes）。点击 确定（OK）。 
	注意：若阈值分割导致背景像素被包含，可调整所需的颗粒大小范围。</li>
	<li>将计数结果记录为 总 DAPI 颗粒数（TOTAL DAPI）。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开一张合并的细胞角蛋白 18/DAPI 图像。</li>
	<li>使用 多点（Multi-Point） [图 2 (5)] 图标，手动计数所有未被细胞角蛋白 18 染色的 DAPI 颗粒。</li>
	<li>将结果记录为 饲养层细胞（FEEDER CELLS）。使用以下公式计算肝细胞 DAPI 颗粒数。 
	肝细胞 DAPI = 总 DAPI - 饲养层细胞 DAPI</li>
</ol>
9. 总贴壁肝细胞数量及贴壁率（贴壁能力）的定量
<ol>
	<li>使用下方公式计算24孔培养板的面积换算系数。视野尺寸可在每张打开图像的顶部找到 [图2 (2)，绿色框]。 
	<img alt="换算系数公式，\( \text{换算系数} = \frac{1.9 \, \text{cm}^2}{\text{视野长度 (cm)} \times \text{宽度 (cm)}} \)，计算公式。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式3"></li>
	<li>使用下方公式计算总的贴壁肝细胞数量。 
	贴壁肝细胞数 = 换算系数 × 肝细胞DAPI计数</li>
	<li>使用下方公式计算肝细胞的贴壁率。 
	<img alt="肝细胞贴壁率公式，计算贴壁百分比，用于细胞生物学分析的公式。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式5"></li>
</ol>
10. 白蛋白测定
<ol>
	<li>使用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）（参见材料表）检测经1:200稀释的样品中的白蛋白生成量。 
	注：为确保准确性，用户需确认样品数值位于标准曲线的线性范围内。指定试剂盒提供进行该检测所需的所有材料和说明。</li>
	<li>利用下方公式将样品浓度归一化至贴壁的肝细胞数量。 
	<img alt="白蛋白生成速率计算公式；显示浓度与肝细胞关系的方程。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6"></li>
</ol>
11. 尿素测定
警告：血尿素氮（BUN）酸性试剂含有硫酸。该试剂中的硫酸浓度具有腐蚀性。切勿吞食。操作时应在通风良好的区域进行，并穿戴适当的个人防护装备。
<ol>
	<li>采用改良的二乙酰一肟法测定尿素合成（见材料表）。</li>
	<li>将53.3 µL的75 mg/dL尿素加入346.7 µL完全培养基中，配制标准品#1（100 µg/mL）。</li>
	<li>标记2-8号试管，使用1:2倍比稀释法配制尿素检测试剂标准品（表1）。</li>
	<li>向黑色壁、透明底的96孔板的孔中各加入10 µL样品或标准品（见材料表）。</li>
	<li>向每个含有样品的孔中加入150 µL BUN试剂。BUN试剂的配制方法：将1/3体积的BUN显色试剂与2/3体积的BUN酸试剂混合。使用下方公式辅助计算。 
	<img alt="化学中的静态平衡：公式，总BUN试剂计算，教育用途。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式7"> 
	BUN显色试剂 (mL) = 所需总BUN试剂体积 × 0.333 
	BUN酸试剂 (mL) = 所需总BUN试剂体积 × 0.667</li>
	<li>将板在60 °C的烘箱或培养箱中孵育90分钟。</li>
	<li>立即在540 nm和650 nm波长下读取吸光度。</li>
	<li>通过从所有样品和标准品中减去空白和背景吸光度（650 nm）绘制标准曲线，并通过线性回归分析生成最佳拟合直线。</li>
	<li>根据标准曲线确定未知样品的浓度。</li>
	<li>使用下方公式将样品浓度归一化至贴壁肝细胞。 
	<img alt="尿素生成量计算公式；尿素/天/10^6个PHHs，样品浓度，肝细胞示意图。" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq10.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式10"></li>
</ol>

A Physiologically-Relevant All-Human 2D+ Hepatic System for Drug Discovery

<ol><li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich-cultured+hepatocytes%3A+an+in+vitro+model+to+evaluate+hepatobiliary+transporter-based+drug+interactions+and+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity.</a> Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).</li>
<li>Baudy, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microphysiological+systems+development+guidelines+for+safety+risk+assessment+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).</li>
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</ol>

JO、LW、EG、EL、SP 和 JW 是 LifeNet Health 的员工，该非营利组织负责生产 TV2D+。

所述的肝细胞培养系统可在配备标准组织培养设备的实验室中建立。该系统由与饲养细胞共同培养的原代人肝细胞（PHH）组成，可支持PHH培养至少两周，并维持稳定的白蛋白生成和尿素合成。由于不同供体来源的PHH批次之间存在差异，建议仅使用经过预先筛选和验证合格的PHH用于该系统。尽管贴壁的PHH数量因供体批次和接种密度而异，但在同一供体批次内，相对贴壁率保持相似。虽然推荐了特定的接种密度，但上述数据表明可根据不同的实验需求调整肝细胞接种密度；然而需要注意的是，接种更多的PHH并不一定能够获得更高或更稳定的细胞功能输出。对所评估的PHH批次进行分析显示，在较低接种密度（每孔150,000个PHH和每孔200,000个PHH）下，白蛋白生成和尿素合成的变异系数（CV）最低；但在任何接种密度下，白蛋白和尿素水平之间均未发现显著差异。在每孔250,000个PHH和每孔300,000个PHH的较高接种密度下，14天培养期间白蛋白和尿素水平下降更为明显。测试的PHH供体批次在贴壁能力上的固有差异可能会影响在每孔250,000个和每孔300,000个PHH接种密度下白蛋白生成和尿素合成的一致性。类似于大型肝细胞球体，在TV2D+系统中过度接种PHH可能对PHH的长期培养及其功能产生不利影响。
解冻、接种和维持培养的每一步骤对于成功培养和数据生成都至关重要；然而，一些经验不足的操作者可以避免若干常见错误。原代人肝细胞（PHHs）极易因温度波动、剪切应力以及暴露于空气而受到损伤9,10。在解冻PHHs时应采取预防措施，避免解冻时间过长和过度使用移液器。采用手动倾倒法、计时器以及从水浴后立即转移至冰上，可减少这些可能影响PHHs存活率和接种效率的常见错误。此外，由于供应链问题日益普遍，获取胶原蛋白包被的培养板可能较为困难。此时可使用商品化的I型胶原溶液（5–10 µg/cm2）对组织培养处理过的培养板进行手动包被以解决该问题；但为了获得最佳性能和实验一致性，仍建议使用预包被的胶原板。在从仅 feeder 细胞培养过渡到引入PHHs的过程中，必须防止feeder细胞层干燥。切勿使feeder细胞暴露于空气中。任何时间的空气暴露均可能导致feeder细胞层质量下降，从而对PHHs的长期培养产生负面影响。最佳操作是在更换培养基时保留少量残留培养基。偶尔，PHHs样本中可能含有较多分离过程中产生的碎片，这会增加观察细胞形态的难度。为缓解此问题，可在更换培养基前轻轻振荡培养板，并使用真空抽吸法。最后，在更换培养基时，应小心抽吸废弃培养基，注意不要扰动培养的细胞。添加新鲜培养基时，应沿孔壁缓慢加入，避免直接将液体滴加到细胞层上。每次更换培养基时也应避免细胞暴露于空气中，建议采用推荐的三孔轮换更换法（见第3和第4节）。需要注意的是，每日更换培养基为理想操作，但并非必需。
尽管荧光显微镜已在大多数实验室中普及，但执行特定图像分析所需的软件可能会带来额外费用。ImageJ 可免费下载，因此是一种易于获取的图像分析工具。本方案中的步骤为用户提供了基础操作流程，用户可能需要根据具体情况优化，特别是针对 DAPI 染色的颗粒分析；然而，若缺乏荧光成像能力，可在批号特定的分析证书上获取第14天原代人肝细胞（PHH）的贴壁率数据。阈值设置不当将导致 DAPI 颗粒计数不准确。建议在设定大小排除范围前，先检查单个 DAPI 颗粒的表面积。可通过使用椭圆图标[图2（1），位于编辑选项卡下方的圆形图标]，绘制一个包含 DAPI 颗粒的圆形区域来实现。随后可使用分析选项卡测量所选 DAPI 颗粒的面积。具体测量参数可通过分析选项卡下的设置测量值进行选择[步骤8.9及图2（4）]。
目前培养原代人肝细胞（PHHs）的方法涉及使用胶原蛋白-I等包被物，以增强传统二维单层培养中的细胞贴壁能力11 或使用细胞外基质（如小鼠来源的Matrigel）进行包被，该技术通常称为 &#34;三明治培养法&#34;12,13,14,15与传统的单层培养相比，夹心培养法虽能随时间推移改善原代人肝细胞（PHH）的形态和极性，但对于大多数可铺板的PHH批次而言，这两种方法在体外培养中仍缺乏长期的表型稳定性。另一种用于培养PHH的方法是构建三维肝细胞球（3D spheroids）；然而，正如Glicklis等人先前所述4，由于供体差异，类球体大小的可重复性可能存在技术挑战。为了构建更具生理相关性的肝脏模型，已开发出多细胞模型。Ware 等人对此进行了描述。7，利用微图形化技术，由原代人肝窦内皮细胞和小鼠成纤维细胞包围的原代人肝细胞可维持更长时间的功能 体外 培养时间。然而，微图形化技术可能是一个复杂且耗时的过程，而非人类饲养细胞可能会对代谢信号产生背景干扰，从而限制了该平台在某些应用中的实用性。已有研究使用多种非肝脏细胞作为饲养细胞与肝细胞共培养，包括人和大鼠皮肤成纤维细胞以及牛主动脉内皮细胞，结果显示其白蛋白分泌和紧密连接形成与来源于肝脏的饲养细胞共培养体系相当。16然而，TV2D+ 非肝饲养细胞与原代人肝细胞（PHHs）在培养中的相互作用机制仍需进一步研究，以更深入理解该体系中对 PHHs 稳定性和功能的影响。此前由 Weaver 等人描述的培养体系8 可成功将原代人肝细胞（PHHs）以肝细胞克隆形式培养长达42天，并形成广泛的胆小管网络。在此系统中培养的PHHs至少在22天内维持了关键的肝细胞功能，包括细胞色素P450 1A2、2B6和3A4活性，尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）介导的酶活性，Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物的生成，白蛋白分泌以及尿素合成 体外 不使用Matrigel。该培养系统可产生稳定且具有生理相关性的输出结果，可轻松适应任何实验室的药理学和毒理学应用。尽管TV2D+系统能够维持原代人肝细胞（PHH）的关键功能，但尚未与3D类球体模型进行直接比较；然而，未来通过在同一PHH供体间对不同培养系统进行比较研究，将有助于明确两种方法的局限性与优势。
TV2D+ 的潜在应用包括评估低代谢化合物的代谢清除率和药物相互作用、药物性肝损伤以及农用化学品的风险评估。准确预测新药和新兴药物的肝清除率依赖于能够长期稳定培养并维持关键肝细胞功能的原代人肝细胞（PHH）模型，而在评估低代谢化合物时，这一点尤其具有挑战性。此外，风险评估和化学物质诱导的肝毒性是重要的健康问题，现有模型无法在体外长期维持细胞的稳定性和功能性，因而难以准确评估可能继发于急性暴露的潜在慢性化学毒性。在 TV2D+ 中培养的健康与疾病状态下的原代人肝细胞表现出随时间保持稳定的特征性功能差异和脂质分布差异17。这些研究结果表明，TV2D+ 是多种药理学和毒理学应用中极具前景的工具。

预测治疗的安全性和有效性是临床前药物开发的重要组成部分。然而，传统的临床前 体外 肝模型在准确模拟方面存在局限性 体内 肝脏细胞微环境，并随时间维持肝细胞的功能性和形态。目前需要能够提供稳定代谢能力超过1周的模型，以评估低周转率化合物或研究与亚急性或慢性暴露相关的效应。 体内 动物实验常因人与动物在肝脏清除机制上存在种属差异，而难以准确预测药物的有效性和风险1. 当前 体外 二维（2D）肝模型，例如传统的人原代肝细胞（PHH）单层培养或三明治培养，缺乏表型稳定性和长期培养的持久性，导致随时间推移关键肝细胞功能和结构完整性的丧失2另一种方法是形成三维（3D）肝细胞球体，相较于二维培养可提供更接近生理的微环境。然而，该方法受限于原材料的可获得性、原代人肝细胞供体批次的选择、实验重复性，以及随着球体尺寸增大而出现的活力下降问题3,4,5,6已引入多细胞培养平台，将原代人肝细胞（PHHs）与饲养细胞共同接种于固定尺寸的微图案化培养板上。尽管这些模型可能延长培养时间，但此类平台中使用的非人类饲养细胞可能因对药物清除和代谢特征产生固有的背景干扰，而改变实验结果并限制其应用。1,7. Weaver 等人近期报道的 TruVivo 全人源二维+肝系统（TV2D+）8为解决原代人肝细胞（PHHs）在传统共培养及三维培养方法中存在的一些局限性，开发了该技术。所选用的非肝源性饲养细胞可减少物种间的代谢和旁分泌产物差异，并以一种传统单一批次供体来源的非实质肝细胞因扩增能力、表型及功能限制而无法实现的方式，为原代肝细胞提供可重复且稳定的支撑。这些饲养细胞在使用前可稳定扩增，且无需进行转化或分化。如Glicklis等人所述。4 和 Khetani 等人53D 培养模型（如肝细胞球体）由于供体差异性以及难以维持球体大小的一致性，存在可重复性方面的挑战，这会影响直径超过 200 µm 球体中的营养物质扩散，导致细胞活力和功能下降。与 3D 球体形成类似，TV2D+ 系统依赖于原代人肝细胞（PHH）的自组装；然而，形成的 PHH 细胞集落以单细胞层深度分散于孔板表面，而非压缩为单一聚集体。这种培养方法可能有助于应对供体差异性问题，允许 PHH 在不同接种密度下进行铺板、培养并维持基本功能。此外，由于在操作过程中存在细胞丢失风险，或需要特殊设备以实现 3D 球体的长期培养，TV2D+ 系统还可能提高实验操作的稳健性。

TV2D+ 系统结合了标准二维培养与通常伴随三维培养体系的长寿命和表型稳定性。本文所述方案为具备基本组织培养技能的研究人员提供了详细的操作步骤，适用于配备生物安全柜、离心机和 CO2 培养箱等标准设备的实验室。该流程的每一步均进行了详细说明，包括培养基制备、细胞解冻、接种及培养体系的日常维护。本方案还包含测定原代人肝细胞（PHH）基本功能指标的方法，如白蛋白和尿素的检测，以及通过免疫荧光图像分析评估 PHH 黏附情况以进行归一化处理。当正确建立培养体系后，TV2D+ 中的 PHH 会自组织形成肝细胞集落，模拟天然肝脏的形态结构，并至少维持两周的长期存活率、结构完整性和生理水平的白蛋白与尿素分泌8。由于该系统可适应不同密度的 PHH 接种，因此可能有助于提高那些具有理想供体特征但贴壁能力较差的 PHH 批次的利用率。这种可及性与功能性的结合，使 TV2D+ 成为适用于多种药理学和毒理学研究的合适肝脏模型。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m PES&amp;nbsp; 滤膜装置&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>565-0020</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 或 50 mL 锥形离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>352196 或 352070</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗兔二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A-21428</td><td>其他二抗亦可使用</td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白 18 抗体&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab24561</td><td>需使用相同稀释比例</td></tr><tr><td>AOPI&amp;nbsp;</td><td>Nexcelom&amp;nbsp;</td><td>CS2-0106-5mL</td><td>用于 Cellometer 细胞计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Labconoco</td><td>3460801</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>黑色壁、透明底 96 孔板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>165305</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Sorvall X4R</td><td>转速可达 400 × g</td></tr><tr><td>胶原蛋白包被 24 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662950</td><td>大鼠尾胶原蛋白包被</td></tr><tr><td>细胞计数载片</td><td>Nexcelom&amp;nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>用于 Cellometer 细胞计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养基&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-TCCM</td><td></td></tr><tr><td>培养补充剂&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-TCSC</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>00-4959-52</td><td>含封片介质</td></tr><tr><td>不含钙镁的 DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14190250</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>饲养细胞补充剂&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-TCSA</td><td></td></tr><tr><td>饲养细胞解冻培养基</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-FCTM</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>配备用户特定滤光片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肝细胞解冻培养基</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-HHTM4C-50ML</td><td></td></tr><tr><td>人白蛋白 ELISA 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab108788</td><td>若使用相同稀释比例则必需</td></tr><tr><td>人源饲养细胞</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>PHFC24</td><td></td></tr><tr><td>加湿培养箱&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97025-842</td><td>可维持 5% CO&lt;sub&gt;2&amp;nbsp;&lt;/sub&gt; 环境</td></tr><tr><td>细胞内固定缓冲液（IC Fixation buffer）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>00-8222-49</td><td>以多聚甲醛为基础，也可使用 10% 福尔马林</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Insitute of Health&amp;nbsp;</td><td>Version 1.52a&amp;nbsp;</td><td>1.52a 或更高版本&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>倒置相差显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CK40-F100</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>VWR</td><td>20170-022</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器（多种规格）</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>ErgoOne</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>通透缓冲液（10 倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>00-8333-56</td><td>其他通透缓冲液亦可使用</td></tr><tr><td>酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td>CLARIOstar</td><td>可读取 450–640 nm 吸光度</td></tr><tr><td>铺板培养基&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-TCPM</td><td></td></tr><tr><td>铺板补充剂&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>MED-TCSB</td><td></td></tr><tr><td>原代人肝细胞&amp;nbsp;</td><td>LifeNet Health&amp;nbsp;</td><td>多种&amp;nbsp;</td><td>货号可能因批次不同而异</td></tr><tr><td>二抗&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A-21428</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血清移液管控制器</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F110120</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100–500 mL 储液瓶&amp;ndash;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>76311-770</td><td>用户自选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尿素氮（BUN）检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Stanbio</td><td>0580-250</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>PolyScience</td><td>WBE05</td><td>可在 37 &amp;deg;C 下使用</td></tr></tbody></table>

一种用于药物开发的全人源肝细胞培养系统

An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications

为药理学和毒理学研究寻找一种长期稳定且与人类相关的原代人肝细胞（PHHs）培养模型仍然是一项挑战。目前 体外 模型平台通常存在操作不便、体系复杂、随时间推移表型稳定性差等问题，且无法支持多种原代人肝细胞（PHH）批次，导致实验可重复性与灵活性不足。本文提供了一种详细的操作方案，用于解冻、接种和维持一种全人源二维增强型肝细胞系统（TV2D+）。该系统利用标准的二维（2D）培养技术与设备，同时具备通常仅见于更复杂的三维（3D）系统所拥有的长期培养能力与表型稳定性。结果显示，TV2D+系统中细胞的贴壁率与接种效率随PHH接种密度变化而变化，且在培养期间功能稳定维持至少2周。通过评估一系列PHH接种密度，确定了实现成功长期培养的适宜条件。当建立得当时，TV2D+系统中的PHH可形成肝细胞克隆样集落，表达肝细胞特异性标志物，并维持细胞活力、结构完整性以及生理水平的白蛋白和尿素合成能力。这种独特性能组合使TV2D+系统成为适用于多种药理学与毒理学研究的理想肝细胞模型。

关键词：TV2D+，原代人肝细胞，二维增强型肝细胞系统，肝细胞培养，表型稳定性，药理学，毒理学，白蛋白，尿素，接种密度

肝细胞培养系统的铺板、培养及基本功能检测的整体方法涉及常见的原代细胞培养技术与分析，如图1所示。在培养第14天，通过ImageJ对每孔至少五张细胞角蛋白18（Cytokeratin 18）和DAPI染色图像进行分析，计算肝细胞的贴壁率和贴壁百分比（图2）。共培养体系中人原代肝细胞（PHHs）的代表性图像如图3所示。不同肝细胞接种密度在汇合度上表现出肉眼可见的差异，且在14天培养期间均维持典型的肝细胞立方状形态。针对供体A和供体B的肝细胞，在每种测试的接种密度下均采集了图像（图4A）。在所有测试的接种密度下，供体B的平均贴壁百分比（89.04% ± 3.99%，198,552 ± 49,885 PHHs）高于供体A（66.08% ± 6.67%，146,128 ± 33,063 PHHs）（图4B）。供体A在接种密度为150,000 PHHs/孔时贴壁百分比显著更高（76.07% ± 12.87%），相较于250,000–300,000 PHHs/孔（62.75% ± 9.64%）。供体B在不同接种密度下的肝细胞贴壁百分比无显著差异。供体B在最高接种密度（300,000 PHHs/孔）时肝细胞贴壁率最低（85.78% ± 13.25%）。与供体A类似，供体B在接种密度为150,000 PHHs/孔时肝细胞贴壁百分比最高（94.75% ± 15.07%）。
在14天的培养期间，于三个时间点测量了白蛋白生成和尿素合成，并根据计算的贴壁肝细胞数进行归一化。总体而言，供体A的白蛋白生成量高于供体B（41.32 ± 4.58 µg alb/天/106 PHHs vs. 34.66 ± 10.03 µg alb/天/106 PHHs）（图5）。当接种密度为150,000 PHHs/孔时，供体A和供体B的白蛋白生成量最高，分别为45.91 ± 5.96 µg alb/天/106 PHHs和48.67 ± 20.44 µg alb/天/106 PHHs。在所使用的不同接种密度之间，白蛋白生成量未观察到显著差异。根据Baudy等人3所述，理想的肝脏微生理系统应在14天培养期间维持稳定的白蛋白生成和尿素合成，变化幅度应小于50%。白蛋白生成的变异系数（CV）通过将第7、10和14天的标准差除以均值计算得出。所有样本均设两个重复。在接种密度为150,000 PHHs/孔时，供体A和供体B在整个14天培养期间的白蛋白输出CV分别为12.24%和37.97%，均低于50%的理想标准。当接种密度为250,000和300,000 PHHs/孔时，供体A和供体B的白蛋白生成均表现出较高的变异性。在这些接种密度下，两个供体在培养第7、10和14天之间的白蛋白生成均出现急剧下降（供体A的CV为22.49%，供体B的CV为45.07%）。
在平均第7、10和14天的PHH批次特异性数据时，供体B的尿素合成量（95.09 ± 18.91 µg尿素/天/106）高于供体A（64.92 ± 4.66 µg尿素/天/106 PHHs）（图6）。在14天培养期内，当接种密度分别为每孔150,000个PHHs（供体B）和每孔200,000个PHHs（供体A）时，供体B（113.49 ± 37.34 µg尿素/天/106 PHHs）和供体A（69.12 ± 17.06 µg尿素/天/106 PHHs）的尿素合成量达到最高。两个供体批次在每孔300,000个PHHs的接种密度下，尿素产量最低且变异系数（CV）最高。在所使用的不同接种密度之间，尿素合成量未见显著差异。供体A在每孔250,000个PHHs时尿素合成的变异系数最低（23.11%），而供体B在每孔200,000个PHHs时变异系数最低（28.26%）。如这些结果所示，特定批次PHH的最佳接种密度取决于实验检测时所需的汇合度水平以及所测量指标的性质；较高的接种密度并不总是与更高的信号强度或动态范围相关。
<img alt="饲养细胞与肝细胞的解冻与接种、功能检测流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：肝细胞与饲养细胞共接种、培养及功能检测的流程图。 （A）饲养细胞在特定解冻培养基中解冻（参见材料表），重悬于完全接种培养基中（参见材料表），计数细胞。细胞稀释后接种，并在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 60 分钟。（B）肝细胞在特定解冻培养基中解冻（参见材料表），重悬于完全接种培养基中，并进行细胞计数。肝细胞经稀释后与饲养细胞共同接种。细胞在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 2–4 小时，培养开始的前 60 分钟内每 15 分钟以南北东西方向轻摇一次。接种培养基更换为预热的完全培养基以维持培养（参见材料表）。每日更换培养基。（C）在培养第 7、10 和 14 天收集培养基样本，用于白蛋白和尿素检测。在第 14 天取样后，细胞经固定，并使用细胞角蛋白 18（Cytokeratin 18）抗体（参见材料表）在 4 °C 下孵育 16–24 小时。随后，细胞与适当的二抗孵育，洗涤后用 DAPI 封片（参见材料表），用于图像采集与分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分析过程；图像阈值分割、DAPI颗粒分析、细胞计数；显微成像工作流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：使用ImageJ软件进行图像分析。对采集的图像进行ImageJ处理。 步骤1：根据显微镜特定的标尺对所有图像应用比例尺。步骤2：更改图像类型。步骤3：应用阈值以选择DAPI颗粒。步骤4：执行颗粒分析，并记录计数结果。步骤5：为确定贴壁饲养层细胞的数量，使用多点工具对合并图像进行计数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="不同时间点的肝细胞培养密度比较；显微镜图像；细胞生长分析；供体 A 与 B 的比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：与饲养层细胞共培养的不同肝细胞接种密度的形态学表现。 在接种密度分别为 150,000、200,000、250,000 和 300,000 个 PHH/孔的条件下，PHH 与饲养层细胞共同培养第 7 天和第 14 天的代表性图像。图像使用倒置相差显微镜配备 10 倍物镜拍摄。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞密度变化的显微镜图像、免疫荧光染色；细胞分析图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图4：与饲养细胞共培养的不同肝细胞接种密度的荧光免疫细胞化学。 (A) 第14天在每孔肝细胞接种密度分别为150,000、200,000、250,000和300,000个PHHs的条件下，细胞角蛋白18（红色）染色的代表性图像。每个接种密度取两孔，固定30分钟 4 °C. 将孔板在16–24 h内孵育于 4° C 以1:1000的一抗孵育，随后以1:500的二抗在室温下孵育30分钟 4 °C 避光孵育。在室温下向孔板中加入 DAPI（蓝色）核染色剂，孵育 15 分钟。使用倒置荧光显微镜配备 10X 物镜拍摄图像。比例尺 = 100 µm. (B使用 ImageJ 计算不同肝脏接种密度下的贴壁肝细胞数量及贴壁率。 * ≤ 0.05，换算为每孔200,000、250,000和300,000个PHH时的百分比贴壁率。误差线表示标准差（每种条件下 ≥ 5张图像）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞活力比较；PHH浓度与白蛋白产量；柱状图数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：共培养饲养层细胞的肝细胞白蛋白产量。不同肝细胞接种密度（每孔150,000、200,000、250,000和300,000个PHHs）下的白蛋白产量。柱状图表示以每孔贴壁肝细胞总数归一化的白蛋白产量（微克/天）在14天内的平均值。折线表示第7、10和14天之间的变异系数（CV）。误差线代表标准差（每种条件至少2个孔，含重复）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="两名供体肝细胞的尿素合成比较图，显示每孔细胞数量的差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：与饲养细胞共培养的肝细胞的尿素合成。 从每孔150,000、200,000、250,000和300,000个PHHs的肝细胞接种密度测定尿素合成。柱状图表示14天的平均值 µg 尿素/天，按总贴壁肝细胞数标准化。线条表示第7、10和14天之间的变异系数（%CV）。误差棒代表标准差（每种条件至少2个孔，含重复实验）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标准品 (S) 编号</td>
			<td>浓度 (µg/mL)</td>
			<td>尿素溶液 (µL)</td>
			<td>完全培养基 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>100</td>
			<td>53.3 
			75 mg/dL 储备液</td>
			<td>346.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>100 
			(S1 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>25</td>
			<td>100 
			(S2 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>100 
			(S3 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>6.26</td>
			<td>100 
			(S4 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>3.125</td>
			<td>100 
			(S5 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.5625</td>
			<td>100 
			(S6 溶液)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空白</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：尿素标准样品的制备。使用75 mg/dL的尿素储备液，配制100 µg/mL的尿素溶液。分装建议体积，以获得标准曲线所需的终浓度。

近期技术进步使得大规模生产成为可能 体外 用于药物代谢和毒性研究的平台。一种全人源二维肝样系统（TV2D+）利用传统的二维培养方法提供符合生理相关性的结果。本方案将协助终端用户完成该系统的建立、维护和应用。

为药理学和毒理学研究寻找一种长期稳定且与人类相关的原代人肝细胞（PHHs）培养模型仍然是一个挑战。

TruVivo 的开发旨在满足对一种便捷且稳健的体外平台的需求，该平台能够维持表型稳定且功能完整的原代人肝细胞。由于具备这些特性，该系统可作为回答临床前药物开发相关广泛问题的基础平台。其中一个挑战是需要构建一种多细胞系统，既具有回答当前科学问题所需的生物学复杂性，又依然易于使用。现有的系统通常难以长期维持肝细胞的形态和功能，或在建立常规、可重复的结果方面存在技术挑战。使用 TruVivo，用户仍可依赖传统二维细胞培养技术的简便性和灵活性。此外，该系统无需特殊设备，且适用于传统的分析方法。借助 TruVivo，我们现在能够在化合物进入临床前评估之前，更准确地预测其代谢清除率、主要代谢产物、关键消除途径以及其他药代动力学性质，尤其是半衰期较长的化合物。首先，在37摄氏度水浴中解冻每种饲养细胞解冻培养基、补充剂A、补充剂B和补充剂C各一瓶。或者，可在4摄氏度冰箱中冷藏16至24小时。将每瓶解冻后的培养基全部转移至一个15毫升或50毫升的锥形管中。为配制完全铺板培养基，取一瓶铺板培养基，先加入4.5毫升的补充剂B，随后加入11毫升的补充剂A。另取一瓶，加入100毫升培养基、1毫升补充剂C和14毫升补充剂A，混匀以制备完全培养基。将剩余的补充剂 C 和补充剂 A 保存在 -20 摄氏度，直至第二周培养基的配制。开始时，将饲养层细胞在 37 摄氏度水浴中解冻 1 到 2 分钟。解冻后立即置于冰上。在生物安全柜内采用无菌技术操作，将刚解冻的细胞加入10毫升饲养细胞解冻培养基中。然后使用1,000微升移液器吸取1毫升解冻培养基中的细胞悬液，冲洗空的细胞冻存管，并将冲洗液合并至其余细胞悬液中。在室温下以400G离心力离心4分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于1 mL完全铺板培养基中后，计数饲养细胞。然后用完全铺板培养基稀释细胞悬液。接下来，将稀释后的细胞悬液每孔500 µL接种至胶原包被的24孔板中。通过先在南北方向来回振荡两次，再在东西方向进行同样动作，以北、南、东、西的顺序摇动培养板。最后，在接种原代人肝细胞之前，将培养板进行孵育。在解冻用于接种的肝细胞之前，先检查饲养细胞的贴壁情况。在饲养细胞培养近一小时后，进行原代人肝细胞（PHHs）的铺板操作。具体操作如下：饲养细胞培养30分钟后，将预热的肝细胞解冻培养基通过0.2微米的聚醚砜滤器过滤。将原代人肝细胞（PHHs）在37摄氏度水浴中解冻1至2分钟。解冻后立即置于冰上。随后在生物安全柜中，将解冻后的细胞转移至肝细胞解冻培养基中。使用1,000微升移液器，将一毫升解冻液中的肝细胞悬液转移回冻存管中，通过轻柔吹打洗涤管壁3至4次。将洗涤液与管中其余细胞悬液合并。盖紧管盖，轻轻倒置解冻后的原代人肝细胞（PHH）悬液5次。在室温下以100×g离心8分钟。小心弃去上清液，可通过真空抽吸或移液操作，注意不要扰动细胞沉淀。然后沿含有沉淀的锥形管管壁加入3 mL完全铺板培养基。轻轻左右摇动锥形管以重新悬浮细胞沉淀，并加入5 mL完全铺板培养基。计数重新悬浮的肝细胞后，用完全铺板培养基将细胞悬液调整至所需的接种密度。接着，取预先接种了饲养细胞的胶原包被24孔板，使用移液器或真空抽吸法去除饲养细胞的培养基。立即将500微升稀释后的肝细胞悬液接种至含有饲养层细胞的每个孔中。通过先在南北方向来回摇动两次，再在东西方向进行相同的摇动，以“北、南、东、西”的顺序轻轻震荡培养板。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2至4小时。在培养的前60分钟内，每15分钟轻轻摇动培养板一次，操作方法如前所述。孵育结束后，将培养板从培养箱转移至生物安全柜中。摇匀后，使用移液器或真空抽吸法去除完全铺板培养基。立即向每个孔中加入 500 µL 预热的完全培养基。在培养的第 7 天和第 14 天，获取了来自两位供体的 PHH 细胞在不同接种密度下与饲养细胞共同培养的图像。不同接种密度在汇合度上表现出明显的视觉差异，但均保持了典型的肝细胞立方状形态。

an-all-human-hepatic-culture-system-for-drug-development-applications

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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