拆装时间推移显微镜监测肌动蛋白
2006年11月8日
好的，我今天想做的是向大家展示如何构建流动室，即用于在正置显微镜上成像的融合室。然后我要做的是用胶片创造两个空间。所以我所做的就是把 para film 剪成小条。
接下来，这基本上会形成墙壁的通道，然后我用倾斜的空气吹干它们。我把封面放在段落的顶部，这是完成的。然后我在加热块上加热它以融化参数并基本上形成一个密封。
所以，这就是这里的盖板玻璃，然后在盖板玻璃的顶部是两层 phim，就像你在这里看到的那样。然后，再说一次，这是一个 22 x 2 毫米的盖玻片。这个就在这里，我把它压在参数上以落下密封。
好的，液体在这里朝一个方向进去，我可以用滤纸朝这个方向吸出。我稍后会向你展示如何做到这一点。所以我喜欢做的是把它放在一个加湿的房间里，这很简单。
取两种高架条，下面放一个纸过滤器。为了保持嘈杂，我把盖子、盖玻片放在流动室上。现在，您向腔室引入解决方案的方法是，您只需将移液管尖端放在腔室的入口处，然后分开即可。
现在我所做的是在盖上盖子的情况下孵育腔室 10 分钟。我通常从另一侧吸出液体的做法是使用它，拿一张滤纸，像这样把它剪成细条。我取其中一条细条，同时将溶液涂抹到入口处，同时将滤纸放在出口处以吸取交换物，即溶液。
所以你会看到液体流过溶液。然后我等待 5 分钟，等待中收盘。现在我准备做的是实际将肌动蛋白和肌动蛋白放入其中，我实际上必须聚合，我在流动室内聚合，这与之前的程序相同。
所以因为像这样，然后现在作用是聚合的，我使用大量缓冲液洗掉所有未过量的未聚合作用。所以这里我有大约 100 微升，这是几个反应室体积的缓冲液。只是，你知道，当滤纸饱和时，我必须改变方向。好？
所以我准备用它来做成像。所以带有肌动蛋白的灌注室。现在我拿起载玻片，把它安装在显微镜下，因为我用油物镜成像，所以我要在盖子的顶面上放一些浸油，草地触摸，这样评估溶液或蛋白质或任何作用在里面的东西。
所以我所做的是，在进行延时成像时，我实际上可以交换解决方案侧。因此。
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概述
本文展示了在立体显微镜上进行成像时构建流动室和融合室的过程。该过程涉及使用防水膜创建通道并用热封装。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
背景
- 流动室对于各种成像技术至关重要。
- 构建融合室可以增强成像能力。
- 防水膜在实验室环境中常用于创建密封。
- 了解构建过程对该领域的研究人员至关重要。
研究目的
- 提供构建流动室的分步指南。
- 说明防水膜在创建成像室中的使用。
- 增强研究人员对成像技术的可访问性。
使用的方法
- 将防水膜切成条状以形成通道。
- 用倾斜的空气干燥条状物。
- 在防水膜上方放置一个盖玻片。
- 在加热块上加热组件以创建密封。
主要结果
- 成功构建了一个功能性流动室。
- 密封过程有效地为成像创建了稳定的环境。
- 所示方法对于实验室使用是可重复的。
- 研究人员可以将此技术应用于各种成像应用。
结论
- 流动室和融合室的构建是简单的。
- 这种方法可以促进高级成像研究。
- 对这些技术的可访问性可以增强研究结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
