Name: 使用Smart Legino的冷冻电子显微镜跨多个网格进行自动化筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解使用Smart Leginon Autoscreen实现冷冻电子显微镜多网格自动化筛选的方法。该方案通过机器学习优化数据采集流程，显著减少每日筛选时间，帮助研究人员高效完成样品条件优化与并行分析。

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部分工作在纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心完成，得到了西蒙斯基金会（SF349247）、美国国立卫生研究院（U24 GM129539）以及纽约州议会的支持。

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

<ol><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM.</a> Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+optimization+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid optimization for membrane proteins.</a> iScience. 24 (3), 102139(2021).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+collection+of+high-resolution+cryo-EM+datasets+using+200+KV+transmission+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 181, 63519(2022).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+multi-grid+cryoEM+screening+using+Smart+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon.</a> IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).</li>
<li>Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+automate+cryo-electron+microscopy+data+collection+with+Ptolemy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy.</a> IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+data+collection+for+CryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Smart data collection for CryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913(2022).</li>
<li>Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+systematic+evaluation+of+cryo-EM+specimens+with+SmartScope%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope.</a> eLife. 11, e80047(2022).</li>
<li>Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+EPU%3A+SPA+Getting+Intelligent%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Smart EPU: SPA Getting Intelligent.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).</li>
<li>Fan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoRL%3A+Reinforcement+learning+enables+efficient+cryo-EM+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection.</a> arXiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+path+planning+surpasses+human+efficiency+in+cryo-EM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging.</a> bioRxiv. Biophysics. , (2022).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).</li>
<li>Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+seeing+molecules+in+cells%2C+CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22CZ+Imaging+Institute%27s+Hardware+Frontiers+for+CryoET+Workshop%22%5BJournal%5D)">The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop.</a> CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopic+grid+preparation+for+time-resolved+studies+using+a+novel+robotic+system%2C+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.</a> Journal of Visualized Experiments. 168, 62271(2021).</li>
<li>Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+a+paradigm+shift+in+CryoEM+sample+preparation+with+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本方案中，我们描述了 Smart Leginon Autoscreen 的工作流程，并为初次使用该采集软件的用户补充介绍了 Leginon 的基本操作。截至2024年底，单颗粒冷冻电镜（cryoEM）有望成为最高效的三维（3D）蛋白质结构解析技术17。单颗粒冷冻电镜的工作流程包含多个步骤，这些步骤正在持续优化，以提高数据质量和通量。图2展示了最常见的步骤（样品制备、载网制备、筛选耗时与人力、高分辨率数据采集时间、实时处理以及完整后期处理），以及流程中可进一步改进的其他组成部分（筛选用显微镜的可及性、样品台速度与精度、相机采集速度以及高分辨率显微镜的可及性）。大多数步骤的结果会形成反馈回路，影响之前的步骤（图2中的蓝色箭头），从而使整个流程高度相互依赖。图2中每个步骤以不同颜色标注，大致表示该步骤相对于其他步骤的瓶颈程度。Smart Leginon Autoscreen 将筛选12个载网的操作时间从6小时减少到不到10分钟，显著降低了人力投入，缓解了这一瓶颈，从而加快了对样品/载网制备环节的反馈（图3）。
方案中的若干关键步骤如图1所示。用于创建模板会话的载网必须能够代表后续待筛选的所有载网，这一点至关重要。重要的是，Leginon会记录创建模板会话整个设置过程中的所有参数（图1中的蓝色步骤），从而使得每次重复建立模板会话时能够更快速地完成。在创建模板会话时，最关键的步骤是在所有放大倍数下设置靶向参数，以确保这些参数和阈值能够反映待筛选载网之间的预期差异。各种“测试”按钮有助于提高此设置过程的效率。在进行Autoscreen会话期间，必须在Appion中密切监控前几个载网，以便尽早发现任何问题，并立即在Leginon中进行修正。
SEMC 的典型工作流程是将 Autoscreen 数据输入 CryoSPARC Live18，并利用这些附加信息反馈优化样品和载网的制备过程。在研究人员与操作员集中进行冷冻电镜优化期间，即使 Autoscreen 仍在筛选载网，有关样品和载网状态的信息也会实时反馈至样品和载网的制备环节。这使得每周能够制备并筛选数十个载网8。
Smart Leginon Autoscreen 在 SEMC 观察到的大多数（80%-90%）有孔载网上和条件下均能有效工作。其余 10%-20% 的载网包括某些效果不佳的情况——孔与基底之间对比度差异极小的载网；孔径和间距较小的载网（例如 0.6/0.8）；以及跨多个载网进行靶向通常不切实际的情况——如 Spotiton/Chameleon19,20 载网，其样品呈条带状分布在载网上；网状载网。请注意，倾斜载网采集功能目前正处于 Autoscreen 的开发阶段，尚不可用。可以通过修改方案以适配 Spotiton/Chameleon 载网：首先手动成像条带区域以确定较窄的参数阈值，然后在步骤 2.1.7.4 中尝试分别将较大和较小的方格归为两组，再从含冰的组中选择靶点。该修改的目标是让 Smart Leginon 将空方格与非空方格自动分为两组。即使找到了适用参数，这些参数也可能无法很好地推广至其他待筛查的载网。此外，也可通过在步骤 2.1.9.1 中移除 hl_finding.sh 脚本，并根据需要调整参数以靶向更亮或更暗的区域，从而修改方案以适配网状载网。该修改的成功率可能因冰层厚度和载网材料的不同而有所差异。
在 Autoscreen 运行期间进行故障排查是可行的，有时也是必要的。在自动采集过程中，可以修改预设参数（例如离焦量）和定位参数（例如孔洞定位阈值）。当 Autoscreen 会话正在进行数据采集时，无法取消网格会话，因为这将终止 autoscreen.py 程序。然而，可以使用定位节点中的“中止”按钮来跳过某个网格的任何部分或整个网格。偶尔，autoscreen.py 可能因占用过多内存而冻结，此时将出现两个选项：“强制退出”或“等待”。如果选择“强制退出”，整个脚本将终止，用户需要重新运行脚本以对剩余的网格继续进行筛选。如果选择“等待”，脚本将继续运行，此时可调整设置以防止未来再次发生冻结，例如关闭曝光节点中的图像显示、减小图谱中的像素尺寸，或运行内存清理脚本。如果程序冻结且未提供上述两个选项，则内存错误可能无法自行恢复，导致数据采集暂停。在此情况下，“强制退出”选项可能更为适用。
Smart Leginon Autoscreen 在 SEMC 被常规使用。随着单颗粒冷冻电镜流程中的瓶颈不断被消除，冷冻电镜技术的应用将持续增长，以助力解答生物学问题。本实验方案朝着优化整个流程的方向迈出了一步，为显著减少反馈循环提供了清晰的路径。

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）可实现对纯化的生物大分子复合物进行近原子分辨率的结构解析。一次单颗粒cryoEM实验通常只需从大量具有不同样品和载网条件的载网中，挑选出一至两个经过充分优化的载网即可。为了评估这些载网，需要在显微镜下对每个载网在多个放大倍数下成像，以判断其是否满足高分辨率数据收集的关键要求，包括冰层厚度、足够用于完整数据采集的区域、蛋白质纯度、蛋白质浓度、蛋白质稳定性以及取向偏好最小化等问题1。针对这些关键要求的优化，通常需要在显微镜筛选与样品制备条件（如蛋白质表达、缓冲液选择、潜在去垢剂的使用以及载网类型）之间进行反复反馈与调整2,3,4（图1）。传统的载网筛选通常通过手动或半自动软件（如Leginon5、SerialEM6和EPU7）完成。这种传统方法要求操作人员在显微镜前耗费数小时完成多个载网的筛查，导致操作者被大量重复性操作占据，严重制约了高分辨率单颗粒分析流程的效率。
此前，已介绍过 Smart Leginon Autoscreen 及其底层机器学习软件 Ptolemy，并描述了其基本方法、算法及示例8,9。目前已有多个软件包具备或正在开发实现全自动多载网筛选的能力10，其中包括 SmartScope11、Smart EPU12 和 CryoRL13,14。为解决筛选过程中的瓶颈问题，Smart Leginon 允许用户首先在模板显微镜会话中设置筛选参数，然后将该模板会话的参数作为标准，用于对显微镜自动进样器中的整盒载网进行筛选。该方法消除了载网筛选过程中的所有手动操作，从而显著提高了优化反馈循环的效率。
本方案详细描述了完整的 Smart Leginon Autoscreen 工作流程，使读者能够独立进行全自动多网格冷冻电镜筛选。对于初次使用 Leginon 的用户，方案的第一部分介绍了传统的 Leginon 操作方法。这部分知识汇集了在多台自动进样显微镜上积累的多年经验，并在此基础上进一步构建了后续的 Smart Leginon 部分内容。更多教学视频可访问 https://memc.nysbc.org 获取。

<table><tbody><tr><td>Glacios 冷冻透射电镜&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>GLACIOSTEM</td><td>FEG，200 keV，Falcon 3EC 相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Krios 冷冻透射电镜&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>KRIOSG4TEM</td><td>XFEG，300 keV，&amp;nbsp;Gatan BioQuantum 能量滤波器，Gatan K3 相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leginon&amp;nbsp;</td><td>Simons 电子显微镜中心&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://leginon.org&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ptolemy&amp;nbsp;</td><td>Simons 机器学习中心&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用智能leginon实现跨多个载网的冷冻电子显微镜筛选自动化

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

过去十年中，冷冻电子显微镜（cryoEM）技术的进步使结构生物学家能够常规地以接近原子级分辨率解析大分子蛋白质复合物的结构。整个cryoEM流程的通用工作流程包括在样品制备、cryoEM载网制备和样品/载网筛选之间反复迭代，然后进入高分辨率数据采集阶段。样品/载网制备与筛选之间的反复迭代通常是研究人员面临的主要瓶颈，因为每一次迭代实验都必须优化样品浓度、缓冲液条件、载网材料、载网孔径、冰层厚度以及蛋白质颗粒在冰中的行为等多种变量。此外，即使这些变量已得到满意确定，在相同条件下制备的载网在是否适合数据采集方面仍存在显著差异，因此建议在选择用于高分辨率数据采集的最佳载网之前进行额外的筛选。这一样品/载网制备与筛选过程通常会消耗数十个载网以及操作人员在显微镜上数天的工作时间。此外，筛选过程还受限于操作人员/显微镜的可用性及显微镜的可及性。本文中，我们将演示如何使用Leginon和Smart Leginon Autoscreen来自动化完成cryoEM载网筛选的大部分工作。Autoscreen结合了机器学习、计算机视觉算法和显微镜操作算法，消除了对持续人工操作输入的需求。Autoscreen可通过自动化的样品交换盒系统，自主加载并以多尺度成像方式对载网进行成像，从而实现对整盒载网的无人值守筛选。结果表明，使用Autoscreen对12个载网进行筛选的操作时间可缩短至约10分钟，而此前的方法由于无法应对载网间高度变异的问题，所需时间约为6小时。本实验方案首先介绍Leginon的基本设置与功能，然后逐步演示Autoscreen的功能，从模板会话的创建到完成12个载网的自动化筛选会话为止。

根据该方案，大多数（80%-90%）带孔载网及条件下的冷冻电镜筛选实验可实现自动且成功的运行。此前已有多个示例和实验8,9展示了Smart Leginon Autoscreen成功运行时的预期结果。一次成功的Autoscreen运行通常以约10分钟的初始化设置开始，随后在约6小时（每张载网30分钟）内自动完成一个盒装12张载网的全部筛选，每张载网中3-5个不同大小的方格、每个方格内3-5个孔洞均以高倍率成像，使用户能够快速判断每张载网上的样品特性，并迅速优化样品与载网的条件（图3）。然而，偶尔也会出现筛选失败的情况，常见原因包括Autoscreen定位到了破损的方格、未能正确识别载网或方格间较大的冰层厚度梯度，或在碳膜载网上无法正确识别孔洞。此外，潜在的内存泄漏可能导致Leginon因内存占用过高而崩溃，可通过释放内存、重启计算机，或为计算机增加更多内存来解决或缓解该问题。
<img alt="电子显微镜工作流程示意图：模板会话设置、校准、自动筛选过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：Smart Leginon Autoscreen 工作流程。 Smart Leginon Autoscreen 工作流程的高级概述。首先，通过为待筛选样品网格批次中的代表性网格选择参数，创建模板会话。设置 Leginon 并创建模板会话所需时间少于 45 分钟。其次，配置 Autoscreen 以使用模板会话的参数对盒中所有网格进行筛选，此过程耗时少于 10 分钟。最后，Autoscreen 结束筛选会话。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示从样品制备到高分辨率成像的工作流程图；突出显示过程瓶颈。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：自动化筛选前的传统单颗粒冷冻电镜流程。 自动化筛选前传统单颗粒冷冻电镜流程中最常见的步骤，以及可改进的环节。各步骤的颜色反映了其相对于其他步骤成为瓶颈的程度。蓝色圆形箭头表示大多数步骤之间存在的多个反馈循环。多个步骤的通量在很大程度上取决于样品、经费以及研究人员所在地区。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜载网制备；示意图比较冰层厚度和颗粒分布；显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66007/66007fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Smart Leginon Autoscreen 的代表性结果。 采用 TFS Krios 冷冻透射电镜（配备 BioQuantum 能量过滤器和 K3 相机）按照 Smart Leginon Autoscreen 方案采集的多尺度图像。(A) 一张复合的“图谱”图像，展示冷冻电镜载网的整体情况。(B-F) 载网图谱中指定位置的多尺度图像。第一行为低倍图像，第二行为中倍图像，第三行为高倍图像，均由系统自动选取，以获取从薄冰到厚冰区域的样品信息。Leginon 估算的冰层厚度显示在底部。标尺在 (A) 中为 500 µm，在 (B-F) 中分别为第一行 10 µm、第二行 5 µm、第三行 100 nm。本图经 Cheng 等人8 许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/66007fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>gr：网格 </td>
			<td>方：Square </td>
			<td>hln：孔 </td>
			<td>风扇：自动对焦 </td>
			<td>fcn：中枢焦点 </td>
			<td>暴露 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放大倍数 </td>
			<td>210 </td>
			<td>2600 </td>
			<td>6700 </td>
			<td>120000 </td>
			<td>120000 </td>
			<td>120000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离焦 </td>
			<td>-0.0002 </td>
			<td>-0.00015 </td>
			<td>-0.00015 </td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
			<td>-7 × 10-07 </td>
			<td>-2.5 × 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>斑点大小 </td>
			<td>5 </td>
			<td>5 </td>
			<td>4 </td>
			<td>2 </td>
			<td>2 </td>
			<td>2 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>强度 </td>
			<td>1.1 </td>
			<td>0.83 </td>
			<td>0.65 </td>
			<td>0.44 </td>
			<td>0.44 </td>
			<td>0.45 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维度 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>4096 x 4096 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>偏移量 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>512, 512 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分箱 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 x 4 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
			<td>1 × 1 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光时间（ms） </td>
			<td>200 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>1000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>暴露前（s） </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>剂量（e/Å2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>36.5 </td>
			<td>36.5 </td>
			<td>64.7 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存原始帧 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>是 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：使用Glacios cryoTEM配备Falcon 3EC相机在中国科学院西蒙斯电子显微镜中心（SEMC）进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 列出了SEMC在Glacios cryoTEM配备Falcon 3EC相机上常用各预设模式的参数。不同显微镜可提供的放大倍数可能不同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>gr：网格 </td>
			<td>平方：Square </td>
			<td>hln：孔 </td>
			<td>风扇：自动对焦 </td>
			<td>fcn：中央焦点 </td>
			<td>暴露 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放大倍数 </td>
			<td>64 </td>
			<td>1700 </td>
			<td>2850 </td>
			<td>75000 </td>
			<td>75000 </td>
			<td>75000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离焦 </td>
			<td>0 </td>
			<td>-5 × 10-05 </td>
			<td>-5 × 10-05 </td>
			<td>-1 × 10-06 </td>
			<td>-7 × 10-07 </td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光斑尺寸 </td>
			<td>6 </td>
			<td>9 </td>
			<td>9 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
			<td>7 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>强度 </td>
			<td>0.001 </td>
			<td>1.65 × 10-05 </td>
			<td>1.5 × 10-05 </td>
			<td>4.3 × 10-07 </td>
			<td>4.3 × 10-07 </td>
			<td>5.5 × 10-07 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>能量滤波宽度 </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维度 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>2048 x 2048 </td>
			<td>4096 x 4096 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>偏移量 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分箱 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
			<td>1 × 1 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光时间（ms） </td>
			<td>500 </td>
			<td>2000 </td>
			<td>1000 </td>
			<td>500 </td>
			<td>300 </td>
			<td>8700 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>暴露前 (s) </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>剂量（e/Å2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>47.4 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存原始帧 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>是 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：使用配备Selectris X和Falcon 4i相机的Krios冷冻透射电镜在SEMC进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 显示了在SEMC使用配备Selectris X能量过滤器和Falcon 4i相机的Krios冷冻透射电镜时常用各预设的参数。不同显微镜可提供的放大倍数不同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>gr：网格 </td>
			<td>平方：Square </td>
			<td>hln：孔 </td>
			<td>风扇：自动对焦 </td>
			<td>fcn：中央焦点 </td>
			<td>暴露 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放大倍数 </td>
			<td>1550 </td>
			<td>940 </td>
			<td>2250 </td>
			<td>81000 </td>
			<td>81000 </td>
			<td>81000 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离焦 </td>
			<td>0 </td>
			<td>-5 × 10-05 </td>
			<td>-5 × 10-05 </td>
			<td>-1 × 10-06 </td>
			<td>-7 × 10-07 </td>
			<td>-2 × 10-06 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>斑点大小 </td>
			<td>4 </td>
			<td>8 </td>
			<td>7 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
			<td>6 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>强度 </td>
			<td>0.0015 </td>
			<td>0.00017 </td>
			<td>7.3 x 10-05 </td>
			<td>1.3 × 10-06 </td>
			<td>1.3 × 10-06 </td>
			<td>9.2 × 10-07 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>能量滤波宽度 </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>50 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
			<td>20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维度 </td>
			<td>1024 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1440 x 1024 </td>
			<td>1008 x 1008 </td>
			<td>5760 x 4092 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>偏移量 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>0, 0 </td>
			<td>936, 519 </td>
			<td>0, 0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分箱 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>8 x 8 </td>
			<td>4 × 4 </td>
			<td>2 x 2 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光时间（ms） </td>
			<td>250 </td>
			<td>600 </td>
			<td>600 </td>
			<td>500 </td>
			<td>500 </td>
			<td>2100 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>暴露前 (s) </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
			<td>0 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>剂量（e/Å）2) </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>-- </td>
			<td>51 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存原始帧 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>无 </td>
			<td>是 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：使用配备BioQuantum能量过滤器和K3相机的Krios冷冻透射电镜在SEMC进行冷冻电镜载网筛选的预设参数。 列出了在SEMC使用配备BioQuantum能量过滤器和K3相机的Krios冷冻透射电镜时常用各预设的参数。不同显微镜可提供的放大倍数各不相同，不同实验也会采用如离焦量和曝光时间等不同的参数。
补充图1：Smart Leginon的方形定位设置和方形设置。（A）方形定位设置。（B）方形设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(1).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：Smart Leginon的孔定位设置和孔设置。（A）孔定位设置。（B）孔设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(2).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：Smart Leginon的曝光定位设置和曝光设置。（A）曝光定位设置。（B）曝光设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(3).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：Smart Leginon的对焦设置与对焦序列设置。（A）对焦设置。（B）对焦序列设置（Defocus1）。（C）对焦序列设置（Defocus2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(4).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 5：Smart Leginon 的 Z_Focus 设置和 Z_Focus 序列设置。(A) Z_Focus 设置。(B) Z_Focus 序列设置（Stage_Tilt_Rough）。(C) Z_Focus 序列设置（Stage_Tilt_Fine）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(5).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图6：设置Smart Leginon Square_Targeting参数后的示例图谱。 蓝色圆圈代表斑点，绿色加号代表采集位置，棕色的“x”表示当前载物台位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(6).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图7：设置Smart Leginon Hole_Targeting参数后的示例图谱。 紫色加号表示晶格位置，带方框的绿色加号表示采集位置，蓝色加号表示对焦位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(7).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图8：设置Smart Leginon Exposure_Targeting参数后的示例图谱。 蓝色圆圈为斑点，绿色加号为采集位置，蓝色加号为对焦位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(8).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图9：Smart Leginon Autoscreen 终端设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(9).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图10：Smart Leginon Autoscreen 图形用户界面设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66007/Supplementary%20Figure%20(10).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

冷冻电子显微镜（cryoEM）多网格筛选通常是一个繁琐的过程，需要耗费数小时的注意力。本方案展示了如何设置标准的Leginon数据采集以及Smart Leginon Autoscreen，以实现该过程的自动化。该方案可适用于大多数cryoEM载网样品。

使用智能Leginon实现跨多个载网的冷冻电子显微镜筛选自动化

过去十年中，冷冻电子显微镜（cryoEM）技术的进步使结构生物学家能够常规地解析大分子复合物的高分辨率结构。

在西蒙斯电子显微镜中心，我们的目标是为本地和全国的研究人员提供卓越的电子显微镜服务、专业知识和培训，并开发创新方法以优化工作流程。我们的研究范围涵盖服务、技术开发、机器学习以及生物医学研究。我们致力于回答一个问题：如何更好地优化我们的服务？机器学习正在改变电子显微镜领域。数据采集正变得自动化，数据分析工具也正在迅速变得更加高效。这包括图像去噪、颗粒挑选、3G柔性分析以及模型构建。我们定期更新软件以应对不同情况，例如不同的网格孔、倾斜采集，或通过在生产环境中对软件进行β测试所发现的漏洞。我们还整合了用户的反馈，因此我们持续提供对他们有用的功能。Smart Leginon 解决了在冷冻透射电镜上筛选一个或多个载网时费力且耗时的问题。它使操作人员和研究人员能够更快地筛选和分析载网，同时腾出时间并行优化载网和样品条件。这还能减少显微镜的使用时间和成本。Smart Leginon Autoscreen 提供完全无人值守的多网格筛选功能，设置12个网格的筛选仅需约10分钟。与手动筛选相比，本方案每天可节省数小时时间。自 Smart Leginon 推出以来，已有其他免费及商业软件被开发用于实现类似的自动化功能。首先，设置 Leginon 界面，然后导航至“Application”（应用程序）并点击“Run”（运行）。在“Run Application”（运行应用程序）窗口中，选择 Ptolemy 应用程序，将主程序设为 Leginon 计算机，将显微镜和相机设为对应的计算机。接着在预设管理器中导入预设参数。在“方格定位节点设置”中，确保同时选中“按最短路径排序定位目标”和“启用自动定位”。在“方格节点设置”中，确认已勾选“等待节点处理图像”。如果尚未包含，请将“方格预设”添加到列表中。在高级设置中，勾选“成像时设置这些孔径”并确保孔径值正确。要调整孔定位节点设置，请勾选“允许用户验证所选目标”。取消勾选“排队处理目标”和“跳过自动寻孔功能”两项。在孔位节点设置中，勾选“等待节点处理图像”，并确认右侧列表中包含孔位预设。在高级设置中，勾选“成像时设置以下孔径”，并确认孔径数值。在曝光目标节点设置中，选择“允许用户验证所选目标”。确保取消勾选“排队目标”和“跳过自动孔位查找”选项。配置曝光节点设置时，确保取消勾选“等待节点处理图像”选项。确认曝光预设已包含在右侧列表中。在高级设置中，选择“成像时设置以下光圈”，并验证光圈值准确无误。在焦点节点设置中，确保取消勾选“等待节点处理图像”选项。确认右侧列出了自动对焦预设，并将期望的自动对焦精度设置为 4 × 10⁻⁶ 米。在焦点节点对焦序列中，仅启用双束倾斜自动对焦步骤。调整Z轴聚焦节点设置时，确保取消勾选“等待节点处理图像”。确认右侧列出的是Hole预设，并将期望的自动对焦精度设置为5 × 10⁻⁵米。在Z轴聚焦节点的对焦序列中，仅启用两个低倍率的载物台倾斜步进。确定网格Z高度并采集图谱后，在Ptolemy中使用方形靶向节点定位方格。观察每个方格上的蓝色圆圈。将鼠标悬停在每个斑点上，查看Ptolemy计算出的其大小，并记录最大和最小斑点的尺寸。要修改阈值设置，请调整最小和最大滤波范围，以包含理想的方格并排除不理想的方格。点击顶部工具栏上的“精细方格”按钮。微调滤波范围，直到“精细方格”功能能够有效定位目标方格。在采集设置中，为最大目标数和采样目标组数选择适当的数值。参数满意后，点击播放按钮继续。然后使用孔定位节点中的标尺工具测量孔的直径。在模板设置中，确保将测得的直径输入至最终模板直径，然后点击测试。调整直径值，直到所有孔的中心均显示明亮的白色峰值。在阈值设置中点击测试。调整A值，直至二值化图像仅在孔洞位置清晰显示白色区域。在“斑点设置”中，使用标尺测量距边缘的最小距离，并输入该值以排除边界目标。根据大小、圆度及期望的数量对斑点进行筛选。将鼠标悬停在斑点上可查看其数值，点击“测试”以查看当前设置。在晶格设置中输入孔的半径及孔之间的间距。然后点击 42 按钮，以测量真空区域的参考强度值。在采集设置中，勾选“使用采集目标的子集”，并将样本最大值设为较小的数值，例如 2。设定冰层厚度均值及其标准差的较宽范围。使用测试定位，根据上述数值随机选择目标。所有设置满意后，点击播放按钮继续。在孔设置中，将Shell脚本设置为Ptolemy安装目录下的hl.finding.sh脚本路径。将最小孔径设置为小于零。输入孔的半径，然后点击“显示数值”按钮，以测量真空区域的参考强度值。单击“测试”以找到孔的晶格。在采集设置中，勾选“使用采集目标的子集”，并将样本最大值设置为较小的数值，例如 4。设置较宽范围的冰层厚度均值和标准差。当确认所有设置无误后，点击播放按钮。Leginon 将执行同心聚焦并采集高倍图像，这些图像可在曝光节点中查看。检查下一张目标曝光图像，以确认设置是否合适。确认无误后，在曝光目标定位和孔目标定位设置中取消勾选“允许用户验证选定目标”。网格完成筛选后，单击“文件”，然后选择“退出”以关闭 Leginon。要设置 Smart Leginon Autoscreen，请运行 smartlegenionautoscreen。在终端窗口中选择 GY，并输入以逗号分隔的网格槽位列表到屏幕。然后为工作流程输入 full。为新会话输入模板会话名称以及模板会话的 Z 轴高度值。将打开一个 GY 界面，用于输入会话名称并为每个网格选择项目关联。之后可让显微镜无人值守，或在 Leginon、Appion 及显微镜计算机上进行监控。

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Research

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